巯基的化学修饰
酶工程练习题及部分答案
酶工程练习题一、是非题（每题1分，共10分）1、酶是具有生物催化特性的特殊蛋白质。
（）2、酶的分类与命名的基础是酶的专一性。
（）3、酶活力是指在一定条件下酶所催化的反应速度，反应速度越大，意味着酶活力越高。
（）4、液体深层发酵是目前酶发酵生产的主要方式。
（）5、培养基中的碳源，其唯一作用是能够向细胞提供碳素化合物的营养物质。
（）6、膜分离过程中，膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒成分或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。
（）7、在酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅酶之间都是互配的分子对，在酶的亲和层析分离中，可把分子对中的任何一方作为固定相。
（）8、角叉菜胶也是一种凝胶，在酶工程中常用于凝胶层析分离纯化酶。
（）9、α－淀粉酶在一定条件下可使淀粉液化，但不称为糊精化酶。
（）10、酶法产生饴糖使用α－淀粉酶和葡萄糖异构酶协同作用。
（）11、共价结合法既可以用于酶的固定化又可以用于微生物细胞的固定化。
（╳）12、在用PEG做酶分子修饰剂时，为了避免多蛋白聚集，较少产物不均一性，多用单甲氧基PEG（mPEG）进行修饰。
（√）13、恒流搅拌罐反应器（CSTR）能使内含物充分混合，对催化剂的牢固性不高，故而可以使用于大部分固定化酶的生产。
（╳）14、流化床反应器具有固体、流体混合好的优点，应用前景广泛，但目前仅有很少的固定化酶细胞工艺用流化床反应器。
（√）二、填空题（每空1分，共28分）1、日本称为“酵素”的东西，中文称为__________,英文则为__________,是库尼（Kuhne）于1878年首先使用的。
其实它存在于生物体的__________与__________。
2、1926年，萨姆纳（Sumner）首先制得__________酶结晶，并指出__________是蛋白质。
他因这一杰出贡献，获1947年度诺贝尔化学奖。
3、目前我国广泛使用的高产糖比酶优良菌株菌号为__________,高产液化酶优良菌株菌号为___________。
巯基的化学修饰(医学课件)
修饰在药物研发中的应用
详细描述：通过研究二硫键的修饰过程及其与疾病的关 系，可以发现新的药物靶点，为新药的研发提供方向。
详细描述：在已知的药物中，针对二硫键的修饰过程进 行结构优化，可以提高药物的疗效和降低副作用。
• 发展新型巯基修饰技术：随着科学技术的发展，我们需要开发更为先进的巯基修饰技术，以满足各种不同的需 求。例如，利用光敏或酶促反应进行巯基修饰，可以实现高度特异性和高效率的修饰。
• 拓展巯基修饰的应用领域：目前巯基修饰的应用主要集中在药物传递、组织工程和生物材料等方面。未来，我 们期望能够看到巯基修饰在更多领域中的应用，如疾病诊断、基因治疗和纳米医学等。同时，我们也期望能够 看到更多的具有创新性的研究思路和方法出现，推动巯基修饰技术的发展和应用。
研究面临的挑战与未来发展方向
• 建立有效的巯基修饰方法：尽管已经有许多用于巯基修饰的方法，但它们往往存在一些问题，如反应条件剧烈 、对环境不友好等。因此，开发更为温和、高效且环保的巯基修饰方法仍然是一个挑战。
• 深入理解巯基修饰的生物效应：目前对于巯基修饰在生物医学领域的应用研究尚处于初级阶段，许多关键问题 仍需解决。例如，如何精确控制巯基修饰对生物分子的影响，以及如何评估这种影响对细胞和组织的功能和健 康的影响等。
详细描述
在新型药物的研发过程中，通过调节巯基修 饰的表达水平，可以开发出具有全新作用机 制的药物，为治疗多种疾病提供了新的选择 。经过实验验证，这种新型药物具有较高的 疗效和较低的副作用，具有很好的应用前景 。
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06
相关案例分析或研究报告
案例一：某疾病中巯基修饰的异常及其意义
利用蛋白上巯基的定点偶联-概述说明以及解释
利用蛋白上巯基的定点偶联-概述说明以及解释1.引言1.1 概述蛋白上的巯基是一种常见的功能基团，具有独特的化学性质和反应活性。
定点偶联技术是一种利用这种巯基与其他物质进行化学反应的方法，可以实现对蛋白分子的特定部位进行修饰和功能化。
通过巯基的化学反应，可以引入各种化学团或功能性分子到蛋白分子上，从而拓展其应用领域和性能。
蛋白上的巯基具有较高的亲电性和亲核性，可以与多种化合物发生特异性的反应。
其中最常用的反应是巯基与硫醇或烯烃发生加成反应，形成二硫键或硫醚键。
此外，巯基还可以与含有卤素、醛基、酰基等官能团的化合物进行亲电取代反应，实现定点修饰。
定点偶联技术已成为生物化学、蛋白工程和生物医学领域的重要研究手段。
通过在蛋白分子上选择性引入巯基，可以实现对多个位置的修饰，包括特定的氨基酸残基如半胱氨酸，以及特定的功能区域如活性中心或结合位点。
通过对巯基的定点偶联反应，可以实现蛋白-蛋白相互作用的调控、功能模块的组装、新型蛋白药物的设计等应用。
然而，利用蛋白上的巯基进行定点偶联也面临一些挑战。
首先，巯基的反应活性较高，对环境条件如溶剂、温度、pH值等要求较高。
其次，巯基引入的位置需要精确控制，以避免对蛋白的结构和功能产生不可逆的影响。
此外，与巯基反应的官能团在生理条件下的稳定性也需要考虑。
尽管存在挑战，定点偶联技术在蛋白工程和生物医学领域具有广阔的应用前景。
通过利用蛋白上巯基的定点偶联，可以构建具有特定功能和活性的蛋白分子，推动蛋白结构和功能的研究进展。
随着合成生物学和化学生物学领域的不断发展，相信定点偶联技术将为蛋白研究和应用带来更多新的突破。
1.2文章结构文章结构部分的内容可以是：本文分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分将概述蛋白上巯基的定点偶联以及定点偶联技术的原理，并介绍文章的目的。
首先简要介绍蛋白上巯基的特性，包括其在生物学中的重要性以及其在蛋白质结构和功能中的作用。
然后将介绍定点偶联技术的原理，包括该技术如何通过结构化设计和化学修饰使蛋白中的巯基具有特异性和高效的反应活性。
硫化氢介导的s-巯基化修饰及其化学检测技术
硫化氢介导的s-巯基化修饰及其化学检测技
术
硫化氢（H2S）是一种重要的生物活性分子，具有多种生理和病
理功能。
为了研究硫化氢的生物学效应和机制，人们通常通过巯基化
修饰的方法来检测和定量硫化氢。
巯基是一种含有硫原子的官能团，
与硫化氢具有较高的亲和力和反应性。
因此，通过巯基化修饰可以有
效地捕捉和检测硫化氢。
巯基化修饰主要使用的试剂是巯基化剂，比如二巯基化合物二巯
基（双）硫（DMS、DTNB）等。
这些试剂与硫化氢反应后，可以形成具
有强烈吸收的溶液，可以使用光谱技术（如紫外-可见光谱和近红外光谱）进行检测和量化。
另外还可以使用高效液相色谱（HPLC）等技术
来分离和检测硫化氢及其巯基化产物。
巯基化修饰不仅可以用于检测硫化氢的浓度，还可以用于研究其
在生物体内的生成和代谢。
巯基化修饰方法已被广泛应用于生物学、
药理学和医学领域的研究中，为了进一步提高检测的灵敏度和特异性，人们也在不断开发和改进新的巯基化试剂和分析方法。
总之，通过巯基化修饰和化学检测技术，可以有效地捕捉和测量
硫化氢。
这些方法为研究硫化氢的生物学作用和疾病机制提供了有效
的工具，有助于深入理解硫化氢在生命过程中的重要作用。
蛋白质分子生物学复习重点
蛋白质分子生物学复习重点一.什么是蛋白质的化学修饰？影响蛋白质化学修饰反应性的因素有哪些？答:从广义上说，凡是通过化学基团的引入或除去，而使蛋白质共价结构发生改变，都可称为蛋白质的化学修饰。
影响蛋白质化学修饰反应进程的因素：1.蛋白质功能基的反应性；2.修饰剂的反应性。
蛋白质功能基反应性的影响因素:1.微区的极性，2.氢键效应，3.静电效应，4.空间障碍(位阻效应)；此外，其它因素也能改变蛋白质功能基反应性，如电荷转移、共价键形成、金属螯合、旋转自由度等。
蛋白质功能基的超反应性：超反应性是指蛋白质的某个侧链基团与个别试剂能发生非常迅速的反应。
影响因素：1.改变蛋白质功能基的pK a值；2.蛋白质功能基具有较大的亲核性；3.通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当的取向；4.试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体化学适应性；5.试剂的结合。
修饰剂反应性的决定因素:1.选择性吸附，2.静电相互作用，3.位阻因素，4.催化因素，5.局部环境的极性。
二.蛋白质有哪些侧链可被化学修饰？答：蛋白质侧链的修饰主要是通过选择性的试剂或亲和标记试剂与蛋白质侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的，其重要作用是用于探测活性部位的结构。
在20种常见AA残基中，仅具极性的侧链基团才能够进行化学修饰，这些基团的反应性取决于其亲核性。
1.巯基的化学修饰：常用的修饰剂有：烷基化试剂特别是碘乙酸和碘乙酰胺是很重要的-SH 修饰剂；N-乙基马来酰亚胺的修饰反应具较强的专一性，与SH形成对酸稳定的衍生物；有机汞试剂是最早使用的-SH修饰剂之一，其中最常用的是对氯汞苯甲酸；-SH的氧化也是一种专一性很高的化学修饰手段，H2O2一般用于氧化-SH形成-S-S-或在较大量时形成磺酸，也可以生成次磺酸；5,5’-二硫-2-硝基苯甲酸(DTNB), 又称Ellman试剂，目前已成为最常用的巯基修饰剂。
2.氨基的化学修饰：氨基的修饰可分为三类：引入正电荷的修饰；电荷消失的修饰；引入负电荷的修饰。
巯基的化学修饰
案例二：巯基修饰在材料科学中的应用
总结词
巯基修饰在材料科学中可用于合成高分子 材料、制备纳米材料和改善材料的物理化 学性质。
VS
详细描述
巯基修饰可用于合成含有硫醇基团的高分 子材料，这些材料具有优异的热稳定性、 机械性能和化学反应活性。此外，巯基修 饰还可以用于制备纳米材料，如金纳米颗 粒和量子点，具有潜在的光电应用价值。 另外，巯基修饰还可以改善材料的物理化 学性质，如表面润湿性和生物相容性。
02
巯基的化学修饰技术
硫醇的氧化反应
01
氧化剂
常用的氧化剂包括过氧化物、臭氧、高锰酸钾等，可以将硫醇氧化为
相应的酮或醛类化合物。
02
反应条件
氧化反应通常需要在一定的酸碱条件下进行，同时需要控制反应温度
和时间，以免过度氧化或副反应发生。
03
应用
硫醇的氧化反应在药物合成、生物活性分子合成等领域有广泛的应用
。
硫醇的还原反应
还原剂
常用的还原剂包括金属氢化物、有机酸、无机酸等，可以将硫 醇还原为相应的醇类化合物。
反应条件
还原反应通常需要在一定的酸碱条件下进行，同时需要控制反 应温度和时间，以免过度还原或副反应发生。
应用
硫醇的还原反应在药物合成、材料合成等领域有广泛的应用。
硫醇的取代反应
取代试剂
常用的取代试剂包括卤代物、硫酸酯、磺酸酯等，可以 在硫醇的巯基上发生取代反应。
挑战与瓶颈
1 2
修饰位点选择的精确控制
在巯基修饰过程中，如何实现精确控制修饰位 点的选择是一个亟待解决的问题。
修饰反应的效率与特异性
提高修饰反应的效率和特异性，是巯基修饰中 需要解决的另一个关键问题。
酶工程酶分子侧链基团的化学修饰
一．特定氨基酸残基侧链基团的 化学修饰
• 酶分子中经常被修饰的氨基酸残基 侧链基团有：巯基，氨基，羧基， 咪唑基，酚基，胍基，吲哚基，硫 醚基及二硫键等。
1．巯基的化学修饰
• 巯基具有很强的亲核性，采用巯基化学修饰 剂与酶蛋 白侧链上的巯基结合，使巯基发生改变，从而改变酶 的空间构象、特性和功能。
• ①烷基化试剂 烷基试剂中用得最多的是碘乙酸，碘乙酰胺, 巯基乙醇，谷胱甘肽(GSH)。
→ E—SH + ICH2COOH(或ICH2CONH2) E—S—CH2COOH(或E—
S—CH2CONH2)+HI ②汞试剂 这类试剂如HgCl2，对氯汞苯甲酸(p二酮
二羰基化合物 1，2－环己二酮
苯乙二醛
几种重要的修饰反应 1．烷基化反应
2．酰化及其相关反应
3．氧化和还原反应
4．芳香环取代反应
• 重要的修饰反应*
酰化及其相关反应 烷基化反应 氧化和还原反应 芳香环取代反应
• 特定氨基酸残基 侧链基团的化学 修饰*
巯基的化学修饰 氨基的化学修饰 羧基的化学修饰 咪唑基的化学修饰 胍基的化学修饰 二硫基的化学修饰
4．咪唑基的化学修饰
常用修饰剂：碘乙酸、 焦碳酸二乙酯等； 其中焦碳酸二乙酯在近 中性的条件下对组氨酸 残基上的咪唑基具有较 好的特异修饰能力，而 且产物在240 nm波长处 有最大吸收峰，可以通 过修饰得知分子中咪唑 基的数量。
5. 胍基的化学修饰
来源：Arg 修饰反应：本质上是羰基对氨基酰基化。 修饰剂：
①乙酸酐修饰 ②2,4,6—三硝基苯磺酸修饰. ③2,4—二硝基氟苯修饰(Sanger 反应) ④氨基的烷基化.这类试剂包括 卤代乙酸,芳香卤和芳香磺酸等. ⑤丹磺酰氯(DNS)修饰. ⑥苯异硫氰酸酯(PITC)修饰(即 Edman反应)
巯基
巯基巯的字和音均由氢硫二字拼合而成。
带有巯基的化合物最常见的是半胱氨酸HOOC-CH（NH2）-CH2-SH、谷胱甘肽G-SH以及含半胱氨酸残基的各种蛋白质。
1基本介绍巯基又称氢硫基。
是由一个硫原子和一个氢原子相连组成的一价原子团，结构式为：—SH巯基是硫醇（R—SH）、硫酚（Ph—SH）、硫代羧酸（硫羟羧酸，或俗称硫赶羧酸）分子中的官能团。
2结构介绍由氢和硫两种原子组成的一价原子团。
也叫氢硫基。
巯的字和音均由氢硫二字拼合而成。
带有巯基的化合物最常见的是半胱氨酸HOOC-CH（NH2）-CH2-SH、谷胱甘肽G-SH 以及含半胱氨酸残基的各种蛋白质。
两个半胱氨酸的两个巯基可以脱氢氧化为胱氨酸而在分子中形成-S-S-结构，-S-S-称为二硫键（二硫桥），二硫键是巯基的氧化形式，二硫键可加氢再还原为巯基。
谷胱甘肽、巯基蛋白及巯基酶的活性基团是巯基，通过巯基参与反应。
3检测方法1. RP-HPLC法测定巯基含量采用色谱柱Kromasil-C18 (250×4.6mm, 5μm)，流动相A(0.1%TFA)和流动相B（甲醇）梯度洗脱：流动相B 40%~80%，0~10min，然后80% B保持5min，流速0.8mL/mi n，检测波长327nm，得到NTB标准曲线y=3.67059x+0.14123，回收率101.9%，RSD=l. 17%，从而建立了一种高灵敏度巯基检测方法。
2. 采用分子荧光光谱法作为反应条件，用反相高效液相色谱梯度洗脱法测定巯基用OPA、丹酰氯、茚三酮与半胱氨酸反应，测其可见紫外吸收光谱及荧光光谱；在不同PH、温度、反应时间条件下，用OPA与半胱氨酸反应测其荧光度；分别吸收0.1mmol/ L半胱氨酸溶液0、20、40、60、80、100 μl，各加入10 μlH2O2,室温下反应30min，然后加热蒸干，残渣用200μl OPA衍生液，定容至5 ml，4 min时测其荧光光谱。
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随机突变
▪ DNA shuffling技术
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第二章蛋白质修饰
内容
▪ 酶蛋白的化学修饰 ▪ 酶蛋白化学修饰的应用 ▪ 蛋白质改造的分子生物学途径
酶蛋白的化学修饰
▪ 酶蛋白侧链的修饰 ▪ 酶蛋白的亲和修饰 ▪ 酶的化学交联
酶蛋白侧链的修饰
▪ 羧基的化学修饰 ▪ 氨基的化学修饰 ▪ 精氨酸胍基的化学修饰 ▪ 巯基的化学修饰 ▪ 组氨酸咪唑基的化学修饰
羧基的化学修饰
▪ 水溶性的碳二亚胺是特异修饰酶的 COOH，也是最普遍的标准方法
▪ 羧基的甲酯化
氨基的化学修饰
▪ ε－NH2具有亲核性 ▪ 烷基化： 修饰剂有：卤代乙酸、芳基卤
（DNFB)、芳香族磺酸（TNBS） ▪ 烷基化：与醛酮还原烷基化 ▪ 蛋白质序列分析中的 DNS
精氨酸胍基的修饰
▪ 与DTNB,Ellman试剂反应生成二硫键 ▪ 有机汞试剂专一性强，产物在250nm处有
最大吸收
巯基的化学修饰
巯基的化学修饰
组氨酸咪唑基的修饰
▪ DPC在中性pH下有专一性，产物在 240nm处有最大吸收
▪ 碘代乙酸可修饰不同的N原子
组氨酸咪唑基的修饰
色氨酸的吲哚基
▪ NBS可修饰吲哚基，但酪氨酸干扰 ▪ HNBB，KoshlandⅠ专一水溶性差 ▪ 4－硝基苯硫氯, KoshlandⅡ专一性强 ▪ 注意修饰时对巯基保护
酶的表面化学修饰－大分子修饰
▪ 可溶性大分子可通过共价键连于蛋白 质表面，形成覆盖层
▪ PEG, PVP,PAA,葡聚糖，环糊精，CMC， 肝素等
▪ 分子量500－20000u的PEG，是两亲分 子，具有生物相容性
聚乙二醇修饰蛋白质
▪ PEG 修饰时多采用单甲氧基聚乙二醇
聚乙二醇修饰蛋白质
▪ 例：聚乙二醇修饰的L-天冬酰胺酶降 低甚至消除酶的抗原性，提高了抗蛋 白质水解的能力，延长体内半衰期， 提高药效
最常用的交联剂
酶蛋白化学修饰的应用
▪ 酶蛋白修饰的研究历史
▪ 五十年代，主要研究酶的结构和功能 的关系
▪ 七十年代，人为改变天然酶的某些性 质，创造天然酶所不具备的优良特性， 甚至创造新的活性
酶蛋白化学修饰的应用
▪ 酶经过修饰，会产生的变化： 提高生物活性 增强在不良环境中的稳定性 针对特异性反应降低生物识别能力解除 免疫原性 产生新的催化能力
在结构与ห้องสมุดไป่ตู้能研究中的应用
▪ 研究酶空间结构 ▪ 确定氨基酸残基的功能 ▪ 测定酶分子中某种氨基酸的数量
在医药和生物技术中的应用
▪ 问题的提出：
▪ 医药方面：异体蛋白质的抗原性受蛋白 质水解酶水解和抑制作用，在体内半衰 期短、稳定性差、不能在靶部位聚集， 不在最适pH值，影响使用效果
▪ 生物技术领域：工业用酶遇酸、碱、有 机溶剂变性、不耐热、易受产物和抑制 剂抑制。
▪ 亲和试剂专一性标记在酶的活性部位， 使酶不可逆失活，也称专一性抑制剂。
亲和标记
蛋白质的化学交联
▪ 化学交联是一类重要的化学修饰
▪ 交联剂是具有两个反应活性部位的双 功能基团可以在相隔较近的两个氨基 酸残基之间，或蛋白质与其他分子之 间发生交联反应。
▪ 交联剂种类繁多，在长度、氨基酸专 一性、交联速度和交联效率不同。
色氨酸的吲哚基
酶的亲和修饰
▪ 亲和标记 酶的侧链的化学修饰存在着多个同 类残基与修饰剂反应的问题，对某 个残基的选择性修饰较困难，因此 开发了亲和标记试剂。
亲和标记
▪ 酶的位点专一性修饰时根据酶和底物的 亲和性，修饰剂不仅具有对作用基团的 专一性，而且具有被作用部位的专一性。 这类化学修饰称为亲和标记，这类修饰 剂称为位点专一性抑制剂。
▪ L-asparaginase (EC.3.5.1.1) 抗肿瘤
▪ FDA批准的Oncaspar1994年在美国上 市，为L-天冬酰胺的PEG螯合物
蛋白质改造的分子生物学途径
▪ 基因突变技术：通过在基因水平上对其 编码的蛋白质分子进行改造，在其表达 后研究蛋白质功能的一种方法
▪ 分两类：位点特异性突变和随机突变
位点特异性突变
▪ 通过寡核苷酸介导的基因突变 ▪ 盒式突变或片段取代突变 ▪ 利用聚合酶链反应（PCR）,以双链
DNA为模板进行的基因突变
寡核苷酸介导的基因突变
▪ 是在含有突变序列的寡核苷引物介导下 进行的
▪ 几种方法： 基于抗生素抗性回复的突变方法 基于去除特定限制酶切位点的突变 利用PCR产生定点突变
▪ 修饰剂具有两个邻位羰基的化合物 例：丁二酮，1，2－环己二酮
精氨酸胍基的修饰
巯基的化学修饰
▪ 巯基具有很强的亲核性 ▪ 烷基化:基于碘乙酸的荧光试剂
Enzyme-SH + ICH2COOH Enzyme-S-CH2COOH
巯基的化学修饰
▪ N－乙基马来酰亚胺是专一性强的修饰剂， 产物在300nm有最大吸收