化学发光免疫分析的基本原理及其技术类型

作为化学发光免疫技术的化学发光剂应符合以下几个条 件：
发光的量子产率高 物理-化学特性要与被标记或测定的物质相匹配 能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物 其化学发光常是氧化反应的结果 在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性
常用的化学发光剂或发光底物有 1.直接化学发光剂 2.酶促反应的发光底物 3.电化学发光剂
化学发光免疫分析双抗体夹心法原理示意图
二、方法类型
1.分离方法 常用磁颗粒分离技术，即用抗原或抗体包被磁颗粒 ，与标本中相应抗体或抗原及吖啶酯标记的抗体或 抗原通过一定模式的免疫学反应后,最终通过在磁场 中冲洗将结合到免疫复合物中的标记物和游离标记物 进行分离的技术。
2.常用的免疫学反应模式
双抗体夹心法 双抗原夹心法 固相抗原竞争法
一个电子而发生氧化反应。
第二节 化学发光免疫分析
一、 检测原理
用化学发光剂（如吖啶酯）直接标记抗体(抗原)，与 待测标本中相应的抗原(抗体)和磁颗粒性的抗体 （抗原）发生免疫反应后，通过磁场把结合状态 （沉淀部分）和游离状态的化学发光剂标记物分离 开来，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱 性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发 光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内 所产生的光子能，可从标准曲线上计算出待测抗原 (抗体)的含量
碱性磷酸酶化学发光酶免疫分析双抗体夹心法原理示意图
二、方法类型
1.根据标记酶不同分类 可分为辣根过氧化物 酶标记的化学发光酶免疫分析和碱性磷酸 酶标记的化学发光酶免疫分析。前者常以 鲁米诺或其衍生物作为发光底物，后者常 以AMPPD作为发光底物。 2. 根据免疫学反应模式分类 同化学发光 免疫分析，主要有双抗体夹心法、双抗原 夹心法和固相抗原竞争法等主要模式，所 不同只是相应抗原或抗体上标记的是酶而 不是直接标记发光剂。
2.酶促反应的发光底物
是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光。 目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧 化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）。HRP的常用 的发光底物为鲁米诺或其衍生物，ALP的发光底物 为金刚烷（AMPPD）
（1）鲁米诺或其衍生物
鲁米诺在碱性条件下可被一些氧化剂氧化，发生化 学发光反应，辐射出最大发射波长为425nm的光。
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前言
• 化学发光免疫技术是将具有高灵敏度的化学发光 测定技术与高特异性的抗原抗体反应相结合，用 于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸 、维生素和药物等的检测分析技术。该技术具有 特异性高、灵敏度高、分离简便、 快速、试剂无 毒、安全稳定、可自动化分析等特点，在免疫学 检验中应用广泛。
本章要点
1. 化学发光剂的概念及常用的化学发光剂。 2. 化学发光免疫分析的基本原理及其技术类 型。 3. 化学发光酶免疫分析基本原理及其分离技 术。 4. 电化学发光免疫分析基本原理。 5. 化学发光免疫技术的临床应用。
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目录
1 基本知识 2 化学发光免疫分析 3 化学发光酶免疫分析 4 电化学发光免疫分析 5 化学发光免疫技术的临床应用
1.直接化学发光剂
在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直 接参与发光反应，它们在化学结构上有产生 发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。 如常用的吖啶酯（acridinium，AE） 。
吖啶酯在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长 为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发
态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。
3.化学发光
某些物质(发光剂)在化学反应时，吸收了反应 过程中所产生的化学能，使反应的产物分子 或中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电 子从激发态回复到基态时，以发射光子的形 式释放出能量，这一现象称为化学发光。
一个化学反应要产生化学发光现象，必须满足以下条件：
①该反应必须提供足够的激发能, 并由某一步骤单 独提供, 因为前一步反应释放的能量将因振动弛豫 消失在溶液中而不能发光
标记免疫技术
放
酶
射
免
免
疫
疫
技
技
术
术
化
荧
金
学
光
免
发
免
疫
光
疫
技
免
技
术
疫
术
技
术
第一节 基本知识
一、发光
发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由低能级 的基态跃迁到高能级的激发态，然后再返回到基态， 释放出的能量表现为光的发射。根据形成激发态的激 发能不同可将发光分为光照发光、生物发光和化学发 光。
1.光照发光（photoluminescence）
②要有有利的反应过程, 使化学反应的能量至少能被 一种物质所接受并生成激发态
③激发态分子必须具有一定的化学发光量子效率释放 出光子, 或者能够转移它的能量给另一个分子使之进 入激发态并释放出光子
二.化学发光剂
在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形 式释放能量的化合物称为化学发光剂或发光底物。
鲁米诺增强发光反应原理
（2）AMPPD
〔3-(2‘-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯1,2-二氧杂环丁烷〕〕
3．电化学发光剂
电化学发光剂是指通过在电极表面进行电化学反应而发 光的物质。如化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+和 电子供体三丙胺（TPA）在阳性电极表面可同时失去
三、技术要点
抗原抗体结合反应
结合物与游离物的分离 (磁颗源自文库分离技术)
化学发光反应
第三节 化学发光酶免疫分析
一、 检测原理
化学发光酶免疫分析（CLEIA）是用参与催化某一化学 发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸 酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的 抗体(抗原)发生免疫反应后，经洗涤将结合物与游离 的酶标物分离后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解 底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光 信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算 机数据处理系统，计算出测定物的浓度。
发光剂（荧光素）经短波长入射光照射后 进入激发态，当回复至基态时发出较长 波长的可见光。
2.生物发光（bioluminescence）
发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底 物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用ATP产 能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余 的能量以光子的形式释放出来。