海洋中寡营养细菌的分离培养技术及环境适应机制的研究进展

目录

1. 摘要 (1)

2. 前言 (1)

3. 寡营养细菌生态分布 (1)

3.1 寡营养细菌在海洋中的分布 (1)

3.2 寡营养细菌在淡水中的分布 (2)

3.3 寡营养细菌在土壤中的分布 (2)

4. 海洋中微生物的研究概况、现状及发展前景 (2)

4.1海洋微生物的研究概况 (2)

4.2 海洋微生物的现状 (3)

4.3海洋微生物的研究发展前景 (3)

5. 海洋中寡营养细菌的分离纯化 (4)

5.1 传统分离纯化及培养办法........................................... 错误！未定义书签。

5.2 新型的分离培养纯化及培养办法................................. 错误！未定义书签。

6. 寡细菌的适应机制................................................................. 错误！未定义书签。

6.1形态变化.......................................................................... 错误！未定义书签。

6.2附着机制 (6)

6.3能量储存.......................................................................... 错误！未定义书签。

6.4抵抗性增强 (8)

7.总结和展望 (9)

参考文献 (10)

海洋中寡营养细菌的分离培养技术及环境适应机制的研究进展

1.摘要：寡营养细菌的分离、培养及鉴定较困难，并且生长慢，研究周期长，所以在较长一段时间内其研究进展缓慢，但近几年随着生物技术的快速发展及广泛应用，寡营养细菌在生态中的分布及其生态作用引起了生态学家和环境学家的广泛关注，寡营养细菌在生态、环境、能源、公共卫生等领域中的重要性已受到人们重视[3-8]。本文将从寡细菌的分布、分离培养、及环境适应机制等几方面对现有寡细菌的研究做出介绍。

2.前言：

寡营养细菌(Oligotrophic bacteria)又称贫营养细菌，是指在寡营养生态环境(如远洋、深海、贫瘠土壤等环境)中生存并定义为第一次培养时能在含碳1～15 mg／L培养基中生长的一类细菌[1]。它们又被分为两类：如不能在富营养培养基上生长，称为专性寡营养（oligate oligotrophic），既能在富营养培养基又能在贫营养培养基上生长被称为兼性寡营养（facultative oligotrophic）。由于还存在一类微生物只能生长在营养丰富的环境中,为了与寡营养微生物有所区别,Poindexte提出了“富营养细菌”(copiotrophicor)一词,指的是能发酵碳水化合物的细菌[2]。寡营养细菌主要生长在有机质贫乏的极端环境中，寡营养细菌生态分布很广,构成了生物圈的大部分,在生物地球化学循环中起关键作用。

根据寡营养细菌的培养性可以将其大致划分为4种类型:(1)仅在初次分离时能在营养贫乏的培养基上培养的细菌;(2)初次分离时能在营养贫乏的培养基上培养,然后也能在营养丰富的培养基上培养的细菌;(3)仅在特殊的营养贫乏培养基上生长的细菌;(4)在实验室尚不能培养,但在电子显微镜下能观察到的细菌。

3 寡营养细菌的生态分布

3.1 海洋：在自然界中,绝大多数自然环境都是以贫营养为特征的。浩瀚海洋占地球表面积的71%,研究表明，海水中可溶性有机碳浓度为0.35～70mg／L，颗粒性有机碳浓度为3～10mg／L，有机碳的平均水平相当低，但自然环境中低浓度的

有机碳却可以被海洋细菌所利用。二十余年前，已有学者从海水中分离培养出寡营养细菌[11-12]，在低营养的海湾水域中分离到的细菌主要包括鞘细菌、弧菌、生丝微菌、假单胞菌、捧状杆菌等，在低营养海洋生态系统中还存在大量所谓滤过性细菌。其中鞘氨醇单胞菌(Sphingopyxis alaskensis)作为海洋贫营养细菌的典型代表,己作为模式菌株对其展开了广泛的研究[13]。在低温条件下也存在贫营养细菌。Slbaova首次发现肾形杆菌(Renobaceter)、甲基杆菌(Mehytolbacetrium)、新月柄杆菌(Cacuolbacter cesrecnut)等5株贫营养细菌能长期生存在-2°C的低温环境中[14]。

3．2 淡水：通常所指的低营养淡水环境的范围包括江、河、湖泊、水库，甚至蒸馏水。研究表明，湖泊河水、地下水、缺乏有机质的饮用水、甚至蒸馏水等环境中都可分离出寡营养细菌[15-18]。目前，人们对相对静止的湖泊的研究较为详尽，研究结果表明释放到水体中的有机杂质含量在湖泊生态系统总光合强度的10—4O%间波动。富营养湖的光合强度可达3—5mg碳/L，而寡营养湖不超过0．1mg 碳/L[19]。假单胞菌、柄细菌、鞘细菌、微环菌等已在寡营养湖中分离出来，甚至在蒸馏水中也分离到鞘细菌。

3．3 土壤：一系列研究数据表明，土壤也是微生物生长的寡营养环境。到目前为止,人们已经分别从土壤、沙表土中分离培养出寡营养细菌[20-23],土壤中大部分细菌群落处于休眠状态，只有少部分能获得足够的能量以供生长；即使在适宜环境条件下也只有l5—3O%的细菌群落是活跃的。柄细菌、生丝敢菌节杆菌等部分土壤细菌显示寡营养细菌的特征。在低营养环境中不仅存在原核生物,也有真核生物的存在。Kimura的研究小组从土壤中分离到7株隐球酵母(Cryptococcaceae),它们也能长期耐受低营养的环境[24]。

4 海洋中微生物的研究概况、现状和发展前景

4.1海洋微生物的研究概况：目前，海洋中微生物的多样性研究已成为研究的热点。微生物的多样性研究，不仅是微生物学进入新的发展时代,更是生物多样性科学发展的巨大进展,它在微生物的遗传研究、微生物新物种资源开发方面等都发挥着愈来愈大的作用[25-27]。最早对微生物多样性开展的研究是显微镜的发明

者列文虎克利用显微镜进行的,之后科赫建立了微生物的纯培养技术是微生物学发展的里程碑，但是这些传统观察、分离纯化技术具有明显的局限性,它们不可能全面而且准确的反映出海洋微生物的多样性和海洋中微生物生态系统的结构与功能。而现代分子生物学技术则打破了这种局限性,虽然应用分子生物学要求技术很高,但是它能全面反应遗传信息的差异性。目前微生物多样性的每个单一研究方法己经成熟,但是每一个单一方法都有本身的局限性。只有将不同研究方法进行组合优化,才能更全面更好的反应微生物群落本身的多样性信息,目前综合的微生物多样性研究并未成熟[28]。现代分子生物学分析微生物多样性的方法主要有:核酸的探针杂交技术、16SrDNA克隆文库方法、DGGE等基因指纹技术等[29],目前最常用的技术有:变性梯度凝胶电泳(DGGE)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、限制片段多态性分析(RFLP)、荧光原位杂交(FISH)、16SrDNA克隆文库等。变性梯度凝胶电泳:相同长度的DNA片段因为其碱基序列组成不同决定了它的解链区域和解链温度不同。而DGGE胶则是加了变性剂(尿素和甲酞胺)形成变性梯度的聚丙烯酞胺凝胶,变性剂浓度逐渐增加,当DNA迁移到最低解链区域所需变性剂浓度时该区DNA域解链,DNA迁移率降低,因此不同序列的DNA片段出现了不同带型。温度梯度凝胶电泳:是DGGE的衍生技术,所不同的是,DGGE所用的是变性梯度,而TGGE 用的则是温度梯度,当DNA片段迁移到最低解链温度时同样会解链,形成不同的条带。限制片段多态性分析:即LP是最早发展的一项DNA标记技术,它是利用不同DNA 片段的限制性片段长度不同,从而用限制性内切酶切割分型。荧光原位杂交:设计核酸探针,将核酸探针与待检测DNA杂交经过变性一退火一复性,则探针会与同它是同源互补的序列形成靶DNA一核酸探针杂交体,将探针的某种核营酸做报告分子标记,则该报告分子会与荧光素标记了的特异亲和素发生免疫反应,经荧光检测体系可对待检测的DNA进行定性、定量或定位分析。16SrDNA克隆文库:提取样品中微生物基因组总DNA,扩增其16SrDNA全长片段,构建载体将目的片段克隆至细胞构建文库,对阳性克隆进行RFLP分析,分析其基因指纹图谱,对阳性克隆子分型,代表序列测序,从而获得文库多样性信息。通过对克隆文库的coverage C进行评价,评估构建的文库是否有足够容量以代表样品中微生物多样性。Coverage C 越大则文库容量越大越能反应样品中微生物群落组成。但随着文库容量增大,OTU 数目会随着增加,因此克隆文库coverage C不能达到100%。

4.2海洋微生物的研究现状：浩瀚海洋占地球表面积的71%,其中蕴藏着及其重要的微生物宝库。自从20世纪80年代,海洋生物技术兴起以来,世界各国均积极的对海洋微生物资源的发掘利用开展研究。目前,各国对海洋微生物资源的开发应用初见成效,其中美国遥遥领先,主要应用在:海洋活性物质药物、高端化学产品、环境保护、生物治理等方面,例如劳伦斯·利弗莫尔用海藻研制出“海胶”,该材料属于可降解产品将来有望替代聚苯乙烯。而日本则致力于:生物活性物质开发、生物磁学、食品添加剂、表面活性剂等的研究应用。相对于较发达国家,我国的海洋微生物开发起步晚、技术不够成熟海水中微生物的纯化分离现状北极海洋微生物由于生存环境的特殊性生存竞争非常激烈,因而形成了不同于陆生微生物的强防御能力和强识别能力,这些独特的能力是产生新型物质的基础。然而,随着人类的进步,海洋环境污染也日益严重,赤潮等现象屡屡发生,海洋环保刻不容缓,积极分离培养保护海洋微生物的遗传资源成为当务之急。Jalmasch在太平洋深海底的火山口附近发现了一种氧化硫细菌,该细菌是初级生产者。Jose从海底分离出一株玫瑰杆菌属(Roseobacter)的细菌,它具有转化硫化物功能。我国目前己经建立了专门针对微生物菌种保藏的微生物菌种保存库,用以收集和保藏各种菌株以保护各地宝贵的微生物遗传资源。

4.3海洋微生物研究的发展前景在海水中微生物从表层到深海污泥分布广泛,微生物多样性非常丰富,而且生物含量巨大。微生物在人们对医药开发、保健品开发、环境保护等方面具有重要意义,而且它们还是海洋中的初级生产者,是海洋生态系统的重要组成部分。

5 海洋中寡营养细菌的分离纯化培养

5.1传统分离纯化培养方法：微生物的纯化培养是指从复杂的生存环境中将一种细胞传代培养,从而得到单一的后代。科赫建立的微生物的纯化培养技术是微生物学发展的里程碑。传统的微生物分离方法是采用标准的实验室培养方法,该方法用在分离作为早期生命活化石的寡营养细菌时效率显得低下,会丢失大部分宝贵的生物资源。后来研究发现,通过稀释培养法能从用传统培养方法已证明无菌的材料中分离出大量的专性和兼性寡营养细菌[30-31]。

传统的常用的技术主要有以下几种: ①平板划线分离法:在无菌操作台上,灼烧接种环待接种环不烫,用接种环挑取少量待分离样品,在无菌平板上分区划线,第一针划完后灼烧接种环,待接种环不烫后再划线,随着划线次数增加,微生物细胞将逐步分散,经过适宜条件培养后可得到纯化菌落。②稀释倒平板法:用无菌水将待分离样品做梯度稀释,取少量梯度稀释液分别与溶化并冷却的培养基混匀,倒平板,待平板凝固干燥后,适宜温度培养,便可在稀释梯度适宜的平板上得到单菌落。③单孢子或单细胞分离法:在显微镜下,用孢子分离器或者用特制的毛细血管取下单个孢子或者单个细胞,置于培养基中适宜条件培养。④利用选择性培养基分离法:不同微生物对化学试剂、抗生素等具有不同的抗性,利用微生物这种特性制选择性培养基,在培养基中添加某种微生物具有抗性而能够抑制其它微生物生长的试剂,以期获得目的菌株。

5.2 新的分离纯化培养方法：

5.2.1.原位培养技术

目前研究表明,海洋微生物大约有100万种, 在庞大的环境微生物库中,目前分离纯化出来的可培养微生物却不到海洋微生物种类总量的1%,能够在实验室成功分离培养的海洋微生物更少。据统计，可培养得到的微生物占环境微生物总量0.0001%～15%,海洋寡营养细菌更是难以分离纯化培养。可见传统的实验室微生物分离纯化培养技术存在着显而易见的局限性,针对难培养和不可培养微生物的培养,Kaeberlein提出了原位培养技术。Kaeberlein认为微生物自然生长环境无法模拟这与实验室培养条件有差别,这成为微生物在实验室条件下分离培养的关键。Kaeberlein设计了独特的小室原位培养法,从而获得一些运用经典方法无法培养的菌株[32]。

5.2.2灭绝稀释培养法

Button等提出了灭绝稀释培养法(Extinetiondilutioneulturingmethod)用以最大限度地分离海水中在数量上占优势的贫营养细菌:将海水样本进行一系列的稀释直到没有微生物细胞存在为止,然后将各稀释管分别培养,观察各管的微生物生长情况,再做进一步的分析。该方法目前被认为是分离水生贫营养细菌最有效的方法[33]。

5.2.3扩散箱培养法

Kaeberelni等设计了扩散箱培养法,用于分离不可培养的海洋微生物:在扩散箱子的底部装有用0.03um孔隙的聚碳酸醋膜,膜上面放上含有微生物(作为“合作”微生物)的琼脂,箱子顶部装有同样的聚碳酸酷膜,在顶膜与琼脂之间留有一薄层空间,该空间可充满海水。顶部和底部的膜都能与海水进行化学物质交换,但却限制细胞的移动[34]。

5.2.4高产量培养法

Stpehanie等对寡营养细菌分离后如何获得最大的寡营养细菌生物量进行探讨,设计了高产量培养方法(High Throughput Method),以供对不可培养的细菌进行培养、鉴定以及生理特性分析。其主要过程为:利用荧光显微镜对接种物直接计数，将接种物稀释成1-5个细胞/mL,按每孔1mL滴加到微量滴定板中，按要求的时间和条件进行培养，再从每个孔中取200uL培养物,分别排列在过滤膜上,染色,再将滤膜转到载玻片上,用荧光显微镜筛选呈阳性反应的培养物,供进一步分析[35]。

6. 寡营养细菌的适应机制

海洋微生物由于生存环境的特殊性生存竞争非常激烈,因而形成了不同于陆生微生物的强防御能力和强识别能力,这些独特的能力是产生新型物质的基础。寡营养细菌正是在这种特殊生存环境下形成了耐低温、耐饥饿、耐辐射等生理特性。寡营养细菌的适应机制主要包括以下几个方面：

6.1形态变化

寡营养环境中的细菌具有独特的饥饿生存适应方式,可以在很短时间内急剧减小其细胞体积和内源呼吸来减少营养需求。同时,由于基质浓度非常低,寡营养细菌不仅仅通过被动的扩散渗透和主动输运收集有用的基质,为了最大限度地收集基质,更加有效地捕捉有机物,寡营养细菌细胞的比表面积与体积之比都非常大。在形态上,它们可以变成长度达到正常繁殖体的几倍甚至几十倍。例如,有的贫营养细菌能够借助柄或丝状体,增加细胞面积,吸收有机物和低浓度的氮和磷。有研究表明,处于海洋环境的细菌在低营养环境条件下多呈球形,这样可以增加表面面积与体积的比值,提高吸收营养物质的能力。处于此状态的细菌因能

透过0.45um的滤膜而被称为滤过性细菌或超微型细菌。许多细菌处于此状态时丧失了在培养基上生长的能力，但仍保持活力，因而称为活的非可培养状态。6．2 附着效应

在分离培养细菌时已利用它的这一特性，尤其对于水生菌，如鞘细菌凭借其固着器或鞭毛轻易附着到物体表。在水一空气交界处，小分子的憎水性分子、大分子以几腐殖质容易聚集，细菌在表面生长具有一定优势，

如能利用固定到体表的脂肪酸以供生长。海洋细菌还可通过附着到海洋动物内脏和表面而受益。

寡营养微生物较少以游离状态存在,通常以生物膜的形式存在,寡营养生物膜是附着在固体表面的层状积聚体。生物膜的形成减少了外界寡营养环境和其他不利的生存环境对其中细菌的影响,是微生物适应贫营养环境的结果。在自然生态系统中,尤其在较低营养浓度的环境中,生物膜占生物总量的99%一99.9%。在自然界,河边、地下水层、湖泊岸边、水生植物与动物体表面等,都有生物膜的存在[36]。

6．3 能量存储

既然寡营养细菌能在自然环境中长期生存，并且对营养要求很低，因此一种自然的稳定的能量来源是它们所必需的。研究发现氢气、甲烷和一氧化碳这些气体在任何环境中都微量存在，因此极有可能被寡营养细菌用来作为能量储备，以对付其生存环境可能出现的营养物质缺乏。事实上，寡营养细菌具有显著的从大气中摄取营养物质的能力，以利用大气中的微量碳、氮凉来维持正常的生长。细菌在贫营养状态或者说营养受到限制的情况下,就会进入一种降低代谢活性的生理状态(休眠状态),使它们在不利的环境条件下能存活较长时间,或者诱导特殊代谢基因的表达以适应环境的变化。

首先，寡营养细菌对营养基质利用更充分。处于饥饿生存状态的细胞,由于能量缺乏,代谢机制的效率得到提高,因此对基质的利用效率提高。寡营养细菌采用的是K-生长战略,有较小的最大增值速度,即通过降低半饱和系数,尽可能多地吸收不同类型的基质。这种低的半饱和系数是微生物逐渐适应低营养环境的结果[37]。有人认为半饱和系数是由细胞膜传质过程控制的,当生物量与污染物比例发生变化时,细胞膜会调节外界营养物质进入细胞的速率或传输能力。尤其当生

物量较高,而营养物质相对缺乏时,细胞膜不得不强化其主动传输能力,因而增强细胞对基质的亲和力[38]。寡营养细菌细胞膜上不但有各种不同的专一性营养物质吸收系统,而且还具有同时吸收混合营养物质的转运系统,以保证营养物质的有效吸收。一种贫营养细菌通常能够吸收和利用几种甚至几十种不同类型的有机物,所以在营养比较贫乏的条件下,能够充分利用环境中的有机物。有的贫营养细菌还具有从大气中摄取营养物质的能力,以利用大气中微量的碳源和氮源来维持正常生长。对贫营养细菌营养动力学的研究表明,当环境中的碳浓度较低时,贫营养细菌的Km(米氏常数)值较富营养细菌低,因而贫营养细菌对碳的亲和力大于富营养细菌,这说明相对于富营养细菌,在低营养环境中的贫营养细菌具有较大的营养竞争优势。

其次，寡营养细菌代谢水平变低,繁殖速度变慢。细菌细胞的代谢最低水平是细胞的内源性代谢,即当缺乏外来可作为能源的物质时,细胞便利用内存的物质;而当细胞内贮存的物质陷入缺乏时,细胞便开始死亡,因此细胞的内源性代谢是受时间限制的。第二个水平是维持代谢,当有外源性物质存在时,细胞不进行生长而只是维持活性,这时的代谢称维持代谢,处在这种状态的细胞叫作非生长细胞或休息细胞。由于其在生理上表现为代谢低下,有潜在繁殖能力而不出现明显增殖,也称之为细菌的潜生体。因为没有生长,此时外来的能源和碳源物质(如葡萄糖)只用来供给细胞能量,而这些能量是消耗在维持细胞生命的各个过程。例如维持细胞活性、生物大分子(RNA和蛋白及细胞壁的多糖)的稳定再合成、细胞质的pH值和渗透压的调节、向细胞内的活性运输及其它方面。

6.4抗性增强

低营养环境中的细菌对除营养匾乏以外的其他不利环境也有相应的适应机能。与高营养基质生长的细菌相比,贫营养基质下生长的细菌具有较高的抗性。有关嗜肺军团菌L的研究已证明,在龙头水中培养出生长速度缓慢的细胞较在浓培养基中培养的生长速度快的活细胞对消毒剂更具有抗药性。生长于贫营养“自然生境”中的肺炎军团菌比营养琼脂中生长的细菌有6一9倍之多的抗性,无荚膜、有英膜的肺炎克雷伯式菌株在贫营养基质下生长对自由余氯的抗性分别增加了2倍、3倍。细菌的抗性还可能来自环境中的DNA。最新的研究发现,几乎所有的活细菌都可向环境主动分泌或因死亡裂解而释放DNA,这些遗传信息可被感受

态细菌(不利的生长条件是细菌形成感受态的重要生理基础)获得。如果细菌一旦获得合适的基因,它将有可能扩大环境中其所能利用的营养物质范围或获得抵抗生长抑制因子(如抗生素)的能力,从而能继续生存下去。此外,很多研究表明细菌的抗性也可能因为细菌附着于物体表面而增强,颗粒物质、器壁等的表面对附着于上的细菌有保护作用。

以上各种生理适应机制之间井不矛盾，寡营养细菌极可能采用多种机制联合来适应低营养境。能形成孢子或孢囊的细菌无疑又多了一条适应策略。此外，新的适应机制尚待阐明。

7.总结：

Button等提出了灭绝稀释培养法是分离水生贫营养细菌最有效的方法，可有效的检出水源中寡细菌的含量。寡营养细菌所有的耐低温、耐饥饿、耐辐射等生理特性也为人们对微生物的研究利用开辟了一个新的思路。

寡营养细菌有可能是早期地球环境中的主要微生物。寡营养细菌能否在此时繁衍,在漫长的进化过程中它们又是如何适应环境条件,通过解答这些问题,对于人们认识生物的进化生态学以及早期生物在地球环境有机化过程中的作用具有重要的理论意义。寡营养细菌生态分布很广,构成了生物圈的大部分,在生物地球化学循环中起关键作用。因此对寡营养细菌生态学特性的研究,可以加深人们对整个生物圈的多样性、生态系统结构组成及其物质循环和能量流动的再认识,进而促进极端环境生态学理论的丰富和发展。

近年来环境污染日益严重，寡细菌为环境污染的监测提供了新的思路。环境污染造成湖泊富营养化，寡细菌在相应的处于劣势，因此可以通过检测寡细菌的质和量可为环境污染评价提供综合参数。

参考文献

[1]Kuznetsov S I，Dubinia G A，Lapteva V A．Biology of oligotrophic bacteria．Ann Rev Microbiol，1979，33(3)：377—387

[2]Poindexter JS.oligotorPhy:Feast and famine existenee[J]. Adv Microbiol Ecol,1981,5(1):63一90

[3] Hattori R，Hattori T．Sensitivity to salts and organic compounds of

soil bacteria isolated on diluted media．J Gen Appl Microbiol，1980，26(1)：1—14

[4] Tada Y，Kobata T，Nakaoka C．A simple and easy method for the monitoring of environmental pollutants using oligotrophic bacte—ria．Lett Appl Microbiol，2001，32(1)：12—15

[5] Morita R Y．Bacteria in Oligotrophic Environments，Starvation—Survival Lifestyle．New York：Chapman&Hall．1997．10_一12

[6] Arthur L K．Oligotrophs and copiotrophs．Bioessays，2001，23(7)：657—661

[7] Stephanie A C．Stephen J G High-throughput methods for cultur—

ing microorganisms in very--low--untrient media yield diverse new marine isolates．Appl Environ Microbiol，2002，68(8)：3878—

3885

[8] Ravenschlag K，Sahm K，Amann R．Quantitative molecular analysis

of the microbial community in marine arctic sediments fsval—bard)．Appl Environ Microbiol，2001，67(1)：387—395

[9] Hattori R,Hattori T.Sensitivity to salts and organic compounds of soil bacteria isolated on diluted media[J]·Gen Appl Microbiol,1980,26(1):l-14 [10] Morita RY.Bacteria in OligotroPhic Environments,Stvaration一Suvrival Lifestyle[M].New York:ChaPman&Hall.1997.10-12

[11] Stahl DA,Key R,Flesher B.The Phylogeny of marine and fresh water caulobaeters reflects their habitat[J].J Bact,1992,174(4):2193-2198 [12] Fegatella F,Caviehcioli R.Physiological responses to starvation in the marine oligotrophic ultramicrobacterium Sphingomonas sp.strain RB2256[J]Appl Environ Micorbiol,2000,66(5):2037-2044

[13]Ostorwski M,Fegatella F,Wasinger V,Guihaus M,Corthals LG,Cavicehioli R.Cross-species identification of Proteins from Proteome Porfiles of the marine oligotorphic ultrmaierobaeterium,Sphingopyxis alaskensis[J].Proteomics,2004,4:1779-1788

[14] Slabova OI,Nikitin DI.Infiuence of the Incubation Temperature on the Reaction of OligotroPhic Baeteria to Stress[J].Mieorbiology,2004,73(6):650-653

[15] Copre WA,Jensen TE.An electron microscopic study of picoplanktonic organisms from a small lake[J].Micorbail Ecol,1992,24(2):181-197

[16]Sehaffter N,Zumstein J,Pxariaux A.Factors influeneing the bacteriologieal water quality in mountainous suarfce and groundwaters[J].Acta hydrohim hydtoboil,2004,32(3):225-234

[17] Jaeggi NE,Schmidt一Lorenz W.Baeterial flora in fresh and stagnant water in drinking water purification and in the drinking water distribution system[J].Zentralblalltt Hygiene

Umweltrmedizin,1990,190(2):217一235

[18] Faveor MS,Carson LA,Bond WW.Pseudomonas aeurginosa:Growth in distilled water from hospitals[J].Science,1971,173:836一838

[19] 王颖群,严共华.寡营养细菌[J].微生物学通报,1995,22(5):302一304

[20] Ohta H,Hattori T Oligotrophic baeteria on organic debris and plant roots in a paddy field soil[J]. Soil Biol Bioehem,1983,15(1):1一8 [21] Hattori T.Physiology of soil oilgotrophic bacteria[J].Miocrboil Sci,1984,1:102一104

[22] Whnag K,Hattori T.Oligotrophic bacteria from rendzina forest

soil[J].Anotnie van Leeuwenhoek,1988,54(1):19-36

[23] 王平,李阜棣,胡正嘉.小麦内根圈中几类微生物群体数量比较的研究[Jl.华中农业学报,1994,13(4):318一324

[24] Kimura Y,Nkanao Y,Fujita K,Miyabe S,Imasaka S,IshlkawaY,Sato

M.Isolation and characteristics of yeasts able to grow at low concentrations of nutrients[J].Yeast,1998,14:233-38

[25] Yan Z C,Dong X Z.The content ofmierobial diversity and a perspective on its application.Microbiology,2001,28(l):96一102.

[26] Liu G X,Ma X J,Chen T.Progress and significance of studies on

mieroorganisms in permafrost sediments.Joumal of Glaciology and Geocryology,2004,26(2):188-191.

[27]J iang J,Yang B L,Lu H K,et al.Research on the bioaetive substances ofmarine microorganisms.Joumal of Yunnan University(Natural ScienceEdition),2004,26(6A):91一95.

[28]Zhou J,Lei T.Review and prospects on methodology and affeeting faetors of soil mierobial diversity.Biodiversity Seienee,2007,153:306-311.

[29] Xing D F,Ren N Q,Wang A J.Application of fluoreseenee in situ hybridization FISH Inmicrobial ecology.Microbiology,2003,306:114一119 [30] Tada Y,https://www.360docs.net/doc/5617480.html,e of oligotroPhie baeteria for the biologieal monitoring of heavy metals[J].Appl Mierobiol,2000,881:154～160

[31] Zlatkin IV,Vishnevetskaia O,Nikitin DI.Some aspects of antibiotie resistance of oligotrophic baeteria[J].Antibiot Khimioter,1991,36(1):34一37.

[32] T.Kaeberlein,etal.Isolating“uncultivable”mieroouganisms inpure culture in a simulated natural environment[J].Scienee,2002,296:1127一1129.

[33] Button DK,Schut F,Quang P.Viability and isolation of marine baeteria by dilution culture:Theory,Porcedures and initial results[J]Appl Enviorn Microbiol,1993,59(1):881-891

[34] Kaeberlein T,Lewis K,Epstein

SS.Isolating“Uncultivable”,,microorganisms in pure culture in a simulated natural environment[J].Science,2002,296:1127-1129

[35] Stephanie AC,Stephen JG.High-throughput methods for culturing microorganisms in very-low-nutrient media yield diverse new marine isolates[J].Appl Environ Mierobiol,2002,68(8):3878一3885

[36]Sehwartz T,Hoffmann S,obst U.Formation and bacterial composition of young,natural biofilms obtained from public bank-filtered drinking water

systems [J].Wat Res,1998,32(9):2787-2797

[37]桑军强,王占生.BAF在微污染源水生物预处理中的应用 [J].中国给水排水,2003,19(2):21-23

[38]Ostorwski M,Fegatella F,WasingerV,Guihaus M,Corthals LG,Cavicehioli R.Cross-species identification of proteins from proteome profiles of the marine oligotrophic ultrmaierobaeterium,Sphingopyxis alaskensis[J].Proteomics,2004,4:1779-1788