真菌[1-3]-β-D-葡聚糖与革兰氏阴性菌脂多糖检测[专家学习]
血浆(1,3)-β-D-葡聚糖检测对血液病患者侵袭性真菌病的诊断价值
血浆(1，3)-β-D-葡聚糖检测对血液病患者侵袭性真菌病的诊断价值近年来，由于抗生素的广泛应用和免疫功能受损等因素，侵袭性真菌病（IFD）的患病率逐年增加，成为造成血液病患者死亡的主要原因之一。
IFD的诊断和治疗一直是临床医生面临的难题之一，因此研究新的诊断方法显得尤为重要。
近年来，人体内存在的某些营养物质在侵袭性真菌病的恶化过程中是否会发生变化成为了关注的焦点之一。
本文将对IFD的诊断方法进行探讨，并讨论血浆（1，3）-β-D-葡聚糖（BG）检测的诊断价值。
1. IFD的诊断方法IFD的诊断一直是临床医生面临的难题之一，传统的诊断方法主要依靠组织或体液样本的真菌培养和特异性染色，然而这些方法多存在着时间长、缺乏准确性等问题，且组织或体液样本的采集也存在操作难度大等问题。
近年来，有许多新的IFD诊断方法被提出，包括：血清（1，3）-β-D-葡聚糖测定方法（BDG）、侵袭性真菌PCR检测、CT及MRI等影像学方法。
其中，BDG作为一种新的IFD诊断方法，近几年受到了越来越多的关注。
2. BG的来源与代谢BG是葡萄糖多聚体的一种，是真菌细胞壁的重要成分，并且往往被认为是生物被攻击时真菌的一种关键源泉。
BG的来源主要包括真菌、植物和细胞。
BG在代谢中具有重要的功能，其中真菌体内的BG主要由酵母菌、念珠菌和曲霉菌产生。
3. 血浆（1，3）-β-D-葡聚糖（BG）检测BG在IFD患者的血液中含量较高，可以作为IFD诊断的一种指标。
研究表明，在IFD患者血液中BG阳性率明显高于健康人群。
BG检测采用碳水化合物的免疫测定原理。
BG检测的阳性判定通常根据本体经验和不同的测试平台。
例如，一个常用的测试平台BG test Miraclon电化学免疫测定法提供了与BG特异性抗原结合的硫酸盐酯酶标记物，将样品在金电极的表面余留。
结合的复合物可以被亚硝酸盐还原生成硫酸盐酯酶还原物。
硫酸盐酯酶还原物的电信号记录和与标准曲线的比较将被用于测量BG水平。
真菌(1-3)-β-D葡聚糖检测试剂盒 (化学发光免疫分析法)产品技术要求金山川
1.1包装规格：12人份/盒1.2主要组成成分：校准曲线：二维码。
质控范围批特异，详见标签。
2.1外观试剂盒完整无破损，试剂盒内各组分齐全、无破损、渗透；盒上印刷的标识以及瓶签、盒签上的字迹清晰完整，易识别。
2.2装量试剂盒的液体试剂净含量应不低于标示量。
2.3溯源性根据GB/T21415规定了校准曲线的溯源过程，溯源至企业工作校准品。
2.4准确度回收率应在80%～120%的范围内。
2.5检出限检出限应不高于40pg/mL。
2.6线性试剂盒在浓度为[50,50000]pg/mL的线性范围内，相关系数（r）应不低于0.9900。
2.7重复性测定高、低两个浓度水平的样本，测定结果的变异系数CV（％）值应不大于10%。
2.8特异性与浓度分别为50ng/mL的曲霉菌半乳甘露聚糖、念珠菌甘露聚糖、革兰阴性菌脂多糖均无交叉反应，检测结果均应不超过检出限。
2.9批间差用3个不同批号的试剂盒分别检测两个浓度水平的样本，3个批次试剂盒之间的批间变异系数CV（％）应不大于15％。
2.10质控品赋值有效性重复测定试剂盒内质控品各3次，每次测定结果均应在质控品测定值允许的范围内。
2.11质控品批内瓶间差取同一批号10支质控冻干品进行检测，所有瓶内重复性检测结果的变异系数CV（%）值应不大于10%。
2.12稳定性2.12.1效期稳定性试剂盒按要求在2℃～8℃放置，有效期12个月，取效期末的试剂盒进行检测，各项指标仍符合2.4～2.8的要求。
2.12.2质控品复溶稳定性质控品溶解后置2℃～8℃保存14天后，取质控品进行检测，结果应符合2.10、2.11的要求。
血清（1-3）-β-d葡聚糖检测判断肺部侵袭性真菌感染的诊断价值
572014年2月第21卷第3期血清（1-3）-β-D 葡聚糖检测判断肺部侵袭性真菌感染的诊断价值谢 颖肺部侵袭性真菌感染（PIF I ）的诊断目前主要根据患者痰培养或肺组织活检，但操作复杂，尤其是肺组织活检，临床可操作性差，不易开展。
（1-3）-β-D 葡聚糖为一种多糖，普遍存在于真菌的细胞壁中，约占真菌细胞壁干重的50％。
笔者对我院送检痰标本患者的血清进行（1-3）-β-D 葡聚糖检测，评价其在PIFI 中的诊断价值。
1 资料与方法1.1 一般资料与分组 2008年6月至2012年11月，送检我科的支气管镜吸引痰标本及其患者血清各77份。
有广谱抗生素应用史41例（53.2%），糖皮质激素使用史31例（40.3%），体内置留导管22例（28.6%），恶性肿瘤史8例（10.4%）。
痰标本培养真菌阳性28例，设为感染组；阴性49例，设为非感染组。
1.2 血清（1-3）-β-D 葡聚糖检测 检测流程按试剂盒要求逐步进行。
① 将事先准备待检的静脉血2ml 置入离心管中以2900r /min 的转速离心6min ，然后吸取上层血清100μl 置入900μl 处理液中，振荡摇匀。
将其放置在恒温水浴箱中70℃孵育10min ，然后快速放置到冰水中。
② 将制备好的标本200μl 放入含有主反应试剂A 的管中，充分振荡混匀并移植标准玻璃反应管中，放入MB-80微生物快速动态检测系统中进行反应。
③ 反应1h 后进行结果判断。
1.3 统计分析 计量资料以（x-±s ）表示，组间比较用t 检验。
计数资料以百分数表示，组间比较采用χ2检验。
Stata 12.0统计绘制ROC 曲线，并根据敏感性和特异性的最佳组合判断血清（1-3）-β-D 葡聚糖的临界值，并给出相应的该临界值下的诊断PIF I 敏感性和特异性，计算曲线下面积，双侧P ＜0.05认为差异有统计学意义。
2 结果2.1 两组基本情况比较 年龄：感染组（66.8±9.2）岁，非感染组（67.4±11.1）岁，差异无统计学意义（t =0.24，P ＞0.05）。
真菌(1-3)-β-D葡聚糖检测操作SOP文件
声明本产品属精密光学仪器，在日常使用中，应严格按照我公司出具的操作流程进行试验操作，并确保工作环境正常。
本试验的操作者必须为经我公司培训合格的微生物实验室检验人员，如需更换操作者，请做好交接工作，确保新的操作者了解仪器特性、熟悉操作流程。
为避免试验结果不准确，请操作者认真阅读操作注意事项及操作流程，并严格遵守。
如有任何疑问，请联系我公司售后服务部。
售后服务部电话：400-811-9958北京金山川科技发展有限公司真菌（1-3）-β-D葡聚糖测定1.目的建立真菌（1-3）-β-D葡聚糖检测标准操作规范，保证实验结果的准确性。
2.授权操作人经培训合格的微生物实验室检验人员。
3.实验原理（1-3）-β-D葡聚糖检测原理：真菌（1-3）-β-D葡聚糖激活酶反应主剂中的G因子后形成凝固蛋白，根据其所引起的浊度变化对真菌（1-3）-β-D葡聚糖浓度进行定量测定。
（1-3） -D-Glucan活化因子G 因子G凝固酶原凝固酶凝固蛋白原凝固蛋白（凝胶）4．产品性能指标4.1 灵敏度最小检出值5pg/ml5．实验组成5.1实验仪器及器具：MB-80微生物快速动态检测系统、洁净工作台、低速离心机、恒温仪， 20~200ul 加样器、100~1000ul加样器、旋涡混合器、定时器。
5.2实验耗材：200ul无热原吸头、1000ul无热原吸头、无热原平底试管、无热原真空采血管。
5.3试剂盒组成：真菌（1-3）-β-D 葡聚糖检测试剂盒（光度法）：试剂盒包括反应主剂和样品处理液。
6．工作环境相对湿度：20%~80%；温度控制：10~30℃；电源电压：220V±10%，50Hz±2%。
7．标本采集、处理及保存7.1检测样本：血液、肺泡盥洗液、胸腔积液、腹水、脑脊液、尿液（无菌取中段尿或穿刺尿）7.2采集要求：采样过程要求无菌操作，用专用的无热原真空采血管（肝素类抗凝）。
常规病人早上用药治疗前空腹采血/取样（血透患者透析前采血）。
真菌[1-3]-β-D-葡聚糖与革兰氏阴性菌脂多糖检测[专家学习]
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一类特制
10
非培养方法优点
快速报告结果 敏感性提高 取材简便 多以真菌在致病状态产生的物质为检
测标志物，结果阳性提示有致病性 定量检测可判断感染严重程度及疗效
评估
一类特制
11
非培养诊断的方法简介
真菌细胞壁成分
（1-3） - β- D-葡聚糖检测（G试验）
真菌抗原检查
半乳甘露聚糖（galactomannan) 抗原 （GM)
β1,3
b1,6 葡聚糖
磷脂 双分 子层
b1,3葡聚糖 合成酶
几丁质
麦角固 醇
一类特制
羊毛固醇C－14去甲基化酶
14位还原和7－8位异构酶
角鲨烯环氧化酶
17
1,3-β-D-葡聚糖结构
➢ 葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁
糖蛋白类
中
➢ 1,3-β-D-葡聚糖占真菌壁成
葡聚糖
分50%以上，是真菌细胞壁
几丁质
上的特有成分 ➢ 以1,3-β-糖苷键连接的葡萄糖
一类特制
30
小结
1,3-β-D-葡聚糖是侵袭性真菌感染早期 诊断、疗效观察、预后评估有价值的实 验诊断。
1,3-β-D-葡聚糖检验其敏感性优于GM 侵袭性真菌感染的诊断与治疗是一个复
杂过程，实验室与临床应密切联系，为 临床医生提供诸如显微镜检查、真菌培 养、血清学标志物等多方面信息。
一类特制
一类特制
22
1,3-β-D-葡聚糖相关影响因素
以下情况可出现假阳性：
➢ 使用纤维素膜进行血透，标本或患者暴露于纱布或其 他含有葡聚糖的材料；
➢ 静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品； ➢ 链球菌血症； ➢ 操作者处理标本时存在污染； ➢ 使用多糖类抗癌药物、放化疗造成的粘膜损伤导致食
1,3-β-D-葡聚糖检验简介
注：＊原发性者可无宿主因素，△肺组织、胸液、血液真菌培养阳性（除外肺孢子菌）
15
（1,3） - β- D-葡聚糖检测
16
真菌细胞膜、壁结构
mannoproteins
β1,3 b1,6 葡聚糖 磷脂 双分 子层
b1,3葡聚糖 合成酶
几丁质 麦角固 醇
羊毛固醇C－14去甲基化酶 14位还原和7－8位异构酶 17 角鲨烯环氧化酶
30
小结
1,3-β-D-葡聚糖是侵袭性真菌感染早期 诊断、疗效观察、预后评估有价值的实 验诊断。 1,3-β-D-葡聚糖检验其敏感性优于GM 侵袭性真菌感染的诊断与治疗是一个复 杂过程，实验室与临床应密切联系，为 临床医生提供诸如显微镜检查、真菌培 养、血清学标志物等多方面信息。
31
内毒素定量检测
23
1,3-β-D-葡聚糖检测临床价值
早期诊断：侵袭性真菌感染增多且复杂，早期症状无 特异性，往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死 亡率高。因此对深部真菌感染治疗成败的关键在于早 期诊断。 指导用药：快速确定真菌感染后，选择好治疗方案,有 针对性使用抗真菌类药物。为临床选用副作用小，疗 效高，价格适宜的药物提供准确的依据。 评价效果：应用抗真菌药物后，定期检测血浆中葡聚 糖浓度变化，评价选用药物的有效性。 监护病程：监护深部真菌感染易感人群的病发状态。 动态观察：易感人群，监测临床疗效。
危重病人的存活期延长
延长了真菌感染 的 高 危 期
使此类患者业已增加 的人数进一步扩大
严重真菌感染迅速上升势头
是日益严重的威胁！
5
真菌感染的危险因素：
1,3-β-D-葡聚糖检验简介
b1,3葡聚糖 合成酶
几丁质
麦角固 醇
羊毛固醇C－14去甲基化酶
14位还原和7－8位异构酶
角鲨烯环氧化酶
17
1,3-β-D-葡聚糖结构
葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁
糖蛋白类
中
1,3-β-D-葡聚糖占真菌壁成
葡聚糖
分50%以上，是真菌细胞壁上
几丁质
的特有成分 以1,3-β-糖苷键连接的葡萄
9
镜检和培养方法
敏感性低
血培养：在肿瘤和血液病病人中，50%尸检证 实深部念珠菌感染的病例血培养阴性。
培养结果阳性仅表示存在某种真菌，区 分定植和感染困难
培养时间长 有些标本采集困难
10
非培养方法优点
快速报告结果 敏感性提高 取材简便 多以真菌在致病状态产生的物质为检
真菌（1-3）-β-D-葡聚糖 与革兰氏阴性菌脂多糖检测
器械部 广东金羽医药发展有限公司
1
鲎
20世纪六十年代，人们 发现一种古老的海洋生物， 被称为“海洋活化石”的 鲎，它的血液与内毒素接 触后会发生特异性的凝集 反应，人们经过大量研究 和实验从它的血液中提取 出了用来检测内毒素的 “鲎试剂”。
2
真菌特异的代谢产物
D-阿拉伯糖醇
真菌 DNA 的检测
12
临床诊断、拟诊的微生物学
1 合格痰标本直接镜检发现菌丝，且连续培养 ≥2次分离到同种真菌
2 BALF经直接镜检发现菌丝真菌培养阳性 3 痰液或BALF直接镜检发现新生隐球菌 4 乳胶凝集法检测隐球菌荚膜多糖抗原阳性 5 G实验连续两次阳性 6 GM实验连续两次阳性
在浅部真菌感染中，(1-3)-β-D-葡聚糖未被释放出来， 故其在体液中的量不增高。
血清1,3—β—D—葡聚糖检测对深部真菌病诊断的研究
血清1，3—β—D—葡聚糖检测对深部真菌病诊断的研究目的探讨血清（1，3）-β-D-葡聚糖对深部真菌病的诊断价值。
方法将2014年2～6月天津市武警后勤学院附属医院110份数据（标本140份）分为侵袭性真菌病患者组33例和无侵袭性真菌病组77例，分析比较葡聚糖水平，并使用ROC曲线确定最佳临界值。
结果侵袭性真菌病患者组的葡聚糖水平（279.78±83.26）pg/mL，明显高于对照组（34.05±9.35）pg/mL（P＜0.001）；ROC 曲线下面积为0.946（95%的置信区间为0.904～0.988），当以95.20 pg/mL为临界值时，实验的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为84.8%、93.5%、80.0%和93.3%；临床符合率达到89.1%。
Kappa值0.784（P＜0.05）。
结论血清葡聚糖水平可以用于深部真菌感染的诊断，本研究中用北京金山川公司的GKT-1M Set动态真菌检测试剂盒检测血清葡聚糖水平，进行深部真菌感染诊断时的最佳临界值为95.20 pg/mL，当以此临界值对深部真菌感染进行诊断时，临床一致性较好。
[Abstract] Objective To investigate the diagnostic value of serum（1，3）-β-D-glucan for deep fungal disease. Methods 110 copies of data（140 specimens）of affiliated hospital of tianjin Armed Police logistics academy from February to June 2014 were divided into the invasive fungal disease group with 33 copies and the non-invasive fungal disease group with 77 copies. The glucan levels were analyzed and compared. The ROC curve was used to determine the optimal critical value. Results The glucan level of the invasive fungal disease group was （279.78±83.26）pg/mL，which was significantly higher than the（34.05±9.35）pg/mL of the control group（P＜0.001）. The ROC area under curve was 0.946（95% confidence interval was 0.904-0.988）；When 95.20 pg/mL was used as the critical value，the sensitivity，specificity，positive predictive value and negative predictive value of experiment were 84.8%，93.5%，80.0% and 93.3%. The clinical accordance rate reached 89.1%. The Kappa value was 0.784 （P＜0.05）. Conclusion The serum glucan level can be used for the diagnosis of deep fungal infection. This study uses the GKT-1M Set dynamic fungal detection kit of Beijing Jinshan Company to detect the serum glucan level. The optimal critical value for deep fungal infection diagnosis is 95.20 pg/mL and when this critical value is used for the diagnosis of deep fungal infection，the clinical consistency is better.[Key words] Deep fungal disease；Diagnosis；Serum 1，3-β-D-glucan；ROC curve现今，尽管存在有效的治疗方法，但是侵袭性真菌病（invasive fungal disease，IFD）仍然是免疫抑制患者发病和死亡的重要原因[1]。
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可用于检测念珠菌、毛孢子菌、曲霉菌、镰刀菌、卡 氏肺孢子菌
不可检测隐球菌、接合菌（根霉/毛霉等）
一类特制
19
“G”试验缘何而来？
一类特制
20
检测原理（比色法）
β葡聚糖或LAL-RM
旁路反应
内毒素
活化C因子
真菌（1-3）-β-D-葡聚糖 与革兰氏阴性菌脂多糖检测
器械部 广东金羽医药发展有限公司
一类特制
1
鲎
20世纪六十年代，人们 发现一种古老的海洋生物， 被称为“海洋活化石”的 鲎，它的血液与内毒素接 触后会发生特异性的凝集 反应，人们经过大量研究 和实验从它的血液中提取 出了用来检测内毒素的 “鲎试剂”。
甘露聚糖(mannan)抗原 隐球菌荚膜多糖抗原（乳胶凝集试验）
真菌特异的代谢产物
D-阿拉伯糖醇
真菌 DNA 的检测
一类特制
12
临床诊断、拟诊的微生物学
1 合格痰标本直接镜检发现菌丝，且连续培养≥2 次分离到同种真菌
2 BALF经直接镜检发现菌丝真菌培养阳性 3 痰液或BALF直接镜检发现新生隐球菌 4 乳胶凝集法检测隐球菌荚膜多糖抗原阳性 5 G实验连续两次阳性 6 GM实验连续两次阳性
条件致病性真菌
念珠菌病 曲霉病 隐球菌病 其他
一类特制
7
诊断方法
影像学 组织病理学/细胞学 传统的方法 培养 血清学
分子生物学方法：
Platelia Aspergillus ELISA Fungitell assay PCR（unavailable）
一类特制
8
真菌病实验室诊断主要内容
一类特制
13
侵袭性真菌感染的诊断标准 EORTC/MSG2008修订版
宿主因素 临床特征 病原学
真菌镜检 真菌培养 组织病理学检查 血清学检查方法（间接证据）
CSF隐球菌抗原阳性——确诊 GM-test, G-test——临床诊断
Clinical Infectious Diseases 2008; 46
β1,3
b1,6 葡聚糖
磷脂 双分 子层
b1,3葡聚糖 合成酶
几丁质
麦角固 醇
一类特制
羊毛固醇C－14去甲基化酶
14位还原和7－8位异构酶
角鲨烯环氧化酶
17
1,3-β-D-葡聚糖结构
➢ 葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁
糖蛋白类
中
➢ 1,3-β-D-葡聚糖占真菌壁成
葡聚糖
分50%以上，是真菌细胞壁
几丁质
上的特有成分 ➢ 以1,3-β-糖苷键连接的葡萄糖
一类特制
10
非培养方法优点
快速报告结果 敏感性提高 取材简便 多以真菌在致病状态产生的物质为检
测标志物，结果阳性提示有致病性 定量检测可判断感染严重程度及疗效
评估一类特制Fra bibliotek11非培养诊断的方法简介
真菌细胞壁成分
（1-3） - β- D-葡聚糖检测（G试验）
真菌抗原检查
半乳甘露聚糖（galactomannan) 抗原 （GM)
4
医学和相关科学的进步
危重病人的存活期延长
延长了真菌感染 的高危期
使此类患者业已增加 的人数进一步扩大
严重真菌感染迅速上升势头
是日益严重的威胁！
一类特制
5
真菌感染的危险因素：
中心静脉插管 尿道插管 广谱抗生素
气管插管
腹部外科 肠胃外营养 营养不良
住院时间
感染之前定殖
一类特制
6
侵袭性真菌感染
一类特制
22
1,3-β-D-葡聚糖相关影响因素
以下情况可出现假阳性：
➢ 使用纤维素膜进行血透，标本或患者暴露于纱布或其 他含有葡聚糖的材料；
➢ 静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品； ➢ 链球菌血症； ➢ 操作者处理标本时存在污染； ➢ 使用多糖类抗癌药物、放化疗造成的粘膜损伤导致食
物中的葡聚糖或定植的念珠菌经胃肠道进入血液等也 可能造成假阳性。
一类特制
23
1,3-β-D-葡聚糖检测临床价值
早期诊断：侵袭性真菌感染增多且复杂，早期症状无 特异性，往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死 亡率高。因此对深部真菌感染治疗成败的关键在于早 期诊断。
指导用药：快速确定真菌感染后，选择好治疗方案,有 针对性使用抗真菌类药物。为临床选用副作用小，疗 效高，价格适宜的药物提供准确的依据。
一类特制
2
鲎试剂的发明
1981年1月Jack Levin 和 Frederik B.Bang教 授在美国马塞诸塞州 Wools Hole海洋生物实 验室成功分离提取鲎血 细胞并研制成能够检测 细菌内毒素的鲎试剂， 开辟了人类认识和检测 内毒素的新纪元！
一类特制
3
侵袭性真菌感染率上升↑
AIDS
一类特制
一类特制
14
诊断IPFI的三个级别
宿主因素 临床特征 微生物学 组织病理学
确诊
＋
＋
＋
＋
临床诊断 ＋
＋
＋
－
拟诊
＋
＋
－
－
注：＊原发性者可无宿主因素，△肺组织、胸液、血液真菌培养阳性（除外肺孢子菌）
一类特制
15
（1,3） - β- D-葡聚糖检测
一类特制
16
真菌细胞膜、壁结构
mannoproteins
麦角固醇
残基骨架作为主链 ➢ 以分支状1-6-β-D葡萄糖残基
作为侧链
B1， 3葡聚糖合成酶
一类特制
18
1,3-β-D-葡聚糖特性
对热极为稳定，高压121℃并不能使其灭活。在念珠 菌和曲霉菌细胞壁中含量较多，对G实验灵敏。
当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞 噬、消化等处理后，(1-3)-β-D-葡聚糖可从胞壁中释 放出来，从而使血液及其它体液中含量增高。当真菌 在体内含量减少时，机体免疫系统可将其清除。
准确、快速检出真菌病原体 真菌镜检 真菌培养 组织病理 生理生化 血清学方法 分子生物学
一类特制
9
镜检和培养方法
敏感性低
血培养：在肿瘤和血液病病人中，50%尸检 证实深部念珠菌感染的病例血培养阴性。
培养结果阳性仅表示存在某种真菌，区 分定植和感染困难
培养时间长 有些标本采集困难
C因子
G因子
活化G因子 活化B因子
B因子
凝胶法、比浊法
凝固酶
凝固酶原 显色法
凝固蛋白（凝胶）
凝固蛋白原 AC-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA（酶作用物）
AC-Ile-Glu-Ala-Arg-OH
pNA（对硝基苯胺，黄色）
405nm测光度值
一类特制
21
分析前注意事项
采用无热原采血管 抽血后2h内送检 血标本4-8℃最多存放48h 检测环境应保持清洁