酶的改造方法进展
酶分子的改造方法及研究进展
酶分子的改造方法及研究进展裴蓓10生物技术及应用班摘要：酶工程的研究已经发展到分子水平，在体外通过基因工程、化学、物理等手段改造酶分子结构与功能，大幅提高了酶分子的进化效率和催化效率，生产有价值的非天然酶。
本文对常见的酶分子的改造方法做了一个简单的介绍化学修饰法、生物酶工程法、定点突变法，最后结合当今的形式对酶改造的发展前景做了描述。
关键词：酶分子改造方法前景正文：1 酶分子改造的目标1.1 提高酶的稳定性1.2 提高酶的活性1.3 增强酶的选择性1.4 改变酶的表面特性2 改造酶分子的方法近年来，特别是随着蛋白质工程的(protein engineering)应用，即把分子生物学、结构生物学、计算生物化学结合起来，根据蛋白质结构与功能关系的知识，经过计算机辅助的分子设计，按照人类的需要，产生性能优良的酶分子。
就目前情况来看，现在常用的酶分子修饰方法有：2.1化学修饰法在应用过程中，有时会因酶的稳定性差、活力不够理想及具有抗原性等缺点而使其应用受到一定的限制，为此常需对酶进行适当再修饰加工，以改善酶的性能。
酶的修饰可分为化学修饰和选择性遗传修饰两类。
酶分子的化学修饰是指通过主链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造,造的目的在于改变酶的一些性质，创造出天然酶不具备的某些优良性状扩大酶的应用以达到较高的经济效益。
酶分子的化学修饰常见的方法有：部分水解酶蛋白的非活性主链，利用小分于或大分子物质对活性部位或活性部位以外的侧链基团进行共价修饰，酶辅因子的置换等。
2.2生物酶工程法酶的化学修饰法并非改造酶的惟一手段。
随着人们对酶的深入研究以及氨基酸一级结构的测定、基因重组技术的应用等，可以彻底地改造、合成并且模拟酶。
这也就是生物酶工程的主要内容。
生物酶工程主要包括基因工程技术生产酶和蛋白质工程技术改造酶两方面内容。
对自然酶的化学结构进行修饰以改善酶的性能的方法很多。
例如，a一淀粉酶一般有 Ca2+，Mg等金属离子，属于杂离子型，若通过离子置换法将其他离子都换成Ca2=，则酶的活性提高3倍，稳定性也大大增加；胰凝乳蛋白酶与水溶性大分子化合物右旋糖酐结合，酶的空间结构发生某些细微改变，使其催化活力提高4倍；还有对抗白血病药物——天冬酰胺酶的游离氨基进行修饰后，该酶在血浆中的稳定性也得到很大的提高。
酶改造的方法
酶改造的方法酶，就像是大自然赋予生命的神奇小精灵，它们在各种生物过程中起着至关重要的作用。
那如果我们想要让这些小精灵变得更厉害、更符合我们的需求，该怎么做呢？这就涉及到酶改造啦！咱先来说说理性设计。
这就好像给酶这个小精灵精心打扮一样，我们对它的结构了如指掌，知道哪里需要调整、哪里需要改进。
通过对酶的活性中心、底物结合部位等关键区域进行有针对性的改造，就像是给它穿上了一件更合身、更酷炫的衣服，让它能更好地发挥作用。
比如，我们可以改变一些关键氨基酸，让酶对底物的亲和力更高，反应速度更快。
这难道不神奇吗？还有定向进化呢！这就像是让酶去参加一场激烈的生存挑战比赛。
把酶放在各种不同的环境中，让它们自己去适应、去进化。
经过一轮又一轮的筛选和突变，那些最优秀、最适应的酶就会脱颖而出。
这不就像是在一群小精灵中选出了最厉害的冠军嘛！这种方法虽然有点像碰运气，但往往能带来意想不到的惊喜哦！类比一下，理性设计就像是精心规划的旅行，你知道自己要去哪里，怎么去；而定向进化则像是一场随心所欲的冒险，不知道会遇到什么，但可能会有意外的收获。
再说说半理性设计，这就像是在理性设计和定向进化之间找一个平衡。
既不完全靠计划，也不完全靠碰运气。
它结合了两者的优点，让酶改造变得更加灵活、更加高效。
在进行酶改造的过程中，我们还得有足够的耐心和细心。
就像培养花朵一样，要精心呵护，不能操之过急。
每一次的尝试都可能带来新的发现，每一个小小的改变都可能对酶的性能产生巨大的影响。
而且，酶改造可不是一件简单的事情哦！它需要我们对酶的特性有深入的了解，对各种技术手段有熟练的掌握。
这就像要成为一个优秀的厨师，不仅要知道各种食材的特点，还要掌握精湛的厨艺。
总之，酶改造的方法就像是一个充满奥秘和惊喜的宝库，等待着我们去探索、去发现。
通过理性设计、定向进化和半理性设计等方法，我们可以让酶变得更加强大、更加有用。
这对于生物科技、医药、农业等诸多领域来说，都是非常重要的。
酶改造的详细流程
酶改造的详细流程
一、生物酶工程改造法
1.获取目标酶基因序列：首先，需要通过数据库查询或基因克隆的方法获取目标
酶的基因序列。
2.设计突变位点：利用生物信息学方法对酶的三维结构进行分析，预测可能影响
酶性质的氨基酸位点，并设计相应的突变。
3.引入突变：采用位点突变、基因重组或随机突变的方法在酶的基因上引入设计
好的突变。
常用的方法有错误密码子突变（site-directed mutagenesis）、DNA重组等。
4.构建重组表达载体：将带有突变的基因克隆到合适的表达载体中。
5.转化表达细胞：将重组表达载体转入适当的表达宿主细胞（如大肠杆菌、酵母
等）中。
6.性质分析与筛选：对纯化后的突变酶进行生化性质分析，包括活性、专一性、
稳定性和适应性等，并与野生型酶进行对比。
筛选出性质改善的突变酶。
酶的基因工程改造与生产
酶的基因工程改造与生产酶是指生物体中具有催化生物化学反应的蛋白质，可以在温和条件下促进生物反应的发生。
因其具有高效、高选择性和温和的催化特性，成为工业界生产、医学领域和食品加工等领域的重要工具。
酶的基因工程改造和生产技术是实现大规模工业酶制剂生产的关键技术之一。
酶的基因工程改造酶的基因工程改造是指通过DNA重组技术将基因分离、修饰和组合，进而设计合成出具有新功能和性能的酶。
这项技术可以通过操纵目标酶的基因序列来改变其催化效率、特异性和稳定性等。
因此，酶的基因工程改造被广泛应用于生物技术、农业、医药、化工和食品工业等领域。
具体来说，酶的基因工程改造是通过以下步骤完成：1. 酶基因的克隆和表达。
将目标酶的基因序列扩增、重组和转移到表达载体中，使其可以在表达宿主中进行表达和生产。
2. 酶基因的定向演化。
通过定向演化技术对酶进行系统性改进，使其催化效率、特异性、稳定性等特性得到提高。
其中包括DNA重组、突变、异源启动子和剪接等方法。
3. 酶的进一步扩增和纯化。
将表达的目标酶发酵并经过分离、纯化和结晶等环节，使其可以达到工业生产的标准。
酶的基因工程改造技术优点在于可以通过合成和改进酶基因组达到调节酶的催化性能、调变应用环境等目的。
同时，该技术还能改变酶的物理化学特性，如催化效率、温度特性、酸碱特性，在许多工业酶制剂的生产中具有广泛应用前景。
酶的工业生产酶的工业生产是将酶类产品大规模应用于工业领域，如制浆造纸、合成食品添加剂、医药生产等，进而实现商业盈利和推动经济发展。
酶的高效生产必须结合基因工程改造技术、工艺优化和质量管理等多方面的知识和技能。
目前，酶的工业生产具有以下几个主要环节：1. 酶的基因工程改造。
通过设计合成酶基因组、利用后向技术等手段，使得酶的性能和催化效率得到大幅提升，从而达到酶的工业生产的要求。
2. 酶的发酵和生产。
酶的生产一般采用液体和固体发酵的方式，具有高效生产、规模化生产等特点。
优化发酵条件，利用基因工程的手段增加发酵附带酶的产生，大大提高了酶的生产量和分离纯度。
酶定向进化的原理和步骤
酶定向进化的原理和步骤
酶定向进化（enzyme directed evolution）是一种通过人为引
导的、基于自然选择原则的酶改造方法，可以用于提高酶的活性、稳
定性、底物范围等性质，以满足特定需要。
其原理和步骤如下：原理：
1. 酶定向进化是基于自然选择的原理。
通过引入随机突变和筛选操作，筛选出具有所需性质的变体酶，再通过重复这一过程，逐步改进和优
化酶的性能。
步骤：
1. 随机突变：通过诱发突变（例如随机突变、DNA Shuffling等）引
入酶的突变，得到一组具有多样性的突变体酶库。
2. 筛选/选优：通过选择性试剂、高通量筛选系统等手段，筛选
出表现出所需性质的突变体酶。
这一步骤需要对酶的目标特性进行准
确的定量、定性检测。
3. 特异突变体筛选：从筛选中得到的酶变体中，选出表现最佳
的数个突变体。
4. 突变组合：根据选出的突变体酶，通过多种方式（例如DNA Shuffling等）进行突变位点的组合，产生更多的突变体酶。
5. 筛选与优化：通过筛选和优化，选出具有更好性质的突变体酶。
6. 反馈循环：重复上述步骤，逐步优化酶的性质，直到满足所需。
总体来说，酶定向进化是通过不断引入突变和选择操作来改良酶
的性能，然后通过逐步筛选和优化的方式，在突变体酶库中逐渐筛选
出具有所需特性的酶。
提高酶活的方法
提高酶活的方法
一、酶的结构优化
1.酶的改造：通过遗传工程手段对酶的基因进行改造，引入突变体或
构建新的酶，以增加酶的催化活性和稳定性。
2.酶的化学改性：通过化学方法引入化学修饰剂，如PEG、获得修饰
基团、金属离子等，改变酶的空间构型，提高酶的催化效率和稳定性。
3.酶的固定化：将酶固定在固相载体上，形成固定化酶，可以提高酶
的稳定性和重复使用性。
二、酶的参数优化
1.温度优化：通过优化反应温度，找到适合酶活性的最佳工作温度，
提高酶的活性。
2.pH值优化：通过控制反应体系的pH值，找到适合酶催化的最佳pH 值，提高酶的活性。
3.底物浓度优化：通过调整底物浓度，使酶催化反应在酶的饱和浓度
下进行，提高酶的活性。
4.酶的浓度优化：通过调整酶的浓度，使酶与底物的摩尔比达到最佳
比例，提高酶的活性。
三、酶的环境优化
1.协同作用：将多个酶的作用进行协同，使其在反应体系中相互促进，提高整体的反应效率。
2.辅酶或辅因子添加：给予酶所需的辅酶或辅因子，如辅酶NADH、
辅因子腺苷酸二磷酸（ATP）等，增加酶的催化活性。
3.培养条件优化：通过优化微生物培养条件，如培养基成分、培养温度、培养时间等，提高酶产量和活性。
4.抑制剂或激活剂的添加：通过给予酶所需的抑制剂或激活剂，调节
酶的活性，增加催化活性。
总的来说，提高酶活的方法包括酶的结构优化、酶的参数优化和酶的
环境优化。
通过改造酶的结构、优化酶的参数和环境，可以提高酶的活性、稳定性和催化效率，从而促进酶的应用和产业发展。
酶分子改造的方法及应用
酶分子改造的方法及应用摘要：酶工程是研究酶的生产和应用的一门技术性学科，进入20世纪后，随着微生物发酵技术的发展和酶分离纯化技术的更新，酶制剂的研究得到不断推进并实现了其商业化生产，但直接利用酶制剂时存在酶的稳定性差、使用效率低、不能在有机溶剂中反应等缺点。
通过酶的修饰可提高酶的稳定性，消除或降低酶的抗原性，使之更适合生产和应用的要求。
近年来发展的蛋白质工程技术则使酶的定向改造成为可能。
随着生物技术的发展，酶工程将引起巨大的变革。
关键词：酶分子修饰蛋白质工程模拟酶引言：近年来，酶工程开始兴起，迅速发展，其研究成果也越来越广泛地运用于各个领域。
虽然如此，但是由于酶一离开其特定的环境条件就会变得不太稳定，不适合大批量生产的需求，因此，大规模应用酶和酶工艺的还不多。
在工业应用中，底物及产物带来的影响常常导致pH偏离酶作用的最适条件的中性范围，使酶难以发挥作用。
在临床应用上，绝大多数酶对人体而言都是外源蛋白质，具有抗原性，直接注入会引起人体的过敏反应。
所以人们希望能够通过各种人工方法改造酶，使其更能适应各方面的需要。
1.酶分子改造的方法1.1酶分子修饰酶分子修饰[1]（Modification of Enzyme Molecule）即通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程。
酶分子修饰在提高酶的活力、增强酶的稳定性、降低或消除酶的抗原性、研究各种物理因素对酶分子空间构象的影响，进一步探讨酶分子的结构与功能之间的关系等方面具有重要意义。
1.1.1酶分子的主链修饰酶分子的主链修饰[2]就是利用酶分子主链（肽链或核苷酸链）的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。
1.1.1.2主链的切断修饰[3]主链断裂后，引起酶活性中心的破坏，酶的催化功能丧失（用于探测酶活性中心的位置）。
酶活性中心的空间构象维持不变，酶的催化功能也可以保持不变或损失不多，但是抗原性有发生改变。
酶工程的应用及其发展趋势
酶工程的应用及其发展趋势
酶工程是利用生物技术方法对酶进行改造和优化，以满足工业生产的需求。
它在各个领域都有广泛的应用，包括医药、食品、化学等。
以下是几个酶工程的应用及其发展趋势：
1. 医药领域：酶被广泛应用于药物合成和制药过程中。
例如，通过酶工程可以改进药物合成的效率和产量，减少副产物的生成，提高纯度和质量。
此外，酶还可以用于制造生物药物，包括蛋白质药物、抗体药物等。
未来的发展趋势是开发更多的酶药物，并提高制药过程的效率和环保性。
2. 食品工业：酶在食品工业中有广泛的应用，包括面包、啤酒、酸奶等食品的制作过程中。
通过酶工程可以改善食品的质地、口感和保鲜性。
此外，酶还可以用于食品添加剂的开发，用于改善食品的营养价值和功能性。
未来的发展趋势是开发更多的专用酶用于食品加工，提高食品的品质和安全性。
3. 环境保护：酶工程在环境保护领域有重要的应用。
例如，酶可以用于处理工业废水和污染物，降解有机废弃物和重金属污染物。
此外，酶还可以用于制备生物柴油和生物降解塑料等可再生能源和环保材料。
未来的发展趋势是开发更多具有高效降解性和低成本的酶用于环境治理和再生资源的利用。
4. 新型酶的发现和优化：酶工程的发展趋势是发现和利用新型酶及其应用。
随着生物技术的不断发展，越来越多的新酶被发现和鉴定，可以应用于各种工业过
程。
此外，通过基因工程和代谢工程的方法，可以对酶进行定向进化和改造，提高其催化活性、稳定性和特异性。
未来的发展趋势是开发更多的新型酶和创新技术，提高工业生产的效率和可持续性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
pH稳定性： pH梯度
极端环境：高盐、低温、高浓毒物质
平板筛选方法
依据颜色变化筛选
大肠杆菌ß-半乳糖苷酶基因显色：噬菌体DNA载体（蓝色）
反应产物显色：磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黄色硝基酚
海因酶筛选
脂肪酶筛选
平板筛选方法
依据透明圈大小筛选
淀粉酶的进化：淀粉平板培养基
豆鼓纤溶酶的进化：血纤维蛋白培养基
• 海藻酸钠先加热配成溶液，取一定量碱性蛋白酶溶液和海 藻酸钠溶液混合，搅拌均匀后用蠕动泵将混合液滴入2% 的CaCl2 中形成凝胶珠，放入4 ℃冰箱硬化4h，得到海藻
酸钠微球。
• 卡拉胶加热配成一定的浓度, 50℃ 水浴保温 , 加入乳糖酶 溶液，均匀搅拌后冷却，4℃ 冰箱中硬化，得到块状固定 化酶；
• 抗体的特性
1） 蛋白质特性
2） 能高选择配体，专一性与抗原结合 3） 种类达千万种
• 酶的特性
1） 大部分为蛋白质
2） 能高选择性结合底物，催化反应高效进行
12
抗体酶催化的应用实例
重排反应
模拟结果：以椅式构象的氧杂双环化合物为反应的过渡态类似物，制
备了催化分支酸为预苯酸的抗体酶，比原反应速度快102-104倍，而且仅催
修饰后，生成3-硝基酪氨酸残基，使酶对带正电荷的底
物结合能力显著增强；
4）肽链有限水解修饰实例
胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活
5）氨基酸置换修饰实例
Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶
活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去
对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等 底物水解的活性。 评价：化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且 要对酶分子逐个修饰，操作复杂，难以工业化生产；
氨基酰化酶的锌被钴取代后，底物专一性和最适pH都
有改变，锌酶对N-乙酰丙氨酸的最适pH是8.5,而钴酶是 7.0.
2）酶大分子修饰的实例
• 每分子核糖核酸酶和6.5分子的右旋糖酐结合，酶的催化 效率提高2.25倍； • 用琥珀酸酐法活化的聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行修饰，在 55℃的稳定性比未修饰的提高38%；
三、酶的生物改造-定向进化
自然进化 上万年
诱变育种
几年到十多年
Hale Waihona Puke 定向进化几个月自然界酶的进化是极其缓慢的，无法适应工业过程的需要 。随着分子生物学技术快速发展，人们可以在试管内利用几 周时间完成自然界几万年的进化过程
酶的定向进化技术发展历程
定向进化 随机和 定点突变 基于序列-功能 关系与统计模 型的理性进化
• 尿激酶采用聚乙二醇5000修饰，在兔体内的半衰期延长
9~13倍；
• 超氧化歧化酶采用聚乙二醇修饰后半衰期延长70~350倍；
• L-天冬酰胺酶经聚乙二醇修饰后，抗原性显著降低，1994 年经美国FDA批准成为治疗急性白血病的药物使用
3）侧链基团修饰的实例
• 用亚硝酸修饰天冬酰胺酶，使氨基末端的Leu和肽链中
计算机 辅助设计
生物催化剂进化方法发展历程
酶定向进化的过程和应用范围
蛋白质 •稳定性 •活性 •有机溶液中的活性 •不同的底物的利用 •酸碱度 •蛋白质的表达 •亲和性 •专一性
随机突变 随机杂交 性能
筛选
目标蛋白 达到目的
1
2
3
4
……
代数
酶定向进化的典型例子
枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化
正面
反面
进化后的枯草杆菌蛋白酶E
在60%的DMF中酶催化效率提高157倍，最适温度提高17℃
对硝基苯酯酶的分子进化
(Lori Giver等，1998）
（在30%的DMF中酶催化活性提高100倍）
β-葡糖苷酶耐热性的提高
(Marý´a Jesu´ s Arrizubieta等，2000）
酶定向进化的基本过程
化（—）分支酸。
缩合反应
转酯基反应
酰胺键的形成
酯解反应
胺解和脱羧反应
消除和金属取代反应
抗体酶的发展前景
• 抗体酶已成为研究酶的作用机制的一个有 力的工具。抗体酶的研究过程中，可以直 接观察到过渡态理论对抗体酶设计所起到 的重要作用。这也就为酶的过渡理论的正 确性提供了一个有力的实验证据。
（d）
(e)
噬菌体显示筛选模式
噬菌体显示的几种类型
核糖体显示技术
RNA-蛋白质融合技术
RNA-蛋白质的融合
酶定向进化的发展趋势
• 定向进化方法发展迅猛
方法均有知识产权；方法更有针对性和特征性；
• 高通量筛选方法是关键 新方法（荧光显示/表面展示）在涌现，技术交叉是趋势； • 定向进化是近20年中最成功的酶改造方法 新的实例越来越多；
酶分子修饰主要方法
• 金属离子置换修饰
• 大分子结合修饰
• 侧链基团修饰
• 肽链有限水解修饰
• 氨基酸置换修饰
1）金属离子置换修饰实例
SOD的金属离子置换： 天然SOD中的铁原子被锰原子取代后，重组酶对H2O2的
稳定性显著增强，对NaH3的抑制作用的敏感型显著降低。
氨基酸酰化酶的金属离子置换：
发展趋势：定点突变
通过定点突变技术把农杆菌-葡萄糖苷酶催化中心 的第358位L-GluL-Ala，使亲核的羧基甲基，结果 使该酶失去了水解活性，而可以催化糖苷合成
酶分子修饰的发展趋势
• 大分子修饰研究最为成功，尤其是聚乙二醇修饰；
• 酶的侧链基团修饰已经成为酶结构研究的重要手段；
• 更为精细的酶侧链修饰往往和结构生物学紧密相关；
四、酶的人工模拟
酶对热，酸，碱以及有机溶剂的 不稳定性，限制了其在工业中的应用。
固 定 化 酶 ----结合到特定的支 持物上并能发挥 作用的一类酶。
模 拟 酶 ----模拟酶的生物催化 功能，用化学半合 成法或化学全合成 法合成的酶。
模拟酶
根据酶的作用原理来 模拟酶的活性中心和 催化机制，用化学方 法制成的高效、高选 择性、结构较简单、 稳定性较高的新型催 化剂。
易错PCR方法
有性进化：DNA改组方法（1994，Stemmer)
有性进化：体外随机重组法（1998，Arnold)
有性进化:交错延伸法（1997，Arnold)
基因家族的同源重组
• 无性进化方法：易错PCR法，盒式诱变 • 有性进化方法 1）DNA改组法（DNA Shuffling) 2）体外随机重组法（RPR) 3）交错延伸法(StEP) • 基因家族的同源重组 • 外显子的改组 • 杂合进化
二、酶的物理改造-固定化
载体固定化：纳米材料、树脂、水凝胶、壳聚糖等 无载体固定化：细胞表面自固定化、酶聚集体等
• 10mL 淀粉葡萄糖苷酶(350μg/mL)与30mg 壳聚糖混合，
在室温放置1h，不时搅拌，在4℃过夜，过滤，用600mL 蒸馏水洗涤, 过滤即得壳聚糖固定化淀粉葡萄糖苷酶；
基因突变库的筛选方法
目标
根据定向进化要求，在一定的环境要求下进行筛选，从 突变基因中得到所需的突变基因。难点
突变库容量大，一般达到106，工作量巨大
关键
高通量筛选：通量大，效率高
方法
平板筛选法，荧光筛选法，噬菌体表面展示法，细胞 表面展示法
平板筛选方法
依据细胞生长情况筛选
热稳定性：温度梯度和高温环境 抗生素耐受性：抗生素浓度梯度
• 抗体酶在有机合成和有机反应机制研究方 面，也引起了有机化学家的广泛兴趣。抗 体酶使过去很多不能应用酶促反应的有机 合成得以实现。
酶人工模拟的发展趋势
• 人工模拟方法较多，但进展不平衡
环糊精模拟发展最早，杂合方法是新趋势；
• 抗体酶是发展最快的模拟方法 抗体酶制备技术成熟，应用渐入佳境，值得重视！ • 人工模拟的机理研究有待深入
酶的改造方法研究进展
为什么要进行酶改造？
温和的自然体系： 常温、常压、中性pH、水环境 酶 不适应
极端的工业体系： 高温、高压、酸、碱、有机溶剂
酶的改造方法
酶的化学修饰-分子修饰 酶的物理修饰-固定化 酶的生物改造-定向进化 酶的人工模拟-抗体酶
一、酶的化学修饰
1
B
通过制备酶单分子纳米凝胶，大大提高了酶的稳定性
荧光筛选方法
利用自身荧光激发特性
生成产物本身是具有荧光激发特性的物质
利用荧光报告基因 辣根过氧化合物酶和单加氧酶的融合基因： 原理：萘→萘酚→醌类化合物（能激发荧光） 绿色荧光蛋白基因：获2008年诺贝尔化学奖
绿色荧光蛋白的应用
(a)
(b)
(c)
分子标记： FISH分析菌株
（a）未加探针；（b）DAPI染色（c）α-探针杂交（d）Msint-1268探针杂交菌 株Y1；（e）Msint-1268探针杂交M. trichosporium OB3b
• 随机突 突变基因的筛选 平板筛选法，荧光筛选法，表面展示法
随机突变方法：定向进化的核心
• 无性进化方法：易错PCR法，盒式诱变 • 有性进化方法 1）DNA改组法（DNA Shuffling) 2）体外随机重组法（RPR) 3）交错延伸法(StEP) • 基因家族的同源重组 • 外显子的改组 • 杂合进化
讨论题安排（11.4和11.11）
9、抗体酶在生物催化领域的应用;（2人）
51、定向进化在提高脂肪酶手性选择性中的应用
52、定向进化在提高酯酶耐热性中的应用 53、基于可见/紫外吸收技术的高通量筛选方法 54、基于荧光技术的高通量筛选方法 48、菊粉酶的定向进化研究
50、酵母细胞表面展示技术在高通量筛选中的应用
讨论题安排（10.21和10.28）
10. 磁性材料在酶固定化中的应用