荧光淬灭定义
荧光淬灭定义课件
03
荧光淬灭的实验方法
荧光光谱法
总结词
荧光光谱法是一种通过测量荧光物质发射的荧光光谱来 研究荧光物质性质的方法。
详细描述
荧光光谱法利用不同荧光物质发射的荧光具有不同波长 和强度这一特性，通过测量荧光光谱的波长和强度，可 以了解荧光物质的分子结构和分子间的相互作用。
高选择性
荧光淬灭技术可以通 过选择适当的淬灭剂 ，实现对特定荧光物 质的淬灭，从而实现 高选择性检测。
应用广泛
荧光淬灭技术可以应 用于多种类型的荧光 物质，包括有机荧光 物质和无机荧光物质 。
缺点
需要选择合适的淬灭剂
不同的荧光物质可能需要不同的淬灭 剂，因此需要选择合适的淬灭剂才能 获得最佳的检测效果。
用。
荧光淬灭的程度取决于多种因素，如荧光物质的 03 性质、溶剂的性质、温度、压力等。
荧光淬灭的原理
荧光淬灭的原理主要包括能量转移淬 灭、动态碰撞淬灭和静态碰撞淬灭等
。
动态碰撞淬灭是指荧光物质分子与另 一种分子发生碰撞，导致荧光物质分 子振动能级升高，从而降低荧光强度
。
能量转移淬灭是指荧光物质分子与另 一种分子之间发生能量转移，导致荧 光强度降低。
医学研究中的应用
荧光淬灭在医学研究中主要用于药物筛选和疾病 诊断。通过荧光标记技术，可以对药物与靶点的 结合进行实时监测，从而筛选出具有潜在疗效的 药物。
荧光淬灭还可以用于肿瘤诊断和治疗。通过荧光 标记技术，可以对肿瘤细胞进行标记和追踪，从 而实现对肿瘤的精准诊断和治疗。
环境监测中的应用
荧光的淬灭quench及常见原因
荧光的淬灭quench及常见原因荧光淬灭（quench）是指荧光产生的过程中，由于外界的影响，导致激发态分子的能级跃迁被提前，使得荧光的产生被阻止或减弱的现象。
荧光淬灭是荧光研究中非常重要且广泛存在的现象，其产生的原因有很多。
下面我将详细说明荧光淬灭的常见原因。
一、非辐射淬灭非辐射淬灭是指激发态分子从高能级跃迁到低能级时不发生荧光辐射而产生淬灭。
这种淬灭的原因可以是以下几种。
1. 光化学反应：光化学反应是指分子在激发态下与其他分子发生化学反应，导致激发态能级的跃迁，从而淬灭荧光。
光化学反应的典型例子是光解反应和光化学氧化反应。
2. 能量传递：在某些分子中，能量可以通过共振作用传递给其他分子，从而引起荧光淬灭。
通常情况下，能量传递是通过分子之间的碰撞来实现的。
能量传递的过程中，高能级的激发态分子将能量传递给低能级的分子，导致激发态分子的能级跃迁被提前，从而抑制荧光的发生。
3. 结构效应：某些分子的结构中存在强烈的内禀电场或离子对，这些结构会干扰分子的能级跃迁，使得激发态分子的能级跃迁被提前，从而引起荧光淬灭。
典型的例子是金属离子对荧光的淬灭作用。
二、自失活自失活是指激发态荧光分子在发光前与自身发生非辐射跃迁，因而淬灭了自己的荧光。
自失活可以分为两种类型：1. 内部转换：内部转换是指激发态分子内部电子的重新排布，使得激发态能级的能量被消耗掉，从而淬灭了荧光。
内部转换是由于分子内部振动、转动或电子的自由运动等激发态分子内部的各种相互作用引起的。
2. 共振能量转移：共振能量转移是指激发态分子与周围分子发生相互作用，能量通过共振作用传递给周围分子，从而引起激发态能级的跃迁而淬灭荧光。
共振能量转移通常是通过分子之间的碰撞来实现的。
三、环境因素环境因素也是引起荧光淬灭的重要原因之一。
常见的环境因素包括溶剂、温度和氧气等。
1. 溶剂效应：不同溶剂对荧光的淬灭效应是不同的。
有些溶剂能够影响分子的振动和转动的自由度，从而影响能级跃迁的发生。
猝灭还是淬灭
1、淬灭:这个指的应该是让反应停止，比如溴化反应（经常做的一
个反应），每次老师都叫我淬灭，用硫代硫酸钠淬灭，那里面的溴和硫代硫酸钠反应掉，停止反应，有的反应迅速降温也能起到停止反应的作用，应该也算是淬灭（不太清楚）。
淬灭的英文词是Quenching，源于金属学中的淬火，原意是指快速冷却，用来防止低温相变、提高金属硬度等，还可以用于制备金属玻璃。
在这里，淬灭表明在荧光过程中，光子产生的数量在很短的时间内衰减或者消失。
2、猝灭:这个猝灭指的是荧光物质溶液在加入某种能使它荧光消
失的东西后（猝灭剂），荧光消失的现象，自己跟的导师是做荧光分子的（AIE效应，ACQ效应），了解一些。
猝灭，是指激发态通过非辐射复合的途径达到弛豫。
是通过处于发光中心激发态的电子与晶格碰撞把激发能交给晶格，产生大量的声子而无辐射地回到基态。
光、电场及磁场等外界因素均可产生发光猝灭。
荧光淬灭常见原因
荧光淬灭常见原因荧光淬灭是指在荧光染料激发下发出的荧光在一定条件下突然消失的现象。
荧光淬灭常见于生物实验、光学成像等领域，对于研究者来说，了解荧光淬灭的原因至关重要，可以帮助他们正确解读结果和优化实验设计。
下面将详细介绍荧光淬灭的常见原因。
1. 触发荧光淬灭的物理现象：一种常见的荧光淬灭现象是非辐射能量转移。
当荧光染料与另一种分子（通常是有机小分子）相互作用时，非辐射能量转移会导致荧光淬灭。
这种能量转移通常发生在激发态的分子之间，其中一个分子从激发态回到基态，而另一个分子则激发到高能态。
这种非辐射能量转移导致荧光淬灭。
2. 溶剂极性和极性荧光淬灭：荧光染料分子在溶剂环境中的极性可以影响荧光淬灭。
一般来说，非极性溶剂（如苯）对荧光淬灭的影响较小，而极性溶剂（如水）会加速荧光淬灭。
这是因为在极性溶剂中，离子和溶剂分子之间的相互作用可以导致荧光淬灭。
3. 分子间相互作用：分子间的相互作用也是导致荧光淬灭的常见原因。
分子聚集和聚合可以通过静电相互作用、水合作用或π-π堆积来导致荧光淬灭。
当荧光染料分子聚集在一起时，它们之间的相互作用可以促使染料分子处于非激发态，导致荧光淬灭。
4. 氧化和还原反应：氧化和还原反应也是一种触发荧光淬灭的常见原因。
荧光染料分子可以很容易地发生氧化或还原反应，这些反应会导致荧光淬灭。
对于某些荧光染料来说，当它们发生氧化或还原反应时，海森堡-拉信法则会导致它们的荧光淬灭。
5. pH值的影响：溶液的pH值可以对荧光淬灭产生影响。
荧光染料的荧光淬灭通常由于pH值的变化而发生。
在不同的pH条件下，荧光染料可能会发生质子化或去质子化反应，这些反应会影响其荧光性能，导致荧光淬灭。
6. 温度的影响：温度对荧光淬灭也有一定影响。
温度升高可以加快分子碰撞和动力学过程，增强了非辐射能量转移，导致荧光淬灭。
因此，在高温条件下，荧光淬灭可能更容易发生。
7. 时间因素：荧光染料的荧光淬灭也受到时间因素的影响。
荧光淬灭
如果这种能量传递不有效的话，可能荧光就强。
另外金的plasmon也会增强荧光材料的光吸收，可能会增强荧光总强度。
这两个竞争过程除了与波长有关外，朱要与距离有关，一般5纳米是界限，距离短被淬灭荧光淬灭有以下几种说法:1. 动态淬灭(碰撞淬灭,淬灭剂与发光物质的激发态分子之间的相互作用)2. 静态淬灭(发光分子基态和淬灭剂形成不发光的基态络合物)3. 转入三重态淬灭4. 自吸淬灭(浓度高时，自淬灭)首先确定荧光物质是否有电性，就是说荧光物质是否带有电荷，而且贵金属，例如纳米金，在制作过程中，表面由于有柠檬酸根而带有负电荷，可以和带正电荷的荧光物质，如带正电荷水溶性荧光共轭聚合物，通过静电作用，而使荧光猝灭；如果带相同电荷或者一方不带电荷，猝灭是不怎么明显的。
可以这样说，这种猝灭，是通过电荷作用相互吸附在一起，你可以让两者相互作用后，做一个TEM，就可以判断了。
荧光淬灭有动态淬灭和静态淬灭两种，稳态的荧光强度都显示出荧光强度的衰减，无法分辨，而动态淬灭至少分裂为2个荧光寿命，意味着能量转移的发生，而静态淬灭只是淬灭剂与荧光物结合生成非荧光物质，荧光寿命并不发生变化。
Acrylamide和碘离子分别用于疏水淬灭或亲水淬灭，测量蛋白质中Trp残基荧光淬灭的寿命，能够轻易的得知Trp残基是位于蛋白质表面还是内部。
荧光淬灭多用于分析大分子或胶体的结构或构象，用淬灭的方法研究荧光基团在分子内还是分子表面，有个淬灭的方程，一时写不出来，大概是淬灭剂浓度和荧光变化的关系，有个K常数，和淬灭效率和荧光寿命有关，如果分子构型改变，K会变化，这样就可以用来研究某些化合物对大分子构型或构象的影响。
荧光漂白，就是用强光把荧光素的激发态全部给消除了，有可逆和不可逆两种，可逆的漂白相当于清理出一个没有荧光的区域，相当于荧光清零，然后再观察测量某种特定的荧光的扩散、产生或恢复。
漂白是否可以恢复依赖于荧光素的种类和漂白光强，作为副作用，荧光素的漂白常会发生。
荧光强度随浓度升高而降低的原因
荧光强度随浓度升高而降低的原因荧光强度是指在特定条件下，物质所发出的荧光光线的强度。
一般来说，荧光强度随浓度的增加而降低，这是由于以下几个原因。
荧光强度随浓度升高而降低是由于自吸收效应的存在。
自吸收是指物质在高浓度下，荧光发射的光线会被物质本身吸收，从而导致荧光强度的降低。
在高浓度下，荧光分子之间的距离变得非常接近，因此荧光发射的光线会被周围的分子吸收，使得荧光强度减弱。
这种现象在染料溶液中尤为明显，因为染料分子之间的距离较近，自吸收效应很容易发生。
荧光强度随浓度升高而降低还与荧光淬灭效应有关。
荧光淬灭是指物质在高浓度下，由于分子之间的相互作用，导致荧光发射的光线被猝灭。
在高浓度下，荧光分子之间的相互作用增强，例如分子间的能量传递、电荷转移等，会导致荧光发射的光线被猝灭，从而减弱荧光强度。
溶剂效应也会影响荧光强度随浓度的变化。
溶剂对荧光分子的环境有很大的影响，不同的溶剂会对荧光分子的结构和性质产生影响。
一些溶剂具有强烈的极性或非极性，会与荧光分子发生相互作用，从而影响荧光的发射。
在高浓度下，荧光分子与溶剂分子之间的相互作用增加，可能导致荧光发射的光线受阻，使得荧光强度降低。
荧光强度随浓度升高而降低还可能与光损失效应有关。
光损失是指在荧光发射的过程中，光线会受到各种因素的影响而逐渐损失。
例如，光线在物质中的传播过程中会发生散射、吸收、反射等现象，导致荧光强度减弱。
在高浓度下，荧光分子之间的距离较近，这可能会导致光线在传播过程中更容易受到阻碍和损失，从而使得荧光强度降低。
荧光强度随浓度升高而降低的原因主要包括自吸收效应、荧光淬灭效应、溶剂效应和光损失效应。
这些因素的综合作用导致了荧光强度的降低。
在实际应用中，我们需要注意对荧光测量的条件进行优化，以减少这些因素的影响，从而获得准确可靠的荧光测量结果。
荧光淬灭名词解释
荧光淬灭名词解释
“荧光淬灭”名词解释：在产生荧光的物质的溶液中加入盐等物质会使溶液的吸光度下降现显著的荧光。
最简单的杂环化合物。
荧光淬灭现象：在产生荧光的物质的溶液中加入盐等物质会使溶液的吸光度下降
产生原因：
分子结构和化学环境是影响物质发射荧光和荧光强度的重要因素.至少具有一个芳环或具有多个共轭双键的有机化合物容易产生荧光,稠环化合物也会产生荧光。
饱和的或只有一个双键的化合物，不呈
现显著的荧光。
最简单的杂环化合物，如吡啶，呋喃，噻吩和吡咯等，不产生荧光.
取代基的性质对荧光体的荧光特性和强度均有强烈影响。
苯环上的取代基会引起最大吸收波长的位移及相应荧光峰的改变。
通常给电子基团，如-NH2-,-OH,-OCH3,-NHCH3和-N(CH3)2等，使荧光增强；吸电
子基团，如-CL,-Br,-I,-NHCOCH3,-NO2和-COOH,使荧光减弱。
具有刚性结构的分子容易产生荧光.
大多数无机盐类金属离子不产生荧光，而某些情况下，金属螯合物却能产生很强的荧光.溶剂的性质，体系的PH值和温度，都会影响荧光的强度.
荧光分子与溶剂或其他分子之间相互作用，使荧光强度减弱的
现象称为荧光猝灭。
引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂。
当荧光物质浓度过大时，会产生自猝灭现象。
荧光淬灭定义
双抗体夹心法
待测液含抗原Ag (k)Ab1-Ag (k)Ab1-Ag-Ab2 Ab3-(k)Ab1 阳性结果T,C均有颜 色
(k)Ab1
Ab2
T
待测液，不含抗原Ag (k)Ab1 (k)Ab1
C
Ab3-(k)Ab1 阴性结果T无颜色，C 有颜色
(k)Ab1
Ab2
T
双抗体加心法检测原理图
双抗体夹心法
竞争法
待测物中的某种抗原与T（检测线）线处同 种抗原竞争性地与标记抗体相结合的过程。
竞争法
结合垫
免疫层析法检测的实物 图
Y1:A的单抗与标记物的偶联体 Y2：抗原A Y3:羊抗鼠二抗 含抗原 A
夹心法
• 待测物中某种抗体（抗原）与T线处抗原A （抗原A）以及荧光标记的抗原（抗体）特 异性相结合的过程，在T线处形成抗体A+抗 原+抗体B形式的夹心结构。
6碳纳米管
• 碳纳米管( carbon nanotubes，CNTs) 的结构可看成 是石墨的六角形网格结构发生一定弯曲而形成的空间 拓扑结构。
• CNTs 作为生物 分子标志物的 原理与胶体金 类似，其明显 的黑色在定性 或半定量检测 中肉眼即可见。
• 目前无论用何种方法制备 CNTs，均难以去 除其中混杂的无定形碳、石墨碳碎片等杂 质，这些杂质与 CNTs 混杂在一起，严重 [1] 限制了 CNTs的研究与应用 .
• 固定相是固体物质或固定于固体物质上的 成分。 • 流动相是可以流动的物质，如水或各种溶 剂。
• 层析过程：当待分离混合物随流动相通过 固定相时，由于混合物各组分的理化性质 的差异，与固定相相互作用弱的组分随流 动相移动时受到的阻滞作用小，向前移的 速度快；与固定相相互作用强的组分向前 移动的速度慢。从而实现混合物中各组分 的分离。
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荧光效率
定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率 计算公式: 荧光效率=
发射荧光的光量子数（ 荧光强度） 吸收光的光量子数（激 发光强度）
荧光寿命
定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程
度时所用的时间。
各种荧光物质的荧光寿命不同。
荧光淬灭
• 定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发 射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。 • 引起荧光淬灭的因素：有如紫外线照射、 高温、某些硝基化合物、重氮化合物等。
结合垫
免疫层析法检测的实物 图
双抗体夹心法
待测液含抗原Ag (k)Ab1-Ag (k)Ab1-Ag-Ab2 Ab3-(k)Ab1 阳性结果T,C均有颜 色
(k)Ab1
Ab2
T
待测液，不含抗原Ag (k)Ab1 (k)Ab1
C
Ab3-(k)Ab1 阴性结果T无颜色，C 有颜色
ห้องสมุดไป่ตู้
(k)Ab1
Ab2
T
双抗体加心法检测原理图
• 08天津大学精密仪器 与光电子工程学院与 天津市进出口检验检 疫局合作开发研发一 种便携式仪器。 • 竞争法原理 • 用于农药残留定量检 测
2 镧系元素
• 镧系元素又称为稀土金属元素，指元素周 期表中原子序数 57～71 的所有元素。
• 两种不同镧系元素离子( 分别作为光 吸收子和发射子) 掺杂入亚微米尺寸 的陶瓷颗粒( 作为主基质) 中，会构 成一类能上转发光产生荧光的特殊材 料。—— UCP( up-converting phosphor，UCP) 颗粒。
荧光免疫层析技术的原理与进展
介绍人：罗敏
荧光免疫层析技术的基本原理
层析法(chromatography)的原理是利用混 合物中各组分的物理性质之差(如吸附力、 分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、 分配系数等)而建立来的一种分离技术。 层析系统是由固定相(stationary phase) 和流动(Mobile Phase)相组成。
C
K代表某一标记物
结合垫
免疫层析法检测的实物 图
双抗原夹心法
双抗原夹心反应模式阳性检测（左）与阴性检测（右）
• 利用荧光免疫层析试纸条可以实现对待测 物的定性或者定量检测.
胶体金 其他 量子点
标记物 碳纳米管 镧系元素
纳米磁性材料
有机纳米粒子
胶体金
• 金颗粒之间存在的静电斥力使其在水中保持相 对稳定的状态，形成稳定的水溶性胶体，即称 为胶体金
待 测 物
层析方向
T
免疫反应
C
免疫层析技术基本原理示意图
荧光（fluorescence）
•
荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃 迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式 释放出能量，称为荧光。 发射光谱和激发光谱
发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下 记录的样品发射荧光的强度。 激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波 长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射 强度。
• 免疫层析技术以固定有检测线和控制线的条状纤 维层析材料为固定相，测试液为流动相，通过毛 细作用使待测物在层析条上移动。 • 待测物在T线处发生特异性免疫反应。 • 游离物在C线处发生免疫反应。
待 测 物 层析方向
T C
免疫反应
免疫层析技术基本原理示意图
常用荧光免疫层析法
夹心法
竞争法
•双抗原夹心法
• 固定相是固体物质或固定于固体物质上的 成分。 • 流动相是可以流动的物质，如水或各种溶 剂。
• 层析过程：当待分离混合物随流动相通过 固定相时，由于混合物各组分的理化性质 的差异，与固定相相互作用弱的组分随流 动相移动时受到的阻滞作用小，向前移的 速度快；与固定相相互作用强的组分向前 移动的速度慢。从而实现混合物中各组分 的分离。
双抗体夹心法
竞争法
待测物中的某种抗原与T（检测线）线处同 种抗原竞争性地与标记抗体相结合的过程。
竞争法
结合垫
免疫层析法检测的实物 图
Y1:A的单抗与标记物的偶联体 Y2：抗原A Y3:羊抗鼠二抗 含抗原 A
夹心法
• 待测物中某种抗体（抗原）与T线处抗原A （抗原A）以及荧光标记的抗原（抗体）特 异性相结合的过程，在T线处形成抗体A+抗 原+抗体B形式的夹心结构。
• 胶体金作为标志物有以下优势: • ①几乎可标记所有的蛋白分子，过程简单， 效率高，用量少，便宜，基本不改变被标 记蛋白的活性。且稳定，无毒，使用方便， 保质期长。 • ②不同直径的纳米金可以用于多重标记。 • ③结果判断只需普通光学仪器或直接肉眼 观察。
胶体金作为标记物的应用
试孕纸
应用（定量）
• ①高敏感性，有报道 UCP 的灵敏度可达胶体金的 100 倍。 • ②高稳定性，UCP 的发光信号不受检测环境或样 品腐蚀或标志物自身衰变等的影响，可长期存放 和可重复。 • ③使用简便，安全无毒，可适用于定量分析与多 重分析，在一般的实验室或野外现场都可轻松应 用.
UCP应用举例
• 中科院报道了一种用 于免疫活性检测的UCP 试纸条读数计，采用 半导体激光器作为光 源，CCD作为光电接收 器，步进电机带动控 制试纸条移动的装置
免疫层析法
• 免疫层析技术是建立在层析技术和抗 原一抗体特异性免疫反应基础上的一 项新兴免疫检测技术。
• 免疫层析技术以固定有检测线和控制线的条状纤 维层析材料为固定相，测试液为流动相，通过毛 细作用使待测物在层析条上移动。 • 待测物在T线处发生特异性免疫反应。 • 游离物在C线处发生免疫反应。
• UCP 颗粒主要含有如 下三种成分: • 主基质：氧硫化物 （Y2O2S,GdO2S）、氟 化物(YF3,GdF3）、硅 酸盐 (YSi2O5,YSi3O7）... 3+ 3+ 3+ • 吸收子Yb Er Sm 3+ 3+ 3+ • 发射子Er Ho Tm
A3
S2
A2
S1
A1
UCP独特的优势
• 胶体金既有明亮的色彩， 又有高电子密度，可以吸 附生物大分子，且不影响 生物分子的活性，故可作 为生物分子的标志物，用 于免疫反应中抗原或抗体 的标记定位，定性甚至定 量研究。层析试纸标记用 金颗粒的直径大多在 20～ 40 nm，呈深红色。
• 胶体金标记蛋白质的过程是蛋白被动吸附到金颗 粒表面的过程。 • 由于蛋白分子牢固地结合在金颗粒表面，形成一 个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使 胶体金处于稳定状态。