微生物学实验-1 口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏染色36页PPT
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2实验二显微镜油镜的使用、细胞形态的观察及革兰氏染色
根据公式D=0.61λ/n·Sinα/2 ，增大分母，使得D值减小，分辨 率增大。
（三）显微镜保养和使用中的注意事项
1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当
目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器， 以免压碎玻片或损伤镜面。 4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿， 更不可倾斜拿。 5.油镜使用结束后，物镜用擦镜纸擦三遍：第一遍擦去多余的 香柏油；第二遍擦镜纸蘸上乙醇再擦镜头；第三遍再用干净 的擦镜纸擦去多余的乙醇。 6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。
先用结晶紫初染，所有的细菌都被染成初染料的 蓝紫色；
然后用碘媒染，它与结晶紫结合成结晶紫—碘复 合物，从而增强了染料与细菌的结合力。
然后再用乙醇脱色处理。
（四）、革兰氏染色原理
由于革兰氏阳性菌细胞壁主要由肽聚糖形成网状 结构、壁厚、类脂质含量低，脱色时网孔收缩， 结晶紫—碘不易被洗脱而保留在细胞内，复染时 仍保持蓝紫色。
⑷ 初染：滴数滴结晶紫于菌膜上（以刚好完全覆盖菌膜为 宜）初染1--2分钟min，水洗。
⑸ 媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。
初染
媒染
脱色
复染
（三）革兰氏染色的操作方法
⑹ 脱色：用滤纸吸去载玻片上面的残水，将玻片倾 斜，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色 时为止，约20—30s，立即用水冲净酒精。
?而革兰氏阴性菌由于细胞壁的肽聚糖层较薄类脂含量高所以当脱色处理时类脂被乙醇溶解细胞壁透性增大结晶紫由于细胞壁的肽聚糖层较薄类脂含量高所以当脱色处理时类脂被乙醇溶解细胞壁透性增大结晶紫碘复合物被洗脱复染时细胞被染上复染剂的颜色碘复合物被洗脱复染时细胞被染上复染剂的颜色红色
（三）显微镜保养和使用中的注意事项
1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当
目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器， 以免压碎玻片或损伤镜面。 4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿， 更不可倾斜拿。 5.油镜使用结束后，物镜用擦镜纸擦三遍：第一遍擦去多余的 香柏油；第二遍擦镜纸蘸上乙醇再擦镜头；第三遍再用干净 的擦镜纸擦去多余的乙醇。 6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。
先用结晶紫初染，所有的细菌都被染成初染料的 蓝紫色；
然后用碘媒染，它与结晶紫结合成结晶紫—碘复 合物，从而增强了染料与细菌的结合力。
然后再用乙醇脱色处理。
（四）、革兰氏染色原理
由于革兰氏阳性菌细胞壁主要由肽聚糖形成网状 结构、壁厚、类脂质含量低，脱色时网孔收缩， 结晶紫—碘不易被洗脱而保留在细胞内，复染时 仍保持蓝紫色。
⑷ 初染：滴数滴结晶紫于菌膜上（以刚好完全覆盖菌膜为 宜）初染1--2分钟min，水洗。
⑸ 媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。
初染
媒染
脱色
复染
（三）革兰氏染色的操作方法
⑹ 脱色：用滤纸吸去载玻片上面的残水，将玻片倾 斜，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色 时为止，约20—30s，立即用水冲净酒精。
?而革兰氏阴性菌由于细胞壁的肽聚糖层较薄类脂含量高所以当脱色处理时类脂被乙醇溶解细胞壁透性增大结晶紫由于细胞壁的肽聚糖层较薄类脂含量高所以当脱色处理时类脂被乙醇溶解细胞壁透性增大结晶紫碘复合物被洗脱复染时细胞被染上复染剂的颜色碘复合物被洗脱复染时细胞被染上复染剂的颜色红色
实验三显微镜油镜使用和细菌革兰氏染色共18页
就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
实验三显微镜油镜使用和细菌革兰氏染色
11、获得的成功越大，就越令人高兴 。野心 是使人 勤奋的 原因， 节制使 人枯萎 。 12、不问收获，只问耕耘。如同种树 ，先有 根茎， 再有枝 叶，尔 后花实 ，好好 劳动， 不要想 太多， 那样只 会使人 胆孝懒 惰，因 为不实 践，甚 至不接 触社会 ，难道 你是野 人。(名 言网) 13、不怕，不悔(虽然只有四个字，但 常看常 新。 14、我在心里默默地为每一个人祝福 。我爱 自己， 我用清 洁与节 制来珍 惜我的 身体， 我用智 慧和知 识充实 我的头 脑。 15、这世上的一切都借希望而完成。 农夫不 会播下 一粒玉 米，如 果他不 曾希望 它长成 种籽； 单身汉 不会娶 妻，如 果他不 曾希望 有小孩 ；商人 或手艺 人不会 工作， 如果他 不曾希 望因此 而有收 益。-- 马钉路 德。
实验三显微镜油镜使用和细菌革兰氏染色
11、获得的成功越大，就越令人高兴 。野心 是使人 勤奋的 原因， 节制使 人枯萎 。 12、不问收获，只问耕耘。如同种树 ，先有 根茎， 再有枝 叶，尔 后花实 ，好好 劳动， 不要想 太多， 那样只 会使人 胆孝懒 惰，因 为不实 践，甚 至不接 触社会 ，难道 你是野 人。(名 言网) 13、不怕，不悔(虽然只有四个字，但 常看常 新。 14、我在心里默默地为每一个人祝福 。我爱 自己， 我用清 洁与节 制来珍 惜我的 身体， 我用智 慧和知 识充实 我的头 脑。 15、这世上的一切都借希望而完成。 农夫不 会播下 一粒玉 米，如 果他不 曾希望 它长成 种籽； 单身汉 不会娶 妻，如 果他不 曾希望 有小孩 ；商人 或手艺 人不会 工作， 如果他 不曾希 望因此 而有收 益。-- 马钉路 德。
微生物学3 显微镜油镜的使用和细菌形态的观察
（5）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。
（6） 脱色：用滤纸吸去载玻片上面的残水，将玻片 倾斜，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色 时为止，约20—30s，立即用水冲净酒精。
注意：革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是整个操 作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌， 脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。
倒立的虚像
图1-1-2 光学显微镜的成像原理
显微镜的放大倍数和分辨率
1.放大倍数=接物镜放大倍数× 接目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率 是表示显微 镜辨析物体（两端）两点之间距 离的能力，可用公式表示为：
D=0.61λ/n·Sinα/2
式中D：物镜分辨出物体两点间 的最短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n: 物镜和被检标本间介质的折 射率。 ：镜口角（即入射角）。
2、用无菌的接种环挑少量大肠杆菌与右边水滴充 分混合成仅有大肠杆菌的区域，并将少量大肠杆 菌菌液延伸至玻片中央，与金黄色葡萄球菌混合 成含有两种细菌的混合区。
（四）、革兰氏染色的操作方法
涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检
无菌操作
葡萄球菌
大肠杆菌
（1）涂片：先在载玻片上滴一滴生理盐水，再在菌平
三.显微镜油镜观察操作方法
在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，然后 将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域滴加香柏 油，从侧面注视，用粗调节器使油镜浸在镜油中并几 乎与标本相接。然后用细调节器调节，在目镜下找到 最合适的观察点。
油镜使用毕后：上升镜筒，取下载玻片，用擦镜纸拭 去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏 油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后用干净 的擦镜纸擦去残留的二甲苯。
1.涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样? 2.分析影响革兰氏染色结果的因素。
（6） 脱色：用滤纸吸去载玻片上面的残水，将玻片 倾斜，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色 时为止，约20—30s，立即用水冲净酒精。
注意：革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是整个操 作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌， 脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。
倒立的虚像
图1-1-2 光学显微镜的成像原理
显微镜的放大倍数和分辨率
1.放大倍数=接物镜放大倍数× 接目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率 是表示显微 镜辨析物体（两端）两点之间距 离的能力，可用公式表示为：
D=0.61λ/n·Sinα/2
式中D：物镜分辨出物体两点间 的最短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n: 物镜和被检标本间介质的折 射率。 ：镜口角（即入射角）。
2、用无菌的接种环挑少量大肠杆菌与右边水滴充 分混合成仅有大肠杆菌的区域，并将少量大肠杆 菌菌液延伸至玻片中央，与金黄色葡萄球菌混合 成含有两种细菌的混合区。
（四）、革兰氏染色的操作方法
涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检
无菌操作
葡萄球菌
大肠杆菌
（1）涂片：先在载玻片上滴一滴生理盐水，再在菌平
三.显微镜油镜观察操作方法
在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，然后 将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域滴加香柏 油，从侧面注视，用粗调节器使油镜浸在镜油中并几 乎与标本相接。然后用细调节器调节，在目镜下找到 最合适的观察点。
油镜使用毕后：上升镜筒，取下载玻片，用擦镜纸拭 去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏 油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后用干净 的擦镜纸擦去残留的二甲苯。
1.涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样? 2.分析影响革兰氏染色结果的因素。
实验一、油镜的使用、细菌的革兰氏染色和细菌形态的观察共25页
实验一、油镜的使用、细菌的革兰氏 染色和细菌形态的观察
1、战鼓一响，法律无声。——英国 2、任何法律的根本；不，不成文法本 身就是 讲道理 ……法 律，也 ----即 明示道 理。— —爱·科 克
3、法律是最保险的头盔。——爱·科 克 4、一个国家如果纲纪不正，其国风一 定颓败 。—— 塞内加 5、法律不能使人人平等，但是在法律 面前人 人是平 等的。 ——波 洛克
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
55、 为 中 华 之 崛起而 读书。 ——周 恩来
1、战鼓一响，法律无声。——英国 2、任何法律的根本；不，不成文法本 身就是 讲道理 ……法 律，也 ----即 明示道 理。— —爱·科 克
3、法律是最保险的头盔。——爱·科 克 4、一个国家如果纲纪不正，其国风一 定颓败 。—— 塞内加 5、法律不能使人人平等，但是在法律 面前人 人是平 等的。 ——波 洛克
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
55、 为 中 华 之 崛起而 读书。 ——周 恩来
微生物学实验-1 口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏染色共38页
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使染色观察与显微镜油镜的
使用;细菌的革兰氏染色
26、机遇对于有准备的头脑有特别的 亲和力 。 27、自信是人格的核心。
28、目标的坚定是性格中最必要的力 量泉源 之一， 也是成 功的利 器之一 。没有 它，天 才也会 在矛盾 无定的 迷径中 ，徒劳 无功。- -查士 德斐尔 爵士。 29、困难就是机遇。--温斯顿．丘吉 尔。 30、我奋斗，所以我快乐。--格林斯 潘。
实验一 显微镜油镜的使用和细菌的革兰氏染色
实验一显微镜油镜的使用和细菌的革兰氏染色陈宝莲2010级生态学040212010002一、实验目的1 学习显微镜油镜的使用方法2 学习微生物的无菌操作技术3 学习细菌的革兰氏染色法二、实验原理1 显微镜及油镜物镜的使用原理1) 油镜头的标志油镜头上常刻有OI（oil immersion）或HI（homogeous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记。
在低倍物镜、高被物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numerical aperture）最大，而工作距离最短。
2 ) 显微镜的分辨率显微镜性能的优劣不单是看它的总放大倍数，更重要的是看它的分辨率的大小。
分瓣率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。
D值愈小表明分辨率愈高。
D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比：D=λ/2NA从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。
数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积：NA=n×Sinα/2影响数值孔径大小的因素－是镜口角，二倍介质的折射率。
当物镜与玻片之间的介质为空气时，由于空气（n=1.0）与玻璃（n=1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。
当以香柏油（n=1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃的相近，光线经过玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明度，更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。
2 细菌的革兰氏染色原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram创立的。
作为细菌学上最常用最重要的鉴别染色法，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G－）两大类.G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。
微生物学实验-1 口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏染色剖析共38页
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
微生物学实验-1 口腔微生物的染色观
察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏
染色剖析
11、用道德的示范来造就一个人，显然比用法律来约束他更有价值。—— 希腊
12、法律是无私的，对谁都一视同仁。在每件事上，她都不徇私情。—— 托马斯
13、公正的法律限制不了好的自由，因为好人不会去做法律不允许的事 情。——弗劳德
14、法律是为了保护无辜而制定的。——爱略特 15、像房子一样，法律和法律都是相互依存的。——伯克
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
微生物学实验-1 口腔微生物的染色观
察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏
染色剖析
11、用道德的示范来造就一个人，显然比用法律来约束他更有价值。—— 希腊
12、法律是无私的，对谁都一视同仁。在每件事上，她都不徇私情。—— 托马斯
13、公正的法律限制不了好的自由，因为好人不会去做法律不允许的事 情。——弗劳德
14、法律是为了保护无辜而制定的。——爱略特 15、像房子一样，法律和法律都是相互依存的。——伯克
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
微生物学实验-1 口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏染色
试剂：
蒸馏水； 草酸铵结晶紫染液 ；卢戈氏碘液
95%乙醇； 番红复染液；香柏油；二甲苯 光学显微镜
实验方法
滴水 取菌 涂片 自然干燥 火焰固定
结晶紫染色1分钟 乙醇脱色 （20~30秒） 水洗 碘液1分钟
水洗
水洗
番红1分钟
水洗
干燥
镜检 （油镜）
革兰氏染色操作步骤
E.coli
混合菌
S. aureus
涂片方法示意图
n=1.515 a 空气n=1
λ 分辨率 D= —— 2NA a 数值孔径 NA＝n×sin— 2
电源
电源
显微镜油镜的使用与保护
1.
2.
3.
开显微镜电源开关。 调节显微镜光源。 先用低倍镜、高倍镜查找标本视野，下降载物台约2cm ， 加香柏油一滴于标本的待检部位，换用油镜观察。 换用油镜后，眼睛从侧面注视油镜头，缓慢上升载物台至 油圈不再扩大为止，此时镜头几乎与装片接触，但不可压 及装片。 观察标本时，双眼同时挣开，左眼观察，右眼画图。 油镜用毕，转动粗调将载物台下降，取下标本，用擦镜纸 沾少许二甲苯将镜头擦净，然后再用擦镜纸擦去二甲苯。 使各部分还原，物镜镜头呈八字形，光源强度调至最暗， 关闭电源，罩上防尘罩，收拾干净台面。
实验目的
实验原理
微生物学实验-1
实验材料
实验方法 实验结果 注意事项 实验报告
实验一 细菌的革兰氏染色
思考题
实验目的
1. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌 分类鉴定中的重要性。 2. 学习并掌握革兰氏染色技术，进一步 熟练光学显微镜油镜的使用技术。
实验原理
革兰氏染色法（Gram staining） 是微生物学中常用的一种染 色方法，该染色法由丹麦医 生（Christian Gram）于1884 年创立，故名。
蒸馏水； 草酸铵结晶紫染液 ；卢戈氏碘液
95%乙醇； 番红复染液；香柏油；二甲苯 光学显微镜
实验方法
滴水 取菌 涂片 自然干燥 火焰固定
结晶紫染色1分钟 乙醇脱色 （20~30秒） 水洗 碘液1分钟
水洗
水洗
番红1分钟
水洗
干燥
镜检 （油镜）
革兰氏染色操作步骤
E.coli
混合菌
S. aureus
涂片方法示意图
n=1.515 a 空气n=1
λ 分辨率 D= —— 2NA a 数值孔径 NA＝n×sin— 2
电源
电源
显微镜油镜的使用与保护
1.
2.
3.
开显微镜电源开关。 调节显微镜光源。 先用低倍镜、高倍镜查找标本视野，下降载物台约2cm ， 加香柏油一滴于标本的待检部位，换用油镜观察。 换用油镜后，眼睛从侧面注视油镜头，缓慢上升载物台至 油圈不再扩大为止，此时镜头几乎与装片接触，但不可压 及装片。 观察标本时，双眼同时挣开，左眼观察，右眼画图。 油镜用毕，转动粗调将载物台下降，取下标本，用擦镜纸 沾少许二甲苯将镜头擦净，然后再用擦镜纸擦去二甲苯。 使各部分还原，物镜镜头呈八字形，光源强度调至最暗， 关闭电源，罩上防尘罩，收拾干净台面。
实验目的
实验原理
微生物学实验-1
实验材料
实验方法 实验结果 注意事项 实验报告
实验一 细菌的革兰氏染色
思考题
实验目的
1. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌 分类鉴定中的重要性。 2. 学习并掌握革兰氏染色技术，进一步 熟练光学显微镜油镜的使用技术。
实验原理
革兰氏染色法（Gram staining） 是微生物学中常用的一种染 色方法，该染色法由丹麦医 生（Christian Gram）于1884 年创立，故名。