第十二章结晶法

这样，介稳区的宽度数据对工业结晶操作的设计尤为 重要。介稳区的宽度常用图所示的最大过饱和浓度 △cmax或最大过饱和温度(过冷温度) △Tmax表示，两者 的关系为： △Cmax=dcs/dT△Tmax



介稳区宽度的测定常常是结晶操作设计的第一步。 其方法通常是在一定搅拌速度下缓慢冷却或蒸发不 饱和溶液，在过饱和区域内检测晶核出现的过饱和 温度或浓度。 不稳区晶体生长速度快，晶体尚未长大，溶质浓度 便降至饱和溶解度，此时已形成大量的细小结晶， 晶体质量差； 因此，工业生产中通常采用加入晶种，并将溶质浓 度控制在养晶区，以利于大而整齐的晶体形成。
由rc=2σVm/Rtlnα可看出，rc随α的增大而降低。
临界晶体半径rc表示：
在某一饱和度下，r<rc的晶体溶解度大于cs，自动 溶解；r>rc的晶体溶解度小于cs，自动生长。
纯净的过饱和溶液可维持在一定的过饱和度范围 内（过饱和度不够大时）无结晶析出。 这种在一定过饱和度范围内维持无结晶析出的状 态称为介稳状态或亚稳状态。 但是，如果向其中加入颗粒半径大于rc的晶体， 晶体就会自动生长，直至到其半径与溶质浓度之 间符合式(1)为止。


溶解度是温度的函数。
一般在说某物质在特定溶剂中的溶解度时，并不是给出 一个数值，而是给出一系列数值，这系列数值用一条曲 线来表示，即温度-溶解度曲线，又叫饱和曲线。 大多数物质的溶解度随温度的升高显著增大，也有一些 物质的溶解度对温度的变化不敏感，少数物质(如螺旋霉 素)的溶解度随温度升高而显著下降。 以上溶解度情况是指大颗粒晶体即普通晶体溶质的饱和 浓度。
图2 过饱和与超溶解度曲线 A一稳定区；B一第一介稳区；C一第二介稳区；D—不稳区 l一溶解度曲线；2一第一超溶解度曲线；3一第二超溶解度曲线
第二超溶解度曲线与溶解度曲线之间的区域称为介稳区或 亚稳区，第二超溶解度曲线以上的区域能够自发成核，称 为不稳区(1iable zone)。 在介稳区又存在一定的过饱和浓度，在该浓度以下极难自 发形成结晶，这一浓度与温度之间的关系表示在图2上即 为第一超溶解度曲线。 因此介稳区又分两部分：即第一超溶解度曲线与溶解度曲 线之间的第一介稳区；第二超溶解度曲线与第一超溶解度 曲线之间的第二介稳区。 必须指出，第一和第二超溶解度曲线并非严格的热力学平 衡曲线。除热力学因素[式(1)]外，还受实验条件的影响， 如搅拌强度、冷却或蒸发速度以及溶液纯度等。
（3）生物大分子的晶体常含有结晶水。

如许多蛋白质和酶的结晶水含量常达10%～50%。 麻仁蛋白、溶菌酶的晶体水分分别占晶体重量 39.2%和48%，而原肌球蛋白的长角片晶中水占总 重90%，可见水在蛋白质晶体中占的比重相当大。
（4）生物大分子有共晶现象存在。

如猪糜胰蛋白酶的共结晶体。它是我国生物化 学家戚正武首先报道的。猪糜蛋白酶与猪胰蛋 白酶的混格晶体分子比为3：2。多次重结晶不 能将二者分开。
Kelvin ） 公 式
微小晶体的半径越小，溶解度越大。
这一热力学现象已被许多实验结果所证实。 例如，粒径为0.3μm的Ag2CrO4，晶体比普遍晶体的溶 解度高10%。粒径为0.1μm的BaSO4，晶体比普遍晶体 的溶解度高80%。

溶质只有在过饱和溶液中才能析出；但 并非在任何过饱和溶液都会结晶。 那么，过饱和溶液达到什么程度才会出 现结晶呢？
4.2 晶核的形成
从式rc=2σVm/RTlnα可知，在一定的过饱和度下存在 临界晶体半径rc，半径大于rc的晶体生长，而半径小 于rc的晶体溶解消失。 晶核：理论上通常将半径为rc的结晶微粒定义为晶核 胚种：半径小于rc的结晶微粒称为胚种。 根据晶核的产生机理不同分为初级成核和二次成核； 其中初级成核又分为均相成核和非均相成核。


结晶是一种历史悠久的分离技术，5000年前中国人 已开始利用结晶原理制造食盐。广泛用于化学工业， 在氨基酸、有机酸、抗生素生产过程中已成为重要 的分离纯化手段。 大多数固体产品都是以结晶的形式出售的，因此， 在产品的制造过程中一般都要利用结晶技术。
结晶在生化制药中的重要意义
对生化制药来说 1、结晶是一种纯化手段； 2、是一种固化手段 (从溶液中取得固体溶质）； 3、分子呈规则性排列的晶体是生物活性物质高级 结构以及结构与功能关系的研究材料。
三、结晶基本原理 (结晶过程)
3.1 溶解度、饱和溶液、过饱和溶液 向恒温溶剂(如水)中加入溶解性固体溶质，溶质在溶剂中 发生溶解现象，溶剂中溶质的浓度不断上升。如果固体 溶质的加入量与溶剂相比足够多，一定时间后，溶剂中 溶质的浓度不再升高，溶质在固液之间达到平衡状态。 此时溶液中的溶质浓度称为该溶质的溶解度(solubility)或 饱和浓度。该溶液称为该溶质的饱和溶液。 饱和溶液：当溶液中溶质浓度等于该溶质在同等条件下 的饱和溶解度时，该溶液称为饱和溶液。 过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之 为过饱和溶液。


从热力学理论可知，与微小液滴的饱和蒸汽压 高于正常液体的饱和蒸汽压等现象的原理一样。 微小晶体的溶解度高于普遍大颗粒晶体的溶解 度。
这一现象可用下述热力学公式表达：
凯 尔 文 （
lncs/c=2σVm/RTrc—式1
Cs---半径为rc小晶体的溶解度； C---普通晶体的溶解度 σ---晶体与溶液间的表面张力；结晶界面张力 rc---小晶体的半径； R---气体常数； T---绝对温度 Vm—晶体的摩尔体积
1.5 生物大分子结晶特点

结晶理论是通过无机盐的结晶现象研究发展起 来的，其基本原理也适用于生物产物的结晶， 但生物大分子的结晶和简单无机盐的结晶并非 完全相同，生物大分子的结晶要比小分子结晶 困难。
（1）生物大分子的运动和规则排列要比小分子物质困难得多， 需要的时间和能量也较多。 多糖、蛋白质、酶和核酸等由于分子量大，结构复杂，不 易定向聚集。生物大分子都是由相同或相似的小分子“单 体”缩合而成。如蛋白质和酶由20种氨基酸通过肽键组成， 多糖类由一种或数种单糖通过糖苷键组成，两大类核酸由4 种核苷酸通过磷酸二酯键连接而成。 要求：一方面溶液条件的变化不宜太快、太剧烈，另一方 面在分子有序排列十分困难时还要提供结晶的“模板”即 晶种。
四、结晶的步骤

过饱和溶液的形成 晶核的形成 晶体生长 其中，溶液达到过饱和状态是结晶的前 提；过饱和度是结晶的推动力。
4.1 过饱和溶液的形成 结晶既然是过饱和的溶质分子规则排列的过程， 所以必须为待结晶的溶液创造一个从不饱和到 过饱和的变化条件。

热饱和溶液冷却（等溶剂结晶）
适用于溶解度随温度升高而增加的体系；同时， 溶解度随温度变化的幅度要适中； 自然冷却、间壁冷却（冷却剂与溶液隔开）、 直接接触冷却（在溶液中通入冷却剂）
1.2 结晶与沉淀的比较
固体有结晶和无定形两种状态。 相同点： 都是新相生成的过程，是利用溶质之间溶解度的差别 进行分离纯化的一种扩散分离操作。 区别： ①结晶是内部结构的质点元做三维有序规则排列、形 状一定的固体粒子。而沉淀则是无规则排列的、无定 型粒子。 ②结晶的纯度远高于沉淀，结晶的形成需在严密控制 的操作条件下进行。
溶液过饱和的程度用过饱和度α表示 设过饱和度 α=cs/c 根据式(1) lncs/c=2σVm/RTrc 可以推导出rc=2σVm/Rtlnα 式3 式3表示与某一过饱和溶液呈相平衡的微小晶体半径，为此 过饱和度下的临界晶体半径。α越大，对应的rc越小 。 式2 α又称过饱和系数。
由式3知，即使因溶质分子的碰撞有微小晶体析出， 如果晶体半径r< rc ，根据式(1)可知，此微小晶体 的溶解度c>cs，即该微小晶体会自动溶解。 换句话说，虽然此时溶质的浓度对普通晶体是过饱 和的(c>cs)，但对于半径为r (<rc)的微小晶体仍是不 饱和的。 宏观上表现为晶体并未形成。
在图2所示的各个区域内的结晶现象可归纳如下： A ：稳定区，即不饱和区。在该区域任意一点溶液均是稳 定的；在此区域内即使有晶体存在也会自动溶解； 在曲线1和曲线3之间的区域为亚稳定区，此刻如不采取一 定的手段（如加入晶核），溶液可长时间保持稳定；加入 晶核后，溶质在晶核周围聚集、排列，溶质浓度降低，并 降至曲线1； 介于饱和溶解度曲线和过饱和溶解度曲线之间的区域，可 以进一步划分刺激结晶区和养晶区。 B ：第一介稳区，即第一过饱和区。在此区域内不会自发 成核，但当加入结晶颗粒时，结晶会生长，但不会产生新 晶核。这种加入的结晶颗粒称为晶种(seed crystals)。
AFM下的抗生素晶体
AFM下的抗生素晶体层
谷氨酸结晶
1.3 结晶过程的实质


结晶是溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新相 的过程。 结晶过程是一个表面化学反应过程。 这一过程不仅包括溶质分子凝聚成固体，还包括 这些分子有规律地排列在一定晶格中，过程与表 面分子化学键力变化有关。
1.4 结晶历史和应用

部分溶剂蒸发法（等温结晶法） 适用于溶解度随温度降低变化不大的体系，或 随温度升高溶解度降低的体系； 加压、减压或常压蒸馏

真空蒸发冷却法 使溶剂在真空下迅速蒸发，并结合绝热冷却， 是结合冷却和部分溶剂蒸发两种方法的一种结 晶方法。
设备简单、操作稳定

化学反应结晶 加入反应剂产生新物质，当该新物质的溶解 度超过饱和溶解度时，即有晶体析出； 其方法的实质是利用化学反应，对待结晶的 物质进行修饰，一方面可以调节其溶解特性， 同时也可以进行适当的保护
（2）生物大分子具有形成晶体的能力，但这种能力与大分 子结构和外形有很大关系。 一般来说，支链较少、对称的分子比支链多、不对称的分 子容易结晶； 分子量小，易结晶。分子量越大越难结晶， 例如大多数球蛋白和酶蛋白比较容易结晶，一些大小均匀 的病毒特别是植物球状病毒，也比较容易得到结晶，高度 不对称的核酸大分子，与蛋白质相比则较难结晶(在一定 条件下，小心操作，也可获得一定结晶度的固体)。 还有一些结构复杂，不对称的核酸、蛋白质和多糖类，迄 今仍未能获得晶体。