微生物酶发酵
微生物发酵生产蛋白酶
妥善保存，才能保证其产酶特性不变异、不死亡、
不被杂菌污染。
❖ 2）菌种活化：产酶菌种在使用钱必须接种于斜
面培养基上，在一定条件下，进行培养，以恢复
细胞的生命活动能力。
❖ 3）扩大培养：活化了的菌种，一般还要经一级 至数级的扩大培养。
❖ 4）分离纯化：发酵结束后得到的酶可能含有一些杂
❖ 蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果 实和微生物中。微生物蛋白酶，主要由霉菌、 细菌，其次由酵母、放线菌生产。
二、酶发酵的方式
❖ 1、固体培养发酵 ❖ 2、液体深层发酵 ❖ 3、固定化细胞或固定化原生质体发酵
三、各种发酵方式发酵模式：
❖1、固定培养发酵：
❖ 以麸皮、米糠等为培养基的主要原料，加入 其它必需的营养成分而制成的固体或半固体 的麦曲，经灭菌、冷却后，接入产酶菌株， 在一定条件下，发酵产酶。
❖ 1、从菌种保存机构和有关研究部门获得 ❖ 2、通过筛选获得
五、培养基的配制
❖ 枯草杆菌ASL.398中性蛋白酶发酵培养基：
❖ 玉米粉8%，豆饼粉4%，麸皮3.2%，米 糠1%，磷酸氢二钠0.4%，磷酸二氢钠 0.03%.
六、发酵工艺流程
保藏菌种 菌种活化 种子扩大培养
发酵 分离纯化
酶
七、剖析：
质，所以需要进一步分离杂质，纯化目标酶。
八、蛋白酶的应用
❖ 蛋白酶已广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食 品、酿造等方面 。eg：皮革工业的脱毛和软化已大 量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。 蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。 临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用 酸性蛋白酶治疗支气管炎，用惮性蛋白酶治疗脉管 炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创 口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗。加酶洗衣粉是 洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上 的血渍和蛋白污物，但使用时注意不要接触皮肤， 以免损伤皮肤表面的蛋白质，引起皮疹、湿疹等过 敏现象。
发酵的基本原理
发酵的基本原理
发酵是一种利用生物发酵技术，运用微生物的酶反应，将原料物中的有机物氧化分解成分解产物，从而";获得各种有益物质的生物技术过程。
发酵技术诞生于多种因素的综合因素，除了人们应用了比较多的化学原理，也应用了生物学研究的精髓，将其有效地综合起来，让发酵技术在发展中更加突出原有的功能，甚至形成了一种全新的发酵产业。
发酵的基本原理是利用微生物的代谢作用来分解原料有机物，运用酶反应，将该原料有机物氧化分解成丰富的多种分解产物，从而获得丰富的有益物质。
在这一过程中，原料物被微生物分解为乳酸、乙醇等可消化有机物，同时还可以转化为各类酶、维生素等物质。
此外，酶的作用也是发酵的基本原理之一。
一般而言，微生物在发酵过程中产生的酶有助于其不断的发酵,能够促进有效物质的释放，从而改善这种发酵的效率体现出最大的价值。
最后，应该指出的是，发酵的基本原理紧紧依赖水分、料温、酚酸以及其他微生物的平衡，它是以特定温度、特定湿度为理论基础，将特定温度和容器条件决定的特定水量与特定浓度的菌种组合在一起，这种容器条件下将微生物引入到发酵介质中，并在特定温度、湿度和酸碱度的条件下有条件的发酵，使它们以更高的价值得到了完整的分解转化。
因此，发酵的基本原理是结合微生物代谢作用，运用酶反应分解原料物质，最终以高价值物质产物为结果。
除此之外，还要注意水量、料温、酚酸和微生物等平衡，以此作为发酵过程中统一调节有效性的前提和基础条件。
发酵工程微生物酶制剂生产工艺
2) 液体培养法 液体培养法的优点是：占地少、生产量大、适合机械
化作业、发酵条件容易控制、不易污染，还可大大减 轻劳动强度。其培养方法有分批培养、流加培养和连 续培养三种，其中前两种培养法广为应用，后者因污 染和变异等关键性技术问题尚未解决，应用受到限制。
3）固定化细胞发酵（70年代后期发展）
将细胞固定在载体上后，进行发酵生产。
茯苓、橡子、石蒜等淀粉质原料。
➢ 不同的细胞对各种碳源的利用差异很大，所以在配制培养 基时应根据不同细胞的不同要求而选择合适的碳源。
➢ 另外，选择碳源除考虑营养要求外，还要考虑酶生物合成 的诱导作用和是否存在分解代谢物阻遏作用。尽量
选用具有诱导作用的碳源，尽量不用或少用有分解代谢物 阻遏作用的碳源。 ➢ 例如，α－淀粉酶的发酵生产中，应该选用有诱导作用的淀 粉作为碳源，而不用对该酶有分解代谢物阻遏作用的果糖 作为碳源。
• 合成与生长同步进行。对数生长期酶大量产生， 平衡期合成停止。又称生长偶联型。
如：米曲霉合成单宁酶。 特点：生物合成可被诱导，不受分解代谢物阻遏 和反应产物阻遏。该酶所对应的mRNA很不稳定。
2、延续合成型
• 酶的合成伴随细胞生长而开始，但进入生长 平衡期后酶可继续合成。
如：黑曲霉合成聚半乳糖醛酸酶
工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源产酶微生物用途淀粉酶枯草芽胞杆菌地衣芽胞杆菌米曲霉淀粉液化织物退浆消化助剂加酶洗涤剂葡萄糖淀粉制造葡萄糖发酵酿酒等工业的淀粉水解糖中性蛋白酶枯草芽胞杆菌米曲霉皮革毛皮加工食品加工调味品制造助消化消炎啤酒澄清碱性蛋白酶地衣芽胞杆菌加酶洗涤剂黑曲霉毕赤酵母工程菌株饲料添加剂纤维素酶里氏木霉黑曲霉水洗布生产饲料添加剂消化植物细胞壁半纤维素酶木霉曲霉根霉饲料添加剂消化植物细胞葡聚糖酶枯草芽胞杆菌黑曲霉啤酒酿造饲料添加剂异淀粉酶产气克雷伯氏菌芽孢杆菌淀粉加工乳糖酶乳酸酵母米曲霉黑曲霉米根霉乳品工业处理牛乳和乳清果胶酶曲霉欧文氏菌水果加工果汁果酒澄清麻类纤维脱胶工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源转化酶啤酒酵母假丝酵母制造转化糖凝乳酶米赫毛霉大肠杆菌真菌生产的重组酶制造乳酪脂肪酶曲霉根霉酵母等加酶洗涤剂油脂加工生物化工葡萄糖氧化酶青霉曲霉食品去氧除葡萄糖测定葡萄糖葡萄糖异构酶凝结芽胞杆菌白色链霉菌生产果葡糖浆青霉素酰化酶细菌霉菌放线菌制造6氨基青霉烷酸工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源2生产种子的制备生产种子
微生物发酵产酶及生产工艺
蛋白质及其降解 物、有机氮化物、 无机与氮碳化源物同、氮
第四章 微生物发酵产酶及生产工艺
内容：
常用的产酶微生物； 发酵工艺条件及其控制； 酶发酵动力学； 固定化微生物细胞发酵产酶； 固定化微生物原生质体发酵产酶；
第一节 常用的产酶微生物
一、应用微生物来开发酶的优点： (1)微生物生长繁殖快，生活周期短。因此，用微生
物来生产酶产品，生产能力（发酵）几乎可以不受限制地 扩大，能够满足迅速扩张的市场需求。
(八) 微生物酶的提取方法 (1)酶的粗提； (2)酶的精制。
微生物酶开发的一般程序
(九) 微生物产酶菌种的保藏 (1)斜面； (2)沙土管； (3)冷冻。
-淀粉酶的筛选
蛋白酶产生菌的获得方法
应 用 含 酪 蛋 白 的 培 养 基
第三节、发酵工艺条件及其控制
Go 1、培养基 Go 2、发酵条件及控制 Go 3、提高产酶的措施
Escherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠 杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。
大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速， 而且营养要求低。
应用： 大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖 大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌 工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和
微生物酶开发的一般程序
(四) 菌种的复筛 初筛之后，还要进行复筛。复筛的目的是在
初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合生 产要求的菌种。复筛。
酶活的测定方法的建立尤其重要。
微生物酶开发的一般程序
(五) 对复筛获得菌株的要求 (1)不是致病菌； (2)菌株不易变易和退化； (3)不易感染噬菌体； (4)微生物产酶量高； (5)酶的性质符合应用的需要，而且最好是胞
第二章 微生物发酵产酶
细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度有所 不同，而且往往低于最适生长温度，这是由于在较 低的温度条件下，可提高酶的稳定性，延长细胞产 酶时间。
在细胞生长和发酵产酶过程中，由于细胞的新 陈代谢作用，不断放出热量，会使培养基的温度升 高，同时，热量不断扩散和散失，又会使培养基温 度降低，两者综合，决定了培养基的温度． 温度控制的方法一般采用热水升温，冷水降温， 故此在发酵罐中，均设计有足够传热面积的热交换 装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等。
8、 毛霉（Mucor）
毛霉的菌丝体在基质上或基质内广泛蔓延，菌 丝体上直接生出孢子囊梗，分枝较小或单生，孢子 囊梗顶端有膨大成球形的孢子囊，囊壁上常带有针 状的草酸钙结晶。
毛霉用于生产蛋白酶、糖化酶、α—淀粉酶、脂 肪酶、果胶酶、凝乳酶等。
9、 链霉菌（Streptomyces）
链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要菌株，还可以用于生 产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、 几丁质酶等。此外，链霉菌还含有丰富的16α羟化酶，可 用于甾体转化。
3．无机盐
无机盐的主要作用是提供细胞生命活动不可缺少 的无机元素，并对培养基的pH值、氧化还原电位 和渗透压起调节作用。 主要元素有：磷、硫、钾、钠、镁、钙等。 微量元素有：铜、锰、锌、钼、钴、碘等。 微量元素是细胞生命活动不可缺少的，但 需要量很少，过量反而会引起不良效果， 必须严加控制
4．生长因素（酵母膏、玉米浆、麦芽糖）
4、 提高酶产量的措施
–除了选育优良的产酶细胞，保证发酵工艺条 件并根据需要和变化情况及时加以调节控制 以外，还可以来取某些行之有效的措施，诸 如添加诱导物，控制阻遏物浓度，添加表面 活性剂或其他产酶促进剂等。
• 1）添加诱导物
– 对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添 加适当的诱导物，可使产酶量显著提高。
酶工程第二章微生物发酵产酶
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参与白酒生产中的微生物
1.霉菌
白酒生产常见的霉菌菌种：曲霉、根霉、念珠霉、青
霉、链孢霉等。
2.酵母菌
常见的酵母菌菌种：酒精酵母、产酯酵母、假丝酵母
采用固态配醅发酵，发酵物料的含水量较低，常 控制在55%～65%；
在较低温度下边糖化边发酵，保证酶和酵母的活 性，有利于香味物质的形成和累积；
多种微生物混合发酵，保证有益微生物正常生长 繁殖和发酵代谢；
固态甑桶蒸馏提取成品酒。大曲酒酿造分为清渣 法和续渣法两种。
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大曲分类（按微生物来源）
传统大曲，菌种来源于大自然。 强化大曲，人工接入某些特殊菌种，使大曲在
糖化力、发酵力或产香方面更加突出。 纯种大曲，采用多菌纯种培养大曲，该大曲出
酒率高，是今后发展方向。
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大曲分类（按制曲温度分）
高温大曲，培养制曲的最高温度在60℃以上，酱 香型和部分浓香型大曲酒，采用此大曲。
用的碳源等）经过分解代谢产生的物质阻遏某 些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。 例如：葡萄糖阻遏 – 半乳糖苷酶的生物合成。
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转录水平的调节——操纵子学说
转录水平的调节机制 2、酶生物合成的诱导作用 加入某些物质使酶的生物合成开始或加速进行
的现象，成为酶生物合成的诱导作用，简称为 诱导作用。 如：乳糖诱导分解乳糖相关酶的产生。
第二章 微生物发酵产酶
微生物酶在食品工业中的应用
微生物酶在食品工业中的应用
微生物酶在食品工业中有广泛的应用，主要包括以下方面：
1. 澄清和浊化：例如，木瓜蛋白酶可以用于澄清啤酒、果汁和葡萄酒等；纸酵母能够使葡萄酒变为半白葡萄酒，同时还能改善其品质和口感。
2. 发酵：微生物酶作为发酵过程中的催化剂，可以加速化学反应，提高发酵速度和产量，改良产品质量。
例如，酵母发酵能够使面包、酒、酱油等多种食品得到优质的发酵。
3. 食品降解：微生物酶可以针对某些不利于口感和品质的成分进行降解。
例如，漆酶可以去除胡桃等食品中苦味成分；赤藓糖酶可以降解高岭土中的杂质和蓝藻毒素。
4. 转化和氧化：微生物酶可以使某些食品成分发生转化和氧化反应，从而改善产品口感和质量。
例如，脱乳酶能够转化牛奶中的乳糖为乳酸，促进酸化反应和凝固。
5. 保鲜和防腐：微生物酶能够抑制食品中某些细菌的生长，延长其保质期。
例如，青霉素可以防止奶酪、黄油和肉类等食品发生霉菌污染，从而延长其保质期。
微生物酶发酵生产工艺流程
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进步的深远影响，已越来越被人们认识。有关部门领导在思考着如何用生
物技术去振兴部门、地区或国家的经济；工农业、企事业单位在估量着如
何用生物技术去调整产业结构，提高产品质量与企业效益；科技人员在探
索着如何从生物机能中获得发展生物技术的启发，又如何将生物技术的研
究成果转化为生产力；社会公众在关注着生物技术可能给全社会同时带来
的福利、问题和灾难。
但是，应该承认生物技术又是一种较难准确掌
握的知识。因为生物技术所涉及的学科和行业实在
太多。它是一个高度跨学科与跨行业的领域。从不
同的学科和行业去理解生物技术时，总难免带有不
同侧重点。所以强调准确理解生物技术就显得十分
必要。
生物学
生物 化学
生物
生物 技术
工程
化学
化学 工程
工程学
1.2 一般生物反应过程
生物反应过程的实质是利用生物催化剂从事生物产品 的生产过程。
酶（enzyme） 游离酶/固定化酶---酶反应过程 生物催化剂
细胞（cell）固定化细胞/游离细胞--发酵过程
动、植物细胞（组织）培养过程 污水生化处理过程
从天然物质中应用生物技术提取 有效成分
生物反应过程
细胞(cell)
酶 (enzyme) 除菌 检测
空气 控制
生物催化剂
热能(heat)
(biocatalyst)
(bioreactor)
产品(product)
生物反应器 提取
副产品(by product)
(raw material)
(extract) 残渣(lee/residue)
原材料 底物 (substrate) 灭菌 (sterilizing)
营养物
(nutrient)
经加工的
培养基(medium)
原材料(processed material)
一般生物反应过程示意图
一般生物反应过程可分为四个部分：
１ 发酵原料的预处理：
发酵原料是很丰富的，如薯类、谷类等，但许多工业 微生物都不能直接利用这些发酵原料，通常需要将它们进 行粉碎、蒸煮、水解成葡萄糖以供给微生物利用。还可以 利用废糖蜜、工农业的下脚料。
6. 生产产品的生物体本身也是产物，富含维生素、蛋白 质、酶等；除特殊情况外，培养液一般不会对人和动物 造成危害。
7. 生产过程中需要注意防止杂菌以及噬菌体的污染。
培养基原料
培养基配制
培养基灭菌
储备菌种
摇瓶（种子培养） 种子罐培养 发酵罐培养
空气 空气处理系统 无菌空气 (胞内产品)细胞等固型物
固液分离 (胞外产品)无细胞清液
培养液
产品抽提
产品精制
产品包装
典型发酵过程示意图
1.3 微生物发酵及范围
1.3.１ 微生物发酵及范围
1.3.１.1 微生物菌体的发酵 传统的菌体发酵工业： 面包制作
菌体蛋白(人类或动物)食品
酵母 藻类
新的菌体发酵：
2. 生物反应过程是以生命体的自动调节方式进行的，多 个反应象一个反应一样，在单一设备中进行。
3. 能容易进行复杂的高分子化合物的生产，如酶、光学 活性体。
4. 生产过程通常在常温下进行，操作温和，不考虑防爆 问题，可能使一种设备有多种用途。
5. 能够高度选择性的进行复杂化合物在特定部位的反应， 如氧化、还原、官能团的导入等。
1 绪论
1.1 生物工艺学的定义和特点
生物工艺学（biotechnology）一门既有悠久历史又有崭新 内容的科学技术和生产工艺。
生物工艺学（biotechnology) （生物技术，生物工程）
应用自然科学和工程学的原理，依靠生物催化剂 （biocatalyst)的作用将物料进行加工以提供产品或用以 为社会服务的技术。
２ 发酵过程的准备：
发酵前必须进行种子制备与无菌消毒。无菌消毒是种 子制备与发酵的必要条件，一般在发酵前将发酵原料装入 发酵罐中，通入98千帕的蒸汽高温灭菌，冷却后，在无菌 条件下接入菌种。在发酵过程中要绝对保证无杂菌的污染 ，即没有目标微生物以外的微生物存在，这是发酵成功与 否的关键，对于好氧性发酵，还需要通入无菌空气。
４ 产品的分离与纯化（下游技术)
分离与纯化是从发酵液中制取符合质量指标的制品。 首先 ，将发酵液进行过滤、离心以除去固体杂质，然后采用吸附法 、溶煤萃取法、离子交换法、沉淀法或蒸馏法等，对发酵液中 的产品进行进一步的提炼，以得到符合要求的目标产品。
生物反应过程的特点:
1. 原料以碳水化合物为主，不含有毒物质，并加入少量 有机和无机氮源。
生物技术是带动２１世纪经济发展的关键技术之一，它在化工、医药 卫生、农林牧渔、轻工食品、能源和环境等领域都将发挥重要作用。它促 进了传统产业的改造和新兴产业的形成，将对人类社会产生深远的影响。 21世纪是生物技术世纪；科学家预言： 21世纪世界即将在生物技术上取 得重大突破，新世纪之初，科学方面的主要将在生物学、遗传学和医学、 新型生物材料、能源、环境保护上有所突破； 经济学家则认为：21世纪20年代，生物经济将由目前的形成阶段进入成长 阶段，即工业生产与商业开发阶段。
３ 生物反应器及反应条件的选择：
由于使用的微生物不同，其代谢规律不一样，因而有厌氧 发酵和好氧发酵两种方法。厌氧发酵亦称静置发酵，如酒精 (alcohol)、啤酒(beer)、丙酮(acetone)丁醇(butanol)及乳酸(lactic acid)等均为厌氧发酵产品，其发酵设备不需供氧，所以设备和 工艺都较好氧发酵简单。好氧发酵，顾名思义，就是微生物发 酵过程中需要消耗大量的氧气，以供代谢需要。味精、赤霉素 、土霉素等的生产都属此类。
教材
俞俊１棠编．《新编生物工艺学》，化学工业出版社，2002
教ห้องสมุดไป่ตู้参考书
1 贺小贤编.《生物工艺原理》, 化学工业出版社，2003 2 姚汝华主编. 《微生物工程工艺原理》,华南理工大学出版社,1996 3 熊宗贵．《发酵工艺原理》,中国医药科学技术出版社,2000 4 梅乐和．《生化生产工艺学》，科学出版社，2001 ５ 李艳 编著．《发酵概论》，轻工出版社，1999 ６ 瞿礼嘉．《现代生物技术导论》,高等教育出版社，1998 ７ 吴庆余. 《基础生命科学》，高等教育出版社，2002 8 宋思扬等编．《生物技术概论》,科学技术出版社,2000