免疫组化(SP法)原理步骤及试剂
免疫组化染色操作步骤
免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。
免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。
间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。
PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP 复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。
生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。
亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。
ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。
在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行显色。
ABC法的敏感性较PAP法更高。
图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）SP法与ABC法相似，其不同于ABC法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。
在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。
与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低。
免疫组化各步原理
一、免疫组化技术免疫组织化学（Immunohistochemistry"HC）技术是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。
目前，这种技术在临床病理诊断和形态学研究中已得到广泛应用。
Slide 3:（一）、免疫组化常用染色方法和步骤（石蜡切片）SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）:SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）原理采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。
主要步骤:主要步骤1、石蜡切片脱蜡（与常规HE切片脱蜡相同）：石蜡切片置60 ℃ 烤箱烤片15小时以上一从烤箱中拿出立即放入二甲苯I中5~10 min一二甲苯II 5~10min 一无水乙醇5min 一95%乙醇5min 一80%乙醇5min 一70%乙醇5min 一自来水洗Slide 6:2、3%H2O2阻断20min （以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；PBS 洗3次，每次5min。
3、抗原修复；PBS洗3次，每次5min。
4、滴加5~10% 正常山羊血清封闭，37℃, 10min （消除背景非特异性着色）Slide 7:5、吸干组织周围多余的血清，不洗，滴加第一抗体，37℃,孵育60min或孵育30min 再4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次5min。
6、擦干组织周围PBS, 滴加生物素标记的第二抗体，37c 孵育20min, PBS洗3次，每次5min。
Slide 8:7、擦干组织周围PBS,滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液37c 孵育20min。
8、PBS洗3次，每次5min, D.W洗2次，DAB显色（DAB必须现用现配），镜下控制显色程度，自来水冲洗，苏木素复染胞核，烤干，中性树胶封片。
染色步骤:染色步骤石蜡切片脱蜡到水；3%H2O2阻断10min （以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；蒸馏水洗2次，PBS洗3次，每次5min。
免疫组化 protocol 方法与原理大全
免疫组化（SP 法） 第一天 (5h)准备：60℃ 烘片2-4h1. 二甲苯脱蜡1 30min2. 二甲苯脱蜡2 30min3. 100% 乙醇 10min 2次4. 95% 乙醇 3min5. 85% 乙醇 3min6. 75% 乙醇 3min7. ddH 20 1min 2次 轻晃以防掉片8. 抗原修复：使用1L 烧杯，9ml 柠檬酸（0.1M 现配）溶液和41ml 柠檬酸钠（0.1M ）加450ml ddH 20（ph=6）罩上锡纸，封烧杯口，扎洞若干，煮沸20min （可先煮沸再放片子，也可以先放片子再一起煮，温度先调至420℃多，煮沸后调到250℃左右，计时15-20min ）之后自然冷却（30-40℃） 9ml 柠檬酸配法：9ml ddH 20加0.18g 柠檬酸。
可以直接称取0.18g 柠檬酸加41ml 柠檬酸钠加450ml 水0.1M 柠檬酸钠配法：29.41g 柠檬酸钠加入1L 蒸馏水中，或14.7g 加入500ml 蒸馏水中9. 3%H 202孵育10min （200ml，盒子装，现配，用甲醇稀释30%H 202至3%H202）以消除内源性过氧化物酶活性（内源性过氧化物酶能与HRP 反应，造成假阳性），PBS 冲洗3min 3次10. 加试剂A （山羊血清，起到封闭作用）一滴（蓝色）室温孵育10-15min 盖盖防干，倾去勿洗，先甩再擦（试剂A,B,C 放在1号冰箱侧门，擦干玻片，放在湿盒里，盒子两侧不要放玻片，以防接触到盒壁，抗体流出，要求试剂刚好覆盖组织，全部滴完计时10min ，用黄枪头抹匀试剂）11. 加一抗，4℃过夜，25-50ul 每个组织，一抗用PBS 稀释，4℃放置，加完一抗后，先不要盖盖，放到冰箱里后再盖盖第二天(3h)12.PBS 3min 3次（将1xPBS倒进盒子里，里面放架子，片子甩干后放进架子里）13.加试剂B（黄色）室温孵育10-15min，盖盖（试剂B是生物素化的二抗，能与一抗结合）14.PBS 3min 3次15.加试剂C（橙黄色）室温孵育10-15min，盖盖（试剂C是HRP标记的链霉亲和素，一个亲和素可以与四个生物素非共价键结合，不可逆，结合紧密。
常用免疫组化染色方法SP法免疫组化染色
常用免疫组化染色方法SP法免疫组化染色1. 原理：链霉素抗生物素蛋白（SA）是从链霉素中分离出的蛋白质，穿透组织的能力比ABC、PAP复合物大，反应速度快，它含有四个亚基，每个亚基都有与生物素（Biotin）连接的部位，且二者间有极强的亲和力，SA的等电位接近于6.5，近中性，而卵白素（Avidin）为10，因此，SA几乎不与组织中的内源性凝集样物质发生非特异性结合，使用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶放大系统，即可产生低背景、高放大效果。
S-P采用生物素标记的第二抗体与链霉素抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原。
2. 基本染色方法：（1）石蜡切片脱蜡至水。
（2）3%H202室温孵育5～10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
（3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
（4）5～10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1～2小时或4℃过夜。
（5）PBS冲洗，5分钟×3次。
（6）滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10～30分钟; 或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10～30分钟。
（7）PBS冲洗，5分钟×3次。
（8）滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS 稀释)，37℃孵育10～30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10～30分钟。
（9）PBS冲洗，5分钟×3次。
（10）显色剂显色（DAB或AEC）。
（11）自来水充分冲洗，复染，封片。
（附，冰冻切片免疫组化染色步骤：冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。
用3%过氧化氢孵育5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×2次。
免疫组织化学染色SP技术课件
实验名称
链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法
(Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简称S-P法)
检测胃癌组织CK／Vimentin的蛋白表达
武汉大学病理教研室
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
S-P法原理示意图
链酶亲和素 生物素化二抗
过氧化物酶 生物素
待测抗原
特异性一抗
武汉大学病理教研室
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免疫组织化学基本实验流程
组织、细胞标本
抗原修复
滴加二抗
滴加特异性一抗
阻断内源性过 氧化物酶
正常血清封闭
滴加三抗
显色
复染
封片 武汉大学病理教研室
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具体步骤如下： 1．石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 2．所有组织均采用微波修复抗原； 3．室温冷却后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 4．滴加50μl过氧化物酶阻断液（试剂A），37℃湿盒 孵育 10min； 5．0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 6．滴加非免疫性动物血清（试剂B），37℃湿盒孵育 10min；
实验流程中的注意事项
内源性过氧化物酶的灭活 血清封闭 冲洗 抗体选择及一抗孵育时间 检测及显色系统 复染
武汉大学病理教研室
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染色前处理 －取材、脱水、浸蜡
组织及时固定
固定剂选择：10%中性缓冲福尔马林 4%多聚甲醛
常规下固定8-24小时 取材厚度：2mm
（迈新）；或60℃过夜
免疫组化SP方法
免疫组化实验方法免疫组化步骤：1、取材：取实验组和对照组动物组织尽可能新鲜，PBS洗，取小于0.5cm×0.5cm×0.1cm组织块；2、固定和包埋：用4%多聚甲醛进行固定，经70%乙醇30分钟、80%乙醇30分钟、90%乙醇30分钟两次、95%乙醇30分钟两次、100%乙醇30分钟两次、二甲苯透明15分钟两次、55℃石蜡中1小时三次，用不锈钢模具包埋组织块；3、切片：将厚度5um的组织切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，60℃过夜；4、脱蜡、入水：将切片浸于二甲苯中5分钟两次、100%乙醇5分钟两次、95%乙醇5分钟两次、90%乙醇5分钟两次、85%乙醇5分钟次、70%乙醇5分钟两次，自来水冲洗，PBS洗两次；5、抗原修复:柠檬酸缓冲液，热修复20分钟， PBS洗3次×5分钟；6、3%双氧水,室温10分钟, PBS洗3次×5分钟；7、切片上滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。
甩去多余液体，不洗；8、切片上滴加第一抗体，4℃过夜，PBS洗3次×5分钟；9、切片上滴加生物素化第二抗体（IgG），37℃20分钟，PBS洗3次×5分钟；10、切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP），37℃20分钟，PBS洗3次×5分钟；11、DAB显色：使用DAB显色试剂盒1ml蒸馏水加显色剂A、B、C各一滴，混匀，加至标本上，显色6分钟，充分水洗；12、复染：苏木素1分钟，充分水洗，1%盐酸酒精分化，1%胺水反蓝，充分水洗；13、封片：经70%乙醇5分钟、80%乙醇5分钟、90%乙醇5分钟两次、95%乙醇5分钟两次、100%乙醇5分钟两次脱水、二甲苯透明5分钟两次、中性树脂封片；14、显微镜观察：选择实验组和对照组的阳性组织相、进行400×的显微照相。
15、图像分析：选择有意义的组织相，经登录、编号、采集、分析、读取数据、最后存盘。
免疫组化各步原理
一、免疫组化技术免疫组织化学（Immunohistochemistry; IHC）技术是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。
目前，这种技术在临床病理诊断和形态学研究中已得到广泛应用。
Slide 3:（一）、免疫组化常用染色方法和步骤（石蜡切片）SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）:SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）原理采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。
主要步骤:主要步骤1、石蜡切片脱蜡（与常规HE切片脱蜡相同）：石蜡切片置60 ℃烤箱烤片15小时以上→从烤箱中拿出立即放入二甲苯Ⅰ中5~10 min→二甲苯Ⅱ5~10min →无水乙醇5min →95%乙醇5min →80%乙醇5min →70%乙醇5min →自来水洗Slide 6:2、3%H2O2阻断20min（以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；PBS 洗3次，每次5min。
3、抗原修复；PBS洗3次，每次5min。
4、滴加5~10%正常山羊血清封闭，37℃, 10min (消除背景非特异性着色)Slide 7:5、吸干组织周围多余的血清，不洗，滴加第一抗体，37℃,孵育60min或孵育30min再4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次5min 。
6、擦干组织周围PBS，滴加生物素标记的第二抗体，37℃, 孵育20min，PBS洗3次，每次5min。
Slide 8:7、擦干组织周围PBS，滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液37℃, 孵育20min。
8、PBS洗3次，每次5min，D.W洗2次，DAB显色(DAB必须现用现配)，镜下控制显色程度，自来水冲洗，苏木素复染胞核，烤干，中性树胶封片。
染色步骤:染色步骤石蜡切片脱蜡到水；3%H2O2阻断10min（以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；蒸馏水洗2次，PBS洗3次，每次5min。
免疫组化(SP法)原理步骤及试剂
免疫组化原理步骤及试剂原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来,以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体(第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合,形成抗原—一抗—二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的,因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）.通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分,在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物,从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量.组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术.它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显微镜下观察.当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光,从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。
2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物,生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。
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免疫组化原理步骤及试剂原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取岀来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发岀一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。
2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。
免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生岀了多种标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属PAP法（过氧化物酶-抗过氧化物酶）、ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物）SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）、即用型二步法（聚合物链接）等。
3、免疫胶体金技术免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。
胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。
因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。
由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。
由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。
如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。
4、免疫铁蛋白法5、放射免疫自显影法标本1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片操作步骤①石蜡切片制作1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定12h2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，70%酒精1天，80%酒精过夜，95%酒精3h，无水酒精（I）、（H）各2h3、透明：1:1无水酒精二甲苯45min，二甲苯（I）、（U）各30min4、包埋：（恒温箱内进行）浸入石蜡，1:1二甲苯石蜡（58 C）45min，石蜡（I）、（H）、（山）共2.5h，用石蜡（山）包埋组织5、切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5-7 gm，的石蜡带6、贴片：将组织石蜡块在50 C温水中展片，然后用处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上（洗片：1%HCI浸泡过夜、蒸馏水冲洗、95%酒精浸泡2h后擦干 -涂胶：防脱剂多聚赖氨酸）7、烤片：68 C恒温箱内烤片2h②SP三步法1、脱蜡：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60min，或60 C恒温箱中烘烤20min，后用二甲苯（I）、（且）浸泡，共25min2、水化：无水酒精（I）、（U）各2min，下行至95%、80%、70%酒精（I）（U）各2min3、PBS冲洗2-3次，每次5min4、阻断：3%H 2O2去离子水（或80%甲醇）孵育10min，以灭活内源性过氧化物酶活性5、PBS冲洗2-3次，每次5min6、抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0 ）中用煮沸（95 C，15-20min ），自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温7、PBS冲洗2-3次，每次5min8、封闭：滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20min，甩去多余液体9、滴加I抗50讪，室温静置1h，或者37 C 1h，或者4 C过夜（需在37 C复温45min ）10、P BS冲洗2-3次，每次5min11、滴加辣根过氧化物酶标记的H抗40〜50 g，室温静置1h，或37 C 1h12、P BS冲洗2-3次，每次5min13、滴加SP （链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37 C孵育30min-1h14、P BS冲洗2-3次，每次5min15、显色：DAB显色5-10min，在显微镜下掌握染色程度（胞浆呈棕色者判定为阳性细胞）（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B,摇匀，再加1滴显色剂C,摇匀）（A : DAB B：H2O2 C:磷酸缓冲液）16、自来水冲洗10分钟终止反应17、复染：苏木精复染2min，盐酸酒精分化18、自来水冲洗10-15min19、常规脱水、透明、封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上）、镜检③结果分析：每张切片选择5个高倍镜视野（400X ），应用图像分析系统进行定量灰度扫描后进行分析。
试剂、设备：1、PBS : 0.01M 磷酸盐缓冲液（pH7.4）配制--取NaCI 8g ，KCI 0.2g，Na2HPO 4?12H 2O 3.63g 或Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，溶于900ml 双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，常温保存备用。
2、固定液：4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（pH7.4）配制-a.0.1M磷酸盐缓冲液：取A液400ml与B液80ml混合后，调pH于7.4，再定容至500mlA 液：0.1mol/L Na 2HPO4 （Na 2HPO 4?12H 20 35.8g 加水定容至1000ml ）B 液：0.1mol/L NaH 2PO4 （NaH 2PO 4?2H 2O 15.6g 加水定容至1000ml ）b.4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液：取20g多聚甲醛溶于500ml 0.1M 磷酸盐缓冲液中，加热并搅拌约2-3h后溶解3、梯度酒精：100%、95%、80%、70%、50%4、二甲苯5、包埋剂：石蜡6、防脱剂：多聚赖氨酸（PLL5g+蒸馏水1000ml ）、APES （3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷）7、抗原修复液：0.01M 枸橼酸缓冲液（PH 6.0 ），或0.01M 柠檬酸盐缓冲液（pH6.0 ）配制--取A液8ml与B液42ml混合后加水至400ml，调pH于6.0，再定容至500mlA 液：0.1mol/L 柠檬酸（C6H8O7?H2O 21.01g 加水定容至1000ml ）B 液：0.1mol/L 柠檬酸钠（Na 3C6H5O7?2H2O 29.41g 加水定容至1000ml ）8、SP超敏免疫组化试剂盒（包括试剂A、B、C、D）试剂A --阻断剂：3%甲醇-H 2O2溶液（30%H 2O2和80%甲醇溶液配制）试剂B --封闭液：正常非免疫动物血清试剂C --二抗（辣根过氧化物酶标记）试剂D -- SP （链霉亲和素-过氧化物酶）9、一抗（特异结合底物）10、显色剂：DAB试剂盒、苏木素染液11、封固液：中性树胶，或50%缓冲甘油，或液体石蜡等12、恒温箱（水浴锅）、冰箱、切片机、载玻片和盖玻片、高压锅或微波炉、染色缸、显微镜、计算机图像分析系统附：EDTA (乙二胺四乙酸)：即依地酸钠钙，是钙离子络合剂、洗涤剂、血液抗凝剂常用固定液1、醛类固定剂：作用是使组织之间相互交联，将抗原保存在原位。
(1)3% 中性甲醛固定液液：30% 甲醛10ml, 0.01mol/L PH 7.4 PBS 90ml(2)24%多聚甲醛缓冲液：40g多聚甲醛溶于0.1mol/L PBS 500ml ，加热搅拌(注意不要沸腾)至溶液清亮后，室温下冷却后加PBS，使总容量为1000ml(3)戊二醛—多聚甲醛缓冲液：在上述溶液中加入1 %的戊二醛(4)Bouin液：40 %甲醛250ml，冰醋酸50ml,饱和苦味酸750ml.(5)PLP液(过碘酸—赖氨酸—多聚甲醛固定液)2、丙酮及醇类固定剂：原理是使组织中的蛋白质和糖类沉淀(1)AAA液：纯酒精85ml，冰醋酸5ml，浓甲醛10ml(2)Clzrke液：纯酒精95ml，冰醋酸5ml多用于冰冻切片的后固定(3)Carnoy液：纯酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，多用于癌基因蛋白，抗癌基因蛋白等抗原的固定保存(4)丙酮：常用于冰冻切片和细胞涂片的后固定，用前在 4 °C冰箱预冷，切片在冷丙酮中固定5~ 10min3、其他固定剂(1) Zenker液：适合免疫球蛋白抗原的检测(2 )四氯化锇液：是电镜研究中所必需的固定液抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片，原因： a.福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭；b.甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖，这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好是进行反应。
①抗原热修复(1)高压热修复：在沸水中加入0.5mol/L EDTA 缓冲液(pH8.0 )或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0 )。
盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。
将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。
本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
(2)煮沸热修复：电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0 )至95 C左右，放入组织芯片加热10-15分钟。
(3)微波热修复：在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0 )至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。
适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos ，X-jun ，C-kit ，C-myc ，E-cadherin ，Chromogranin A ，Cyclin ，ER，Heat shockprotein ，HPV，Ki-67，MDMZ ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein ，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，Topoismerase U 等。