实验五过氧化物同工酶PAG讲义E分析
实验五 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
实验五聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶一、目的同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
研究表明，植物在发育过程中，所含同工酶的种类和比例都不相同，它们与植物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定关系，因此作为基因表达的产物，测定同工酶谱是认识基因存在和表达的一种工具，在植物的种群、发育及杂交遗传的研究中有重要的意义。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化，测定这种酶的活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
利用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便，灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验要掌握电泳技术的原理、方法、装置、凝胶配制等知识，熟悉主要的操作过程，同时对同工酶有一个感性的认识。
二、原理1．电泳带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
近几十年来，电泳作为一项有效的分析、分离和制备技术发展很快，在生产、科研和医疗工作中得到了广泛应用。
用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。
2．影响电泳的主要因素若将带净电荷q的粒子放入电场，则该粒子所受到的引力F引可用数学式表示如下：F引＝E·q（1）式中E为电场强度，单位为“v/cm”，表示电场中单位距离上的电位差。
如果这种情况发生在真空中，则带电粒子会朝着电极加速前进并且最后与电极相撞。
但在溶液中，由于电场的牵引力F引与加速运动的粒子和溶液之间产生的阻力（即摩擦力）F阻相对抗。
故上述现象不会发生。
根据Stokes公式，阻力的大小取决于粒子的大小和形状以及所在介质的粘度：F阻＝6πrηv (2)式中F阻是球形粒子所受的阻力，r是球形粒子的半径，η是溶液的粘度，v是粒子移动的速度。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶temp
电荷因素 蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同 分子大小 蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同 分子形状 蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同
聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应: 1) 浓缩效应、2) 电荷效应、3) 分子筛效应
电泳过程示意图
A为电泳前3层凝胶排列顺。B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢 离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。
TEMED 丙烯酰胺 + 甲叉双丙烯酰胺------------------聚丙烯酰胺凝胶 Ap (三维网状结构)
AP-TMTED催化体系
TEMED催化AP生成硫酸自由基：
S2O82－
¯ 2SO4·
硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：
Bis将单体长链间连成网状结构：
通过改变凝 胶浓度及交 联度来调节 凝胶的孔径， 具有良好的 分子筛效应。
二、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶 垂直板电泳 不连续系统 分离因素
1、聚丙烯酰胺凝胶 作为电泳的支持物
•聚丙烯酰胺凝胶 是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉 双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)和加速剂 N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合交联而成 的三维网状结构的凝胶。
3、样品的制备
过氧化物酶的提取：称 取1g水稻种子置于冰浴 上的研钵内，加入1ml样 品提取液(内含 pH6.8 、 0.05mol/L Tris－HCl， 20%蔗糖)研成匀浆后， 再加2ml提取液研磨均匀， 转入离心管，于3500rpm 离心15min，其上清液即 为酶的提取液，供电泳 分析用。
6、剥胶、染色
实验五过氧化物同工酶PAGE分析
成分
含量
作用
A液（30%Acr-0.8%Bis） 2.65mL
交联剂
B液（Tris+EDTA） 4.75mL
缓冲液
C液（TEMED）
10μL
加速剂
D液（10% AP）
50μL
催化剂
四、操作步骤
样品制备 称取小麦幼苗叶片0.5 克，放入研钵内，
加 pH8.0 样品提取液1mL，于冰浴中研 成匀浆，转入离心管，在高速离心机上以 8000rpm 离心 10 分钟，倒出上清液， 以等量 40%蔗糖混合，并加2滴溴酚蓝， 即为样品液。
同功酶是机体调节酶活性的一种方式，在各种生物体中 广泛存在。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。 它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。 在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此， 测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某 一时期植物体内代谢的变化。
（二）过氧化物同工酶及其活性染色（P98）
三、材料、仪器和试剂
试剂：
A液：30%Acr-0.8%Bis B液：Tris+EDTA C液：TEMED D液：10%AP 电极缓冲液：硼酸钠-硼酸（pH8.3） 0.5%溴酚蓝 染色液：0.1%联苯胺 样品提取液：pH8.0Tris-HCl缓冲液 40%蔗糖溶液
四、操作步骤
凝胶制备
四、操作步骤
装槽、上样
30-50μL
四、操作步骤
电泳 接好电源线(上槽接负极，下槽接正极)。
打开电源开关，调节电压，以10V/cm稳 定电压电泳，待前沿指示染料溴酚蓝下行 至距胶板末端1-2 厘米处，即可停止电泳。
四、操作步骤
剥胶、染色
过氧化物酶同工酶电泳分析(经典有用)
过氧化物酶同工酶电泳分析实验原理（1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。
上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。
（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。
本实验采用碱性系统。
电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。
而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。
（3）在电场中形成不连续的电位梯度。
在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。
下面以本实验要分离的小麦苗过氧化物酶同工酶为例，分别说明三种效应的作用：（1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。
（2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快；反之，分子量大、形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。
这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。
（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。
其原因如下：①由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。
使得在该界面处的待分离酶蛋白区带变窄，浓度升高。
②在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶为pH 6.7，下层分离胶为pH 8.9。
HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl－布满整个胶板。
待分离的酶蛋白样品加在样品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸缓冲液中。
电泳一开始，有效泳动率最大的Cl－迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。
在pH6.7条件下解离度仅有0.1～1％的甘氨酸（pI = 6.0 ）有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。
这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。
在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。
分离过氧化物同工酶
同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶 蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组 酶。研究表明，植物在发育过程中，所含同 工酶的种类和比例都不相同，它们与植物的 遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一 定关系，因此作为基因表达的产物，测定同 工酶谱是认识基因存在和表达的一种工具， 在植物的种群、发育及杂交遗传的研究中有 重要的意义。
4、电泳 加样，连接电极线，电泳。 5、剥胶，染色，记录结果
聚丙烯酰胺凝胶
丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联 剂N，N‘-甲叉双丙烯酰胺（N,N’-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚 合而成的 聚合:化学法—过硫酸铵-TEMED 光化学法—核黄素-TEMED 光聚合形成的凝胶孔径较大 聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决 定
2、分别制备分离胶、浓缩胶
在玻璃板做记号，取专用小烧杯，按分离胶取样表加试剂，混匀后沿长玻 璃板小心加到玻璃板之间（避免产生气泡），加至记号处，立即覆盖 2～3mm的水层，静置待聚合（约40min），当胶与水层的界面出现时表 明胶已聚合。按浓缩胶取样表加试剂，倒掉分离胶上的水层，立即加入 浓缩胶，插入梳子（即样品槽模板），待胶凝后，小心取出梳子。将稀 释10倍的电极缓冲液倒入两槽中，前槽（短板侧）缓冲液要求没过样品 槽，后槽（长板侧）缓冲液要求没过电极，备用。
■ 凝胶的聚合：
聚合反应
free radical
Bis Bis
顶点自由基 可再延续
自由基形成
催化系统
聚合作用只有在自由基存在时才能发生，需要一个催化 诱发剂系统产生自由基 化学聚合 过硫酸铵—TEMED（四甲基乙二胺） 孔径较小，用于制备分离胶 影响聚合：低pH，氧分子，一些金属离子，低温 光聚合 核黄素—TEMED 需要有痕量氧存在 ，直接日光或室内强散射光 孔径较大，用于制备浓缩胶胶
烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶实验八聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶一、实验目的１学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
２掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板（及同盘）电泳的操作技术。
３掌握同工酶定义、理化性质的差异，了解过氧化物酶的染色原理。
４掌握过氧化物酶的活性的测定。
二实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂（即共聚体的N,N －甲叉双丙烯酰胺Bis）在加速剂（N,N,N',N'－四甲基乙二胺TEMED）和催化剂（过硫酸胺(NH4)4S2O8 简称AP）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。
（一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性１聚合反应聚丙烯酰胺是由Acr和Bis在催化剂（AP）或核黄素（C17H20O6N4）和加速剂（TEMDA）的作用下聚合而成的三维网状结构。
催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有２种催化体系：①AP-TEMED 属化学聚合作用②核黄素－TEMED 属光聚合作用２凝胶孔径的可调性及其相关性质①凝胶性能与总浓度及交联度的关系凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比： a:b<10 脆硬乳白交联度： a:b>100糊状易断②凝胶浓度与孔径的关系T（Acr和Bis总浓度）增加孔径减小移动颗粒穿过网孔阻力增加③凝胶浓度与被分离物分子量的关系分子量增加阻力增加移动速度减慢。
同时还与分子形状及分子电荷有关系。
在操作时，可以选用凝胶。
因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得满意的结果。
３试剂对凝胶聚合的影响水中金属离子或其他成分对凝胶电泳的电泳速度、分离效果等有影响。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理根据有无浓缩效应可分为：连续系统：电泳体系中由于缓冲液PH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中主要靠电荷及分子筛效应。
不连续系统：电泳体系中由于缓冲液离子成分、PH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还有浓缩效应。
实验五、细胞内过氧化物酶的显示
• （二）方法 • 1．用注射器从鱼尾柄血管抽取血液。 • 2．将一滴血滴于载玻片一端，用另一玻片或30 度倾斜推血涂片，待其稍干。 • 3．将涂片放入0.5％硫酸铜中浸30秒-1分钟。 • 4．倾去硫酸铜水液，直接放入联苯胺混合液中反 应6分钟。 • 5．蒸馏水冲洗，室温晾干。 • 7．镜检或封片后镜检。
• （三）结果
?细胞内的过氧化物酶能把许多胺类氧化为有色化合物用联苯胺处理标本细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色的联的过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝进而变为棕色产物因而可以根据颜色反应来判定过氧化物酶的有无或多少
实验五、细胞内过氧化物酶的显示 实验目的：通过实验学习，显示过氧化物酶的细胞 化学方法，了解过氧化物酶在鱼血白血球中的分布 及形态。
• 实验原理： • 细胞内的过氧化物酶能把许多胺类氧化为 有色化合物，用联苯胺处理标本，细胞内 的过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色的联 苯胺蓝，进而变为棕色产物，因而可以根 据颜色反应来判定过氧化物酶的有无或多 少。
• 中间产物蓝色联苯胺是不稳定的，无需酶 的参加即可氧化为棕色化合物。 • 实验仪器及设备：联苯胺混合液配法：0.2克联苯胺 加100毫升蒸馏水再加3%双氧水2滴。
过氧化物酶同工酶含量测定
实验材料与器材
（一）材料 菠菜叶片（或苜蓿种子）
（二）仪器设备 722分光光度计 烧杯 量筒 移液管 具塞刻度试管
实验试剂
1．标准蛋白溶液：100μg/ ml牛血清白蛋白：称取牛血清白 蛋白25 mg，定容到100ml，取40ml该溶 液定溶到100ml。
2．考马斯亮蓝G-250：称取50 mg考马斯亮蓝G-250，溶于 25ml 95%的乙醇中，加50ml 85%的 磷酸定容到500ml，贮存于棕色试剂 瓶中，常温下可以保存一个月。
实验步骤
（一）标准曲线的绘制 取6支具塞刻度试管，按下表依次加入标准蛋白，向
各管中加入考马斯亮蓝G-250溶液5ml，摇匀，放置5min 左右，用1cm的比色皿在595nm处测定吸光值，以蛋白的 浓度作横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
表 绘制标准曲线各试剂加入量
管号
1
2
3
4
5
6
标准蛋白质（ml）
考马斯亮蓝G-250（coomassie brilliant blue G-250）与
蛋白质的结合十分迅速，2min左右即可达到平衡，其结合物 在室温下1小时内保持稳定。此法灵敏度高，易于操作，干 扰物较少，是一种比较好的定量方法。其缺点是在蛋白质浓 度太高时线形偏低，且不同来源蛋白质与色素的结合状况有 一定差别。
实验原理 实验材料与器材 实验试剂coomassie brilliant blueG-250）测 定蛋白质酶含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态 下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区域结合后变 为青色，前者最大吸收值在465nm，后者在595nm。在一定 蛋白质浓度范围内（1～1000μg），蛋白质与色素结合后在 595nm吸光值的大小与蛋白质的浓度呈正比，故可用于蛋白 质的定量测定。
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五、结果与分析
结果 电泳图或模式图
分析 过氧化物同工酶的种类及活力大小
THANK YOU
本实验采用PAGE技术，分离小麦幼苗过氧化物 酶同工酶，根据酶的生物化学反应，通过染色方 法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化 物酶同工酶。
H2O2
过氧化物+过氧化物酶 → 复合物
复合物+DH2 → 过氧化物酶 +H2O+联D苯胺
棕色物质
三、材料、仪器和试剂
材料：小麦幼苗
仪器：电泳仪、 电泳槽、高速离 心机、量筒、烧 杯、微量注射器、 研钵、染色盒
浓缩效应：凝胶为不连续系统（凝胶层、pH、 电位梯度均不连续），从而使样品浓缩在一个 极窄的起始区带，即所谓浓缩效应，提高了条 带分辩率。（只有不连续凝胶具有此效应）
（二）过氧化物同工酶及其活性染色（P98）
同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的 分子结构及其理化性质不同的一组酶。
三、材料、仪器和试剂
试剂：
A液：30%Acr-0.8%Bis B液：Tris+EDTA C液：TEMED D液：10%AP 电极缓冲液：硼酸钠-硼酸（pH8.3） 0.5%溴酚蓝 染色液：0.1%联苯胺 样品提取液：pH8.0Tris-HCl缓冲液 40%蔗糖溶液
四、操作步骤
凝胶制备
—
○+
○-
+
○-
○+
（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
2.电泳分类 显微电泳 自由界面电泳 区带电泳
– 纸电泳 – 醋酸薄膜电泳 – 琼脂糖凝胶电泳 – 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
3.电泳法原理
在一定条件下，任何带点颗粒都有自己特定的 电泳迁移率。影响电泳迁移率的因素： 颗粒性质：
实验五过氧化物同工酶PAGE分析
一、目的
掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术 的原理和操作方法
掌握PAGE法分离过氧化物同工酶的原理 和方法
二、原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 过氧化物同工酶及活性染色
（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） P20
1.电泳概念
电泳：带电粒子在电场中向与其电性 相反的电极移动的现象。
聚丙烯酰胺凝胶配方
成分
含量
作用
A液（30%Acr-0.8%Bis） 2.65mL
交联剂
B液（Tris+EDTA） 4.75mL
缓冲液
C液（TEMED）
10μL
加速剂
D液（10% AP）
50μL
催化剂
四、操作步骤
样品制备 称取小麦幼苗叶片0.5 克，放入研钵内，
加 pH8.0 样品提取液1mL，于冰浴中研 成匀浆，转入离心管，在高速离心机上以 8000rpm 离心 10 分钟，倒出上清液， 以等量 40%蔗糖混合，并加2滴溴酚蓝， 即为样品液。
反应过程
TEMED催化AP生成硫酸自由基
S2O82－
2SO4·¯
硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体 长链：
Bis将单体长链间连成网状结构：
PAGE法分离蛋白质的三种效应
电荷效应：各种蛋白质分子所带电荷不同，在 同一电场中泳动率不同；
分子筛效应；蛋白质分子大小和形状各不相同， 在通过一定浓度（一定孔径）凝胶时受阻力各 不相同，泳动率也不相同；
– 净电荷数目 – 颗粒大小 – 颗粒形状
电场强度：V/cm 溶液性质：
– 缓冲液的pH – 离子强度 – 溶液黏度 – 电渗：液体对固体支持物的相对移动
（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
4.聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联 剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）和催化剂过硫 酸铵（AP）的作用下聚合交联成三维网状结构的 凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝 胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis， 简称PAGE)
四、操作步骤
装槽、上样
30-50μL
四、操作步骤
电泳 接好电源线(上槽接负极，下槽接正极)。
打开电源开关，调节电压，以10V/cm稳 定电压电泳，待前沿指示染料溴酚蓝下行 至距胶板末端1-2 厘米处，即可停止电泳。
四、操作步骤
剥胶、染色
电泳结束之后，将垂直板从电泳槽上取 下，小心地将两块玻璃板分开，并小心地 将凝胶置于染色盒中，进行染色反应，染 色10min，用蒸馏水漂洗1-2次。
同功酶是机体调节酶活性的一种方式，在各种生物体中 广泛存在。
过氧ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。 它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。 在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此， 测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某 一时期植物体内代谢的变化。
（二）过氧化物同工酶及其活性染色（P98）