第六章微生物发酵

2013-7-14
• 发酵液pH变化是菌体代谢的综合结果，从代谢 曲线的pH值变化可以推测发酵罐中各种生化反
应的进展和pH变化异常的可能原因。
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例： 配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况
pH对产海藻酸裂解酶的影响
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异亮氨酸发酵
不同pH控制方式对目的突变株ISw330异亮氨酸摇瓶发酵 的影响，结果如图所示。 “1”表示只加CaC03控制pH值， “2”表示只加尿素控制，“3”表示CaC03和尿素联合控制pH 2013-7-14 值。
注意： ●实际上，呼吸临界氧值不一定与产物合成临界氧值相同。 ●生物合成临界氧浓度并不等于其最适氧浓度。 ●在培养过程中是不是维持溶氧越高越好？
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• 初级代谢的氨基酸发酵，需氧量的大小与氨基酸 的合成途径相关。据需氧要求可分为三类： • 第一类有谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(G1n)、精氨酸
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⑵ 根据培养条件选择
• 温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。 • 通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降 低些，溶氧浓度也可髙些。 • 培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养 利用快，会使菌过早自溶。
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⑶ 根据菌生长情况 • 菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生
6.7-7.3
6.2-6.5
四环素 碱性脂肪酶
6.1-6.6 6.5-7.0
5.9-6.3 6.8-7.4
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二、发酵过程中影响发酵液pH变化的因素
引起发酵液pH下降的因素有： 1、培养基碳、氮比例不合适，碳源过多，特别是葡 萄糖过量或者中间补糖过多，溶解氧不足，使有机酸 大量积累而pH下降。 2、消泡剂（油）加量过多。 3、生理酸性物质的存在，氨被利用。 引起发酵液pH下降的因素有： 1、培养基碳、氮比不当，氮源过多，氨基氮释放； 2、生理碱性物质存在； 3、中间补料中氨水或尿素等碱性物质量过多。
一、溶氧控制的意义 微生物只能利用溶解于液体中的氧。溶氧(DO) 是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中有多方面 的限制因素，而溶氧往往是最易成为控制因素。 氧是一种难溶于水的气体。在25℃，1×105 Pa条件下，空气中的氧在纯水中溶解度 0.25mmol/L。在28℃氧在在发酵液中的溶解度只 有0.22 mmol/L。
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利福霉素发酵 时，pH选择试 验结果。
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pH的控制
• 通过中间补料控制合适的pH，采用补料的方法，可
以同时实现补充营养、延长发酵周期、调节pH和培 养液特性。
• 青霉素发酵中，通过调节补糖速率控制pH，比用恒
速加糖，pH由酸碱控制提高青霉素产量25％。
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影响溶氧系数KL a 的因素
1、搅拌： （1）增加气液接触面积（打碎气泡），增加氧传 递面积；（2）使液体形成涡流，从而延长气泡在 液体中的停留时间；（3）增加液体的湍流程度， 降低气泡周围的液膜阻力，从而增加KL a值；（4） 减少菌丝结团，降低细胞壁表面的液膜阻力。
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三、发酵过程中pH选择与控制
• 选择原则：既有利于菌体的生长繁殖，又最 大限度地合成代谢产物。
μ QP μ
QP
μ QP
a μ QP
b
c pH
d
2013-7-14 pH与菌体比生长速率（μ）和产物比生产速率（Qp）之间的关系
pH 选择
• 调节发酵培养基初始pH，在发酵过程中定时测定和 调节pH，以菌体生长达到最高值的pH为菌体生长的 合适pH，以产物合成达到最高值为产物合成合适的 pH。 • 利福霉素发酵，当pH7.0时，平均得率系数最大， 从经济角度考虑各种参数，平均得率系数最重要， 故pH7.0是生产利福霉素B的最佳条件。
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第二节 pH对发酵的影响和控制
一、pH值对菌体生长和代谢产物合成的影响
• 菌种不同，对pH要求不同
• 菌种相同，pH不同，形成的产物不同
• 菌种生成和发酵的最适pH不同，形成的产物不同
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第二节 pH对发酵的影响和控制 pH对微生物生长和产物合成影响的原因：
1.影响细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性， 影响营养物质吸收和代谢产物分泌； 2.影响酶的活性，阻碍菌体的新陈代谢； 3.影响培养基中某些组分的解离，从而影响吸收；
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溶氧作为发酵异常的指标
• 生长过程从培养液中溶氧浓度的变化可以反映菌 的生长生理状况。 • 发酵溶氧变化异常，可及时预告生产可能出现的 问题。
• 溶氧异常下降，原因？⑴ 、⑵、⑶ • 溶氧迅速（一般2~5h)跌到零，并长时间不回升。 这比无菌试验发现染菌要提前几个小时。溶氧升
OTR K L a (C* CL )
式中， KLa——以浓度差为推动力的体积溶氧系数， m/h； c* ——氧在水中的饱和浓度，mmol/L； cL ——发酵液中的溶氧浓度， mmol/L。
凡是使KLa和c*增加的因素都能使发酵供氧改善。
• Kla反映了设备的供氧能力，发酵常用的设备为摇 瓶与发酵罐。
H/D太大，溶氧系数反而增加不大。一般在23之间为宜。
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6. 发酵罐体积
发酵罐体积大的氧利用率高，体积小的氧利
用率低。几何形状相同的条件下，发酵罐体积大
的氧利用率可达7-10%，而体积小的发酵罐利用
率只有3-5%。
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7、培养液的物理性质
发酵液的表面张力、粘度、离子浓度等都会 影响气体的溶解度，还影响液体的湍动以及界面 和液膜的阻力，因而影响传递效率。
响不明显；
• 第三类，有亮氨酸、濒氨酸(Val)和苯丙氨酸(Phe)，
仅在供氧受限、细胞呼吸受抑制时，才能获得最
大量的氨基酸，如果供氧充足，产物生成反而受 到抑制。
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三、供氧与微生物呼吸及代谢产物的关系
需氧方面 微生物的“需氧” 可用耗氧速率或呼吸强度来表示： 呼吸强度（respiratory strength)：单位质量的细 胞干重在单位时间的耗氧量。单位为 mmol O2/(g · 干细胞 · ，用Ｑo2表示 h) 耗氧速率（oxygen uptake rate)：指单位体积的培 养液在单位时间的耗氧量。单位为 mmol O2/(L· h)， 用r表示
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两者的关系：
r QO2 X
式中，r ——耗氧速率，mmol O2/(L· h)；
QO2——呼吸强度，mmol O2/(g· h)； X ——菌浓，g/L。
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在发酵过程中，影响耗氧的因素有以下几方面： １．培养基成分和补料 培养基的成分和浓度显著影响耗氧；培养液营养 丰富，菌体生长快，耗氧量大；发酵浓度高，耗氧 量大；发酵过程补料或补糖，微生物对氧的摄取量 随着增大。
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在微生物的培养过程中，应保持供氧与耗氧的 平衡，满足微生物对氧的利用。
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二、微生物的临界氧浓度
临界氧浓度：满足微生物呼吸的最低溶氧浓度，如 对产物而言，是不影响产物合成所允许的最低浓度。 用Ｃ临界表示。 如果溶解氧浓度低于临界值，细胞的比耗氧速 率就会大大下降，细胞处于半厌氧状态，代谢活动 受到阻碍。
2、空气的线速度
溶氧系数K Lα是随空气量的增加而增大的，当 增加通风量时，空气的线速度也就相应地增大，从 而增加了溶氧，氧传递系数K Lα相应地也增大。 但空气速度过大，则可使叶轮发生过载，即叶 轮不能分散空气，气体不经分散而沿搅拌器缓慢运 动的中心迅速上升而逸出。
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3、 空气分布管
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２．菌龄影响耗氧： 呼吸旺盛，耗氧力强，发酵后期菌体处于衰老状 态，耗氧能力自然减弱。
３．发酵条件影响耗氧：
在最适条件下发酵，耗氧量大。
发酵过程中，排除有毒代谢产物如二氧化碳、挥发性
的有机酸和过量的氨，也有利于提高菌体的摄氧量。
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供氧方面 在单位体积培养液中氧的传递速率OTR可表示为：
长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜， 如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些， 以利于菌的生长。 • 总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培 养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温 度。
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2. 温度的控制
• 设施：在发酵罐上安装夹套和蛇管，通过循环冷
却水控制。 • 冷却介质：深井水或冷冻水 • 控制方式：手动控制或自动控制
发酵液中泡沫的大量形成会使菌体与泡沫形
成稳定的乳浊液，影响到氧传递系数。
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若发酵液中溶氧保持不变，即供氧=需氧，则
K L a(c * cL ) QO2 X
使供需失去平衡的因子也会改变溶氧浓度。
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三、发酵过程溶解氧的变化
图 谷氨酸发酵时正常和异常的溶氧曲线
———正常发酵溶氧曲线； 异常发 酵溶氧曲线； 异常发酵光密度曲线
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一般好氧微生物临界溶解氧浓度很低，约为 0.003-0.05mmol/Ｌ，需氧量一般为25－100mmol/
(L· h)。其临界溶解氧浓度大约是饱和浓度的1％-25％。
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• 为避免发酵处于限氧条件下，需要考查每一种
发酵产物的临界氧浓度和最适溶氧浓度，并使
发酵过程保持在最适溶氧浓度。
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pH的控制
• 在培养液的缓冲能力不强的情况下，pH可反映菌的
生理状况，如pH上升超过最适值，意味菌处在饥饿 状态，可加糖调节，但加糖过量又会使pH下降。用 氨水中和有机酸时，过量的NH3会使微生物中毒。用 NaOH或Ca(OH)2调节pH，需注意培养基的离子强度和