生化实验知识点汇总整理
百分吸光系数：指在一定波长下，吸光物质的溶液浓度为1g/100ml，光程为1cm 时的吸光度，单位是ml/(g·cm)。
标准曲线：指通过测定一系列已知组分的标准物质的某理化性质，而得到的性质的数值曲线。
层析：指利用各组分物理性质的不同，随流动相通过固定相时分离速度不同将多组分混合物进行分离及测定的方法。
层析法：混合物中各种色素以不同的速率通过柱子，从而彼此分开。分离开的色素形成不同的色带而易于区分，由此得名为色谱法（Chromatography），又称层析法。
重组子：两个突变位点之间可发生交换产生野生型的最小单位，即不能由重组分开的基本单位。重组子另一定义是指，含有重组DNA分子的转化细胞
电泳：带电粒子在直流电场中向着所带电性相反的电极移动的现象。
电渗：电动现象之一，指在电场作用下液体(通常是水)相对于和它接触的固定的固体相作相对运动的现象。
等电点：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。（pH大于等电点时蛋白质带正电，小于带负电）
分配系数(Kd)：物质在两种不相混的溶剂中平衡时的浓度比。反映了溶质在两相中的迁移能力及分离效能是衡量溶质分子被阻滞程度的一个特征性常数
分光光度法：根据物质对光的吸收特性和吸收强度，对物质进行定性和定量的分析方法。是利用物质对某种波长的光具有选择性吸收的建立起来的鉴别物质或测定其含量的一项技术。
分子筛：狭义上讲分子筛是结晶太的硅酸盐或硅铝酸盐，由硅氧四面体通过氧桥键相连而成，广义上讲，结构中有规整而均匀的孔道，孔径为分子大小的数量级，它只允许直径比孔径小的分子进入，因此能将混合物中的分子按大小加以筛分
GOD法测定血糖：葡萄糖氧化酶（GOD）利用空气和水催化葡萄糖分子中的醛基氧化，生成葡萄糖糖酸和过氧化氢；过氧化氢经过氧化物氧化酶（POD）氧化成水和氧；氧将4-氨基安替吡啉和酚氧化成红色的醌化合物，醌和葡萄糖成正比。将醌与标准液比色，算出血糖的含量。
感受态细胞：受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。
聚丙烯酰胺凝胶浓度（T％）：每100ml凝胶溶液中含有的单体（Acr,a）和交联剂（Bis,b）总克数称为凝胶浓度，用T％表示
聚丙烯酰胺凝胶交联度（C％）：凝胶溶液中，交联剂（Bis）占单体单体（Acr）和交联剂（Bis）总量的百分数称为交联度，用C％表示
竞争性抑制：抑制剂的结构域底物结构相似或部分相似，可与底物共同竞争与酶的活性中心结合而抑制酶的活性。这种抑制使得Km增大，而Vmax不变。碱裂解法：是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA 是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
交联度：用C%表示，表示交联剂克数占凝胶总克数的百分数。交联度过高不仅凝胶变脆缺乏弹性且透明度降低交联度过低凝胶聚合不良呈糊状。
拷贝数：就是指某基因（可以是质粒）在某一生物的基因组中的个数.
空白管：即管内溶液用与样本相同的一切试剂而不含被测定的物质的试管,用以抵消或减少实验误差
Lambert-Beer定律：是光吸收的基本定律，是描述物质对单色光吸收的强弱与吸光物质的浓度和厚度间的关系的定律，公式为A=Ecl，A为吸光度，E是吸光系数，c为浓度，l为厚度。
摩尔消光系数/摩尔吸光系数：指一定波长时，溶液的浓度为1 mol/L，光程为 1cm 时的吸光度值，用ε表示，单位是L/(mol·cm)。
米氏常数（Km）：米氏常数，是酶的一个特征常数大小反映了酶与底物亲和力的强弱。
米-曼氏方程：定量地描述底物浓度与反应速率的关系。
（[S]：底物浓度V：不同[S]时的反应初速度Vmax：最大反应速度(maximum velocity) Ｋm：米氏常数(Michaelis constant) ）
酶促反应动力学：研究酶促反应速率以及各种因素对酶促反应速率影响机制的影响的科学。
酶单位：在最适反应条件下1小时完全消化1ugDNA的酶量为1个单位
凝胶层析：是指混合物随流动相流经作为固定相的凝胶层析柱时,混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术
内水体积（Vi）：层析柱中溶胀凝胶颗粒内部所含水相的总体积ml,也称内水体积，常用Vi表示
逆转录：以RNA为模板，由逆转录酶催化4种dNTP聚合，产生DNA的过程，又称为RNA指导的DNA合成。
迁移率：带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度，即载流子在电场作用下运动速度的快慢的量度，运动得越快，迁移率越大；运动得慢，迁移率小。
琼脂糖凝胶电泳：是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。琼脂糖链依分子内与分子间氢键及它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔性凝胶。
双缩脲反应：双缩脲在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应
双倒数作图法：一个酶促反应速度的倒数（1/v）对底物浓度的倒数（1/[s]）的作图。X和y轴上的截距分别代表米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）的倒数。
外水体积（Vo）：层析柱床中溶胀凝胶颗粒间隙中液体所占的体积，即空隙的总体积，也称外水体积，常用Vo表示
洗脱体积（Ve）：洗脱时间是指从加样开始到检测器检测出峰所经过的时间。在这期间内流出的洗脱液体积称为洗脱体积，常用Ve表示。
限制性内切酶：一类具有严格识别位点，并在识别位点内或者附近切割双链DNA 的脱氧核糖核酸酶。
血糖：即血液中所含的糖,通常是葡萄糖,机体能源之一。主要来源是食物中的淀粉和糖类，正常值为3.89~6.10mmol/L(70~110mg/dl)
印记术：将各种生物大分子从凝胶转移到一种固定基质上的过程称为印记术，已广泛用于DNA、RNA、蛋白质的检测。
转化：是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一
种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。
质粒DNA：质粒为环形闭合的双股DNA，存在于细胞质中，质粒编码非细菌生命所必需的某些生物学性状，如性菌毛、细菌素、毒素和耐药性等。质粒具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。
绪论
简述分光光度法原理。（5分）
分光光度法是利用物质对某种波长的光具有选择性吸收的特性建立起来的鉴别物质或测定其含量的一项技术。当一束强度为I0的单色光垂直照射某物质的溶液后,由于一部分光被体系吸收,因此透射光的强度降至I,则溶液的透光率T为I/I0。根据朗伯(Lambert)-比尔(Beer)定律，吸光度与溶液的浓度成正比，与光程成正比：A=KLC，C为该物质浓度，K为吸光系数，L为光程。
简述分光光度法的波长选择的原则。（5分）
一般是选择待测物质最大吸收峰的波长,但在实际测验中应该全面考虑①应使被测溶液有适当的光密度.②应使干扰影响降低至最低限度③应使标准曲线在尽可能大的范围内接近直线
实验一、蛋白质定量分析技术
简述标准曲线的作用及绘制要点。（5分）
作用：①标准曲线又称校正曲线或工作曲线，它是比色分析法中不可缺少的步骤。从浓度-光密度直线的直线特性，可以判断所采用方法的呈色反应是否符合Lambert-Beer定律。②做多次平行测定绘制标准曲线，可判断在整个测定过程中操作、仪器等误差的大小，从而确定该测定方法的可靠性。③从绘制标准曲线的斜率可以比较各种方法的灵敏度。④当进行大批样品分析时，可省略多次计算，从光密度值直接查阅标准曲线而求得被测物质的浓度。
作法: ①标准液浓度的选择：在制备标准曲线时，标准液浓度选择一般应能包括待测样品的可能变异最低与最高值，一般可选择5种浓度。浓度差距最好是成倍增加或等级增加，并应与被测液同样条件下显色测定。②标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读2-3次，求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的误差。
绘制要点：①用普通方格纸作图。图纸最好是正方形(长：宽=1:1)或长方形(长：宽=3 ：2)，以横轴为浓度，纵轴为光密度，一般浓度的全距占用了多少格，光密度的全距也应占用相同的格数。②绘制标准曲线时，以浓度位置向上延长，光密度位置向右延长、交点即为此坐标标点。然后，将各座标点和原点联成一条线，若符合Lambert-Beer氏定律，则系通过原点的直线。③若各点不在一直线，则可通过原点，尽可能使直线通过更多点，使不在直线上的点尽量均匀地分布在直线的两边。④标准曲线绘制完毕以后，应在座标纸上注明实验项目的名称，所使用比色计的型号和仪器编号、滤光片号码或单色光波长以及绘制的日期、室温。⑤绘制标准曲线：一般应作二次或三次以上的平行测定，重复性良好曲线方可应用。⑥绘制好的标准曲线只能供以后在相同条件下操作测定相同物质时使用。当更换仪器、移动仪器位置、调换试剂及室温有明显改变时，标准曲线需重新绘制。
双缩脲测定蛋白质浓度
原理：双缩脲在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。
方法：标准曲线法
优点：操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小；
缺点：灵敏度较差，特异性不高。-CONH2、 -CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。
注意事项：双缩脲法测定蛋白质范围为1-10mg。
BCA法测定蛋白质浓度
原理：二甲酸喹啉（BCA）与硫酸铜等试剂组成的试剂，混合在一起后颜色为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下,BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原成Cu+,一个Cu+螯合两个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿变成紫色复合物，在一定范围内，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。
优缺点:
1.操作简单，快速，45分钟内完成测定，比经典的lowry改良法快4倍且更加方便。
2.准确灵敏，试剂稳定性好，bca试剂的蛋白质测定范围是20~200ug/ml，微量bca测定范围在0.5~10ug/ml。
3.经济实用，除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量。
4.抗试剂干扰能力强，但仍受一些物质，试剂的干扰。
方法:标准曲线法
注意事项:实验操作的一般注意事项。
紫外分光光度法测定蛋白质浓度法
原理：蛋白质分子中含有具有共轭双键的罗酪氨酸，色氨酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系，故可作为蛋白质定量测量的依据。但由于各种蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，故要准确定量，必须要有待测蛋白质的标准纯品作比较，或且已经知道其消光系数作为参考。
优缺点：1.操作简便，快速，样品经稀释后，倒入比色杯即可测定2.样品不缺失，测定后可以回收，多用于纯化蛋白质的微量测定 3.主要缺点是精确度差，由于其他物质在同一紫外区又吸收以及不同蛋白质中芳香族氨基酸的含量变动过大所造成的。
方法：标准曲线法
计算：①直接根据标准曲线与待测液的光密度值或从标准曲线，求的样本蛋白质.
②利用经验公式直接计算样本蛋白质含量
吸取血清样本0.1mL置于50mL容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度，即500倍稀释，在280nm和260nm两处波长分别测得吸光度，按下列公式计算：
OD280/OD260<1.5，用L-K公式：
样本蛋白质含量（mg/ml）=1.45OD280-0.74OD260
OD280/OD260>1.5，用L-B定律计算：
样本蛋白质含量（mg/ml）=OD280/K×L=(OD280/6.3×1)×10g/L
本实验样品：牛血清白蛋白百分吸光系数=6.3[100mL/(cm.g)]
K:克分子消光系数
实验二、酶动力学分析技术
如何利用双倒数作图法求Km值？（4分）
双倒数方程为1/V=Km/Vmax × 1/[S]+1/Vmax
根据此方程,以1/V为纵坐标,1/[S]为横坐标,作图可得一直线.途中直线在1/V轴上的截距为1/Vmax,斜率为Km/Vmax.在1/[S]轴上的截距为-1/Km.因此根据直线在纵轴和横轴上的截距可求出Km
二．实验碱性磷酸酶Km值的测定：
1操作过程的注意事项和某些步骤的意义:
注意事项：
[1]底物浓度和酶浓度都对酶促反应速度产生巨大影响，故实验成功与否，在很大程度上取决于各种试剂吸取量的准确性。
[2]加入试剂以及酶后的保温时间必须非常准确。
步骤的意义：
[1]加入酶液立即计时是为了保证酶促反应时间准确。
[2]保温结束，各管立即加入碱性溶液是为了终止酶促反应同时为下一步反应提供碱性环境。2米氏常数的测定原理：
在酶促反应中，当反应体系的温度、PH及酶浓度恒定时，反应初速度随底物浓度[s]的增加而增加，最后达到极限，此速度称为最大反应速度Vmax。Michaelis 和Menten根据反应速度和底物浓度的这中关系推导出如下方程：
V=Vmax[s]/Km+[S]
称米-曼氏方程，又称米氏方程，Km为米氏常数。根据上式，当V=Vmax/2时，Km=[s].即Km为反应速度等于最大反应速度的一半时的底物浓度，Km是酶的特征常数，测定Km值是研究酶的特性的重要方法之一。
3底物浓度曲线（双矩形曲线）的作图方法及利用图解求得Km和Vmax：
由米氏方程（反应速率与底物浓度关系的数学方程式）V=Vmax[S]/(Km+[S]) [S]：底物浓度
V：不同[S]时的反应速率
Vmax ：最大反应速率
Km ：米氏常数
可得，在酶促反应中，当反应体系的温度、pH 及酶浓度恒定时，底物浓度对反应速率的影响呈矩形双曲线关系。
以[S]对A 作图，当[S]趋近于无限时，V 趋近于Vmax ，根据图估计Vmax ，取Vmax/2，所对应[S]即为Km 。
4双倒数曲线的作图方法及利用图解求得Km 和Vmax ： 米氏方程的的双曲线倒数方程：max
max 1][1/1V S v k v m +?= 根据此方程：以1/v 为纵坐标，以1/[s]为横坐标，作图可得一直线。
图中直线在1/v 轴上的截距为1/m ax v ,斜率为m k /m ax v 。在1/[s]轴上的截距为-1/m k 。因此根据直线在纵轴和横轴上的截距可以求出m ax v 和m k 。
三．实验抑制剂型别的判定：
1操作过程的注意事项和某些步骤的意义:
注意事项：
实验过程中，反应时间和试剂添加量要求精确
实验步骤意义：
添加1ml 碱液，1ml4-氨基安替吡啉，2-铁氰化钾的意义:底物被酶水解后产生游离酚和磷酸盐，酚在碱性溶液中与4-氨基安替吡啉作用，经铁氰化钾氧化，可生成红色的醌衍生物，根据红色的深浅就可测定酚的含量，从而计算出酶的活性大小。
2碱性磷酸酶活性的测定和注意事项
1原理：
酶活性可以用在一定条件下所催化的化学反应速度来表示。测定酶活力，实际上是测定酶促反应的速度。反应速度一般以在一定条件下单位时间底物的消耗量或产物的生成量来表示。
碱性磷酸酶（AKP ）活性用磷酸苯二钠法测定，即以磷酸苯二钠为底物。AKP 催化磷酸苯二钠水解产生游离酚和磷酸盐。酚在碱性溶液中与4一氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，可生成红色的醌衍生物。根据红色的深浅可测出酚的含量，进而算出相应的酶活性 (V)。再根据Lineweaver —Burk 法作图，计算其Km 值。
酶促反应速率计算
酶促反应速度以每15分钟所产生酚的微克数(μg ／15min)来表示。
根据酚标准曲线查出各管的酚含量，即各管在不同底物浓度下的反应速度。 本实验不制作酚标准曲线，而以1／[S]对1／A 作图，因各管吸光度与其酚含量成正比，故可用吸光度代表酶促反应速度。
2操作步骤
底物浓度对酶促反应速度的影响
1)取试管8支，按下表操作(应特别注意准确吸取底物溶液及酶液)：底物浓度对酶促反应速度的影响
加入酶液立即计时，混匀后置37℃水浴准确保温15min 。
2)保温结束，各管立即加入碱性溶液1ml以终止反应。
3)各管中分别加入4-氨基安替比林溶液1ml及0.5％铁氰化钾2ml，混匀，放置l0min，以第8管调零点，于510nm波长处比色，测定各管吸光度。
3注意事项
(1) 该实验的成功与否，在很大程度上取决于各种试剂(特别是底物溶液和酶液)吸液量的准确性。
(2) 加入酶液立即计时，混匀后置37℃水浴准确保温15min。精确到秒
3可逆抑制剂类型中抑制剂、底物、酶三者的相互关系及动力学特征
(1)竞争性抑制
酶不能同时和底物、抑制剂结合，既不能形成EIS，其动力学特征是：米氏常数的表观值K’m增加，酶的最大反应速度Vm不变。
(2)非竞争性抑制
抑制剂、底物都能同时和酶形成EIS，但是EIS不能进一步转变为产物，其动力学特征是：Vm降低，Km不变。
(3)反竞争性抑制
抑制剂必须在酶和底物结合以后才能和酶形成EIS，其动力学特征是：Km和Vm都降低。
竞争性抑制剂非竞争性抑制剂反竞争性抑制剂
Km增加，Vmax不变Vm降低，Km不变Km、Vm 都降低
4碱性磷酸酶抑制剂型别的判定方法
选取KH2PO4作为碱性磷酸酶的抑制物。
1、取试管8支，按下表操作(应特别注意准确吸取底物溶液、抑制剂及酶液)：
加入酶液立即计时，混匀后置37℃水浴准确保温15min。
2、保温结束，各管立即加入碱性溶液1ml以终止反应。
3、各管中分别加入4-氨基安替比林溶液1ml及0.5％铁氰化钾2ml，混匀，放置l0min，以第8管调零点，于510nm波长处比色，测定各管吸光度。
4、作图：借用米氏常数测定中的1/[S]-1/A 标准曲线图，并与其在同一张坐标纸上画出1/[S]-1/A 曲线。通过两条曲线的比较，根据直线在纵轴和横轴上的交点位置并计算其Km 值，与未加抑制时的Km 比较，判断属于何种类型。
实验三、蛋白质的分离纯化鉴定
试述从兔子肝脏中分离DNA 的原理。（5分）
在稀氯化钠（0.14 mol/L ）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。制成肝匀浆后，用0.14mol ／L 氯化钠溶液抽提，可将两种核蛋白分离，在分离过程中加入少量柠檬酸钠，可抑制脱氧核糖核酸酶对DNA 的水解作用。SDS 能使脱氧核糖核蛋白产生解聚作用，在含有脱氧核糖核蛋白的溶液中加入SDS ，DNA 即与蛋白质分离开，用氯仿将蛋白质沉淀除去，而DNA 溶解于水相，最后用冷乙醇将DNA 析出，而获得纯化的DNA 。
按分离机理简述层析分类
①吸附层析法②分配层析③离子交换层析④凝胶层析法⑤亲和层析⑥疏水层析、聚焦层析、金属螯合层析等
简述影响蛋白质电泳的因素。（5分）
1．电泳介质的pH 值：溶液的pH 值决定带电物质的解离程度，也决定物质所带净电荷的多少.对蛋白质，氨基酸等类似两性电解质，pH 值离等电点越远，粒子所带电荷越多，泳动速度越快，反之越慢
2.缓冲液的离子强度：溶液的离子强度是指溶液中各离子的摩尔浓度与离子价数平方的积的总和的1/2.带电颗粒的迁移率与离子强度的平方根成反比
3．电场强度：电场强度是指每厘米的电位梯度.电场强度对电泳速度起着正比作用，电场强度越高，带电颗粒移动速度越快
4．电渗现象：
在电场中液体对于一个固体的固定相相对移动称为电渗.在有载体的电泳中，影响电泳移动的一个重要因素是电渗。最常遇到的情况是γ-球蛋白，由原点向负极移动，这就是电渗作用所引起的倒移现象
简述SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的原理。（4分）
1/[S]
1/A
简述聚丙烯酰胺凝胶电泳高分辨的原理。（5分）
凝胶系统中存在三种效应：①浓缩效应：由于电泳速度：Cl＞蛋白质＞氨基酸，蛋白质离子夹在中间，被浓缩成一薄层②电荷效应：由于各蛋白质分子的PI不同，所带电荷不同，其迁移率也不同，各种蛋白质按迁移率的快慢顺序而分离③分子筛效应：分子量或构型不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时所受的摩擦力不同，受阻滞的程度不同，因此将不同蛋白质分子分离开来
LDH同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳中，分离胶混合液至少应包括哪些主要成份?其各自作用是什么?（5分）
①A液：分离胶缓冲液pH8.9 ②B液：分离胶单体交联剂③H2O ④1％TEMED 溶液：加速凝胶⑤1％过硫酸铵溶液：提供自由基
简述等电聚焦－聚丙烯酰胺凝胶平板电泳测定蛋白质等电点的原理。（4分）
简述不同PH条件下，蛋白质分子解离及在电场中泳动的状态。（5分）
实验四、物质代谢及调节研究
实验五、质粒DNA的提取和鉴定
简述在核酸分离实验中，0.14mol／L NaCl、5%SDS、氯仿、异戊醇、95%冷乙醇的主要作用。（5分）
①氯化钠溶液分离两种核糖核蛋白②柠檬酸钠抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的水解③SDS(十二烷基硫酸钠)能使脱氧核糖核蛋白产生解聚作用④氯仿将蛋白质沉淀除去氯仿中加入少量异戊醇能减少操作过程泡沫的产生，并有助于分相⑤冷乙醇将DNA析出。
作用：
1．溶液Ⅰ中的Tris-Cl溶液用于控制pH，EDTA是二价金属离子的螯合剂，可抑制DNase的活性，50mmol/L葡萄糖用于提高溶液的粘度，防止后续步骤中DNA的断裂.
2．溶液Ⅱ作用:SDS：破膜作用，变性蛋白质。NaOH：破膜作用，变性基因组DNA
3．溶液Ⅲ的作用：中和溶液，复性质粒DNA
1)溶液Ⅲ中含有乙酸钾和乙酸。
2)当溶液Ⅲ加入后，体系中的十二烷基硫酸钠遇到钾离子后变成不溶于水的十
二烷基硫酸钾而沉淀。这使得与十二烷基硫酸钠结合的溶液中绝大多数蛋白质也发生沉淀。同时，由于大肠埃希菌的基因组DNA很长，长长的DNA 易和蛋白质缠在一起而被十二烷基硫酸钾共沉淀。
3)溶液Ⅲ中的乙酸可中和NaOH,防止长时间的碱性条件打断DNA。
4)离心使被PDS共沉淀的绝大部分蛋白质以及缠在一起的基因组DNA因其密
度较大而沉在离心管底部实现分离.取上清液，含有质粒DNA还有少量不能完全沉淀的蛋白质，于小离心管为纯化质粒DNA做准备.
4．加入饱和酚:溶液Ⅲ并不能完全沉淀蛋白质，苯酚是极强的蛋白质变性剂，可使溶液中的蛋白质完!全!沉淀。
5．加入后离心溶液分成三层:上层为水相，有水和质粒DNA，以及微溶于水的苯酚；中层:苯酚；下层:沉淀的蛋白质
6．酚可微溶于水，而溶解在水里的痕量酚即可抑制后续的酶切反应，所以在饱和酚沉淀蛋白以后，还需氯仿萃取水相中残留的酚。
7．加无水乙醇的作用是脱水，因为乙醇和水以任意比例互溶，能将与DNA结合的水脱出，便于后面的沉淀物的干燥。
8．TE为Tris-HCl和EDTA的混合液，EDTA可以螯合金属离子和DNase，Tris-HCl可以维持一定的pH，以稳定DNA结构，将质粒保存于TE中可以比在ddH2O中药稳定得多，保存更长时间。
实验六、基因组DNA的提取和纯化
原理：基因组DNA的提取和纯化原理：细胞内存在脱氧核糖核酸以及核糖核酸。他们分别会与脱氧核糖核蛋白以及核糖核蛋白结合而存在。前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中。提取DNA则需要经过将细胞裂解，分离核蛋白与DNA以及蛋白分解，DNA的提纯纯化等步骤。SDS温和裂解细胞并使得DNA 与组蛋白分离。因为需要纯化DNA，故需要再加入RNase溶解RNA避免对结果造成影响。之后加入的蛋白酶K分解蛋白质，然后通过饱和酚以及酚氯仿进行第一次的提纯。之后用无水乙醇进行洗涤以及70%乙醇提纯。用TE缓冲液溶解DNA得到需要的DNA进行电泳。
实验七、质粒DNA的转化、重组子的筛选、凝胶中DNA的回收
简述凝胶层析的原理。（5分）
凝胶层析利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是多孔网状结构物质，分子量小的物质能进入其内部，流下时路程较长，而分子量大的物质被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质通过层析柱的快慢不同而分离。
过程：先制备感受态细胞→转化→克隆筛选
具体原理：
（一）载体：环状、具有自主DNA复制起始位点和可选择标记（如耐抗生素）的质粒ＤＮＡ。
受体细胞：一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株
（二）转化的方法1化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞2电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞
（三）克隆的筛选：1原理：主要用不同抗生素基因筛选。如：氨苄青霉素amp、卡那霉素、氯霉素、四环素tet、链霉素2方法：将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞
实验八、RNA的提取和RT—PCR
1.RNA的提取
√RNA提取过程的5个关键点：
1.样品细胞或组织的有效破碎；
2、有效地使核蛋白复合体变形；
3、对内源RNA酶的有效抑制；<最关键的步骤>（RNA酶性质稳定，不易变性，自然界中存在广泛，故做实验时需带手套操作）
4、有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；
5.对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效去除。
√RNA提取的实验原理：
Trizol试剂：异硫氰酸胍+苯酚（直接从细胞或组织中提取总RNA）
异硫氰酸胍：在破碎和溶解细胞时能保持RNA 的完整性、裂解细胞并释放出RNA
酸性条件下（苯酚）：使DNA与蛋白质进入有机相（之后可用氯仿萃取），而RNA留在水相（可通过异丙醇沉淀）
2.逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）
√原理：RT-PCR是将RNA的逆转录和cDNA的聚合酶链式扩增相结合的技术。首先在逆转录酶的作用下，以RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩整合成目的片段。作为模板RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。关
cDNA序列。
PCR技术:
概念：是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖于DNA 聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性
步骤：1.变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解螺旋解离形成单链DNA 2.退火：当温度突然降低，由于模板分子结构较引物要复杂得多，且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA,使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。3.延伸：在DNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下，5’-3’的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。
以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板；数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制。
用紫外分光光度法测定牛血清白蛋白含量时，准确吸取牛血清0.1ml，加生理盐水9.9ml。稀释成待测样本，在280nm和260nm两处波长分别测得光密度值，A280＝0.454，A260=0.250,求牛血清白蛋白浓度（g/L）。已知牛血清白蛋白百分吸
光系数E cm%1＝6.3（100ml/(g·cm)）。（4分）
小于1.5 浓度=1.45OD280-0.74OD260 ，结果乘100
大于1.5 浓度=OD280/K x L=（OD280/6.3 x 1）x 10 g/L，结果乘100
在凝交通透层析（葡聚糖G－50）中，蓝葡聚糖2000洗脱体积为8.6 ml，细胞色素C的洗脱体积为13.2 ml，DNFP－甘氨酸的洗脱体积为21.6 ml,试计算该层析柱的内、外水体积及细胞色素C的分配系数。（5分）
内水体积Vi=细胞色素C的洗脱体积13.2 ml
外水体积Vo=蓝葡聚糖2000洗脱体积8.6 ml
洗脱体积Ve= DNFP－甘氨酸的洗脱体积21.6 ml
分配系数Kd=(Ve-Vo)/Vi
3．(1)采用两种方法对待测γ-球蛋白溶液进行蛋白质定量分析。
BCA法：标准管为50μl牛血清白蛋白（1.8mg/ml）＋50μl水＋2ml BCA工作液，A=0.250
测定管为100μlγ-球蛋白溶液＋2ml BCA工作液，A＝0.300 紫外分光光度法：标准管为2ml牛血清白蛋白（1.8mg/ml）＋2ml生理盐水，A＝0.300
测定管为2mlγ-球蛋白溶液＋2ml生理盐水，A＝0.450 分别计算两种方法测得的γ-球蛋白溶液的浓度。（3分）
(2)这两种蛋白质定量方法在对同一管样品定量时，结果有很大的差别。判断哪一种定量方法的实验结果更加准确，说明判断依据。（2分）
BCA：1.操作简单，快速，45分钟内完成测定，比经典的lowry法快4倍且更加方便2.准确灵敏，试剂稳定性好，BCA试剂的蛋白质测定范围是20-200ug/ml，微量BCA测定范围在0.5-10ug/ml 3.经济实用，除试管外，测定可在微板孔中进行，大大节约样品和试剂用量 4.抗试剂干扰能力比较强，但仍会受到一些物质如巯基试剂和去垢剂的干扰
紫外分光光度法：1.操作简单，快速，样品经稀释后，倒入比色杯即可测定 2.样品不损失，测定后可以回收，多用于纯化蛋白质的微量测定 3.主要缺点是精确度差，由于其他物质在同一紫外区有吸收（核酸或一些缓冲液成分）以及不同蛋白质中芳香族氨基酸的含量变动过大所造成的
3. 取2ml肝匀浆(1g肝/2ml匀浆)分离DNA和RNA，（1）得到的纯化DNA沉淀，加0.01M NaOH 2.0ml溶解，从中取0.1ml+2.9ml0.01M NaOH稀释，用紫外分光光度法测得A260=0.460,A280＝0.240,鉴定纯度，计算DNA浓度(g/L)和每克肝组织中提取的DNA量（μg/g）。已知K(p)DNA=0.02ml/(μg·cm)（2）得到的RNA沉淀加蒸馏水2ml溶解，从中取0.1ml+3.9ml蒸馏水稀释，用紫外分光光度法测得A260=0.241,A280=0.139,鉴定纯度，计算RNA浓度(g/L)和每克肝组织中提取的RNA量（μg/g）。已知K(p)RNA=0.025ml/(μg·cm)。（5分）
3. 取2ml肝匀浆(1g肝/2ml匀浆)，分离DNA，得到的纯化DNA沉淀，加0.01MNaOH2ml溶解，从中取0.1ml+2.9ml0.01MNaOH稀释，用紫外分光光度法测定，A260＝0.420，A280＝0.240，计算每克肝组织中DNA的含量(μg/g)。已知K(p)DNA=0.02 ml/(μg·cm)。（5分）
6、在葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度时，按下表操作：
显色后505nm波长比色，ODs＝0.300，ODx＝0.220，已知葡萄糖标准液浓度为1.08 mg/ml，试求待测血浆的血糖浓度（mmol/L）。（5分）
1.P32分配系数Kd=(Ve-Vo)/Vi【Ve为洗脱体积，Vo为外水体积，Vi为内水体积】
2.P12Lambert-Beer定律的应用：标准管As=KCsL，待测管Ax=KCxL
※变形:①.测定CuSO4浓度【求Cx】:X=(Ax/As)·S, X、S=C·V,所以得到：
Cx=(Ax/As)·Cs·（Vs/Vx)
②P111测定肝糖原的浓度：C前=（A前/A标）·C标（1mg/ml)【葡萄糖分子量180，记得将mg/ml,即g/L,换算成mol/L】（“前”指注射对应激素前）
③P16血清蛋白质含量测定（双缩脲法测蛋白质）：在实验中有两种计算方法，一是利用各标准管吸光度数据作标准曲线，再对应测定管的吸光度找出索要测定的蛋白质含量。二是选一与测定管光密度相近的标准管数据，以此来计算蛋白质浓度。公式同样是Lambert-Beer定律：
Cx=(Ax/As)·Cs·（Vs/Vx)·10【测定前蛋白质被稀释10倍】
3.判断DNA纯度和计算DNA浓度、含量：
①纯度=OD260/OD280【1.在1.6-1.8之间，DNA较纯 2.小于1.6，蛋白质污染 3.大于1.8，RNA污染（增色效应）】
②DNA浓度：标准DNA 1μg/ml=0.02OD，DNA浓度=（OD260/0.02OD）*稀释倍数（μg/ml）
DNA含量：肝匀浆2ml=1g肝组织，所提取DNA溶于2mlNaOH，故：
DNA总量（μg）＝OD260/0.02*稀释倍数*2（ml)
生物化学糖代谢知识点总结材料
第六章糖代 糖(carbohydrates)即碳水化合物，是指多羟基醛或多羟基酮及其衍生物或多聚物。 根据其水解产物的情况，糖主要可分为以下四大类： 单糖：葡萄糖（G）、果糖（F），半乳糖（Gal），核糖 双糖：麦芽糖（G-G），蔗糖（G-F），乳糖（G-Gal） 多糖：淀粉，糖原（Gn），纤维素 结合糖: 糖脂，糖蛋白 其中一些多糖的生理功能如下： 淀粉：植物中养分的储存形式 糖原：动物体葡萄糖的储存形式 纤维素：作为植物的骨架 一、糖的生理功能 1. 氧化供能 2. 机体重要的碳源 3. 参与组成机体组织结构，调节细胞信息传递，形成生物活性物质，构成具有生理功能的糖蛋白。 二、糖代概况——分解、储存、合成
各种组织细胞 门静脉 肠粘膜上皮细胞 体循环 小肠肠腔 三、糖的消化吸收 食物中糖的存在形式以淀粉为主。 1.消化 消化部位：主要在小肠，少量在口腔。 消化过程：口腔 胃 肠腔 肠黏膜上皮细胞刷状缘 吸收部位：小肠上段 吸收形式：单糖 吸收机制：依赖Na+依赖型葡萄糖转运体（SGLT ）转运。 2.吸收 吸收途径： SGLT 肝脏
过程 四、糖的无氧分解 第一阶段：糖酵解 第二阶段：乳酸生成 反应部位：胞液 产能方式：底物水平磷酸化 净生成ATP 数量：2×2-2= 2ATP E1 E2 E3 调节：糖无氧酵解代途径的调节主要是通过各种变构剂对三个关键酶进行变构 调节。 E1:己糖激酶 E2: 6-磷酸果糖激酶-1 E3: 丙酮酸激酶 NAD + 乳 酸 NADH+H +
第二阶段：丙酮酸的氧化脱羧 第三阶段：三羧酸循环 生理意义： 五、糖的有氧氧化 1、反应过程 ○1糖酵解途径（同糖酵解，略） ②丙酮酸进入线粒体，氧化脱羧为乙酰CoA (acetyl CoA)。 总反应式: 关键酶 调节方式 ? 糖无氧氧化最主要的生理意义在于迅速提供能量，这对肌收缩更为重要。 ? 是某些细胞在氧供应正常情况下的重要供能途径。 ① 无线粒体的细胞，如：红细胞 ② 代谢活跃的细胞，如：白细胞、骨髓细胞 第一阶段：糖酵解途径 G （Gn ） 丙酮酸 乙酰CoA ATP ADP 胞液 线粒体 丙酮酸 乙酰CoA NAD + , HSCoA CO 2 , NADH + H + 丙酮酸脱氢酶复合体
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生物化学实验知识点整理 实验一 还原糖的测定、实验二 粮食中总糖含量的测定 1.还原糖测定的原理 3,5-二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原成棕色的氨基化合物,在550nm 处测定光的吸收增加量，得出该溶液的浓度，从而计算得到还原糖的含量 2.总糖测定原理 多糖为非还原糖，可用酸将多糖和寡糖水解成具有还原性的单糖，在利用还原糖的性质进行测定，这样就可以分别求出总糖和还原糖的含量 3.电子天平使用 4.冷凝回流的作用： 使HCl 冷凝回流至锥形瓶中，防止HCl 挥发，从而降低HCl 的浓度。 5.多糖水解方法： 加酸进行水解 6.怎样检验淀粉都已经水解： 加入1-2滴碘液，如果立即变蓝则说明没有完全水解，反之，则说明已经完全水解。 7.各支试管中溶液的浓度计算 8.NaOH 用量：HCl NaOH n n = 9.不能中途换分光光度计,因为不同的分光光度计的光源发光强度不同 10.分光光度计的原理：在通常情况下，原子处于基态，当通过基态原子的某辐射线所具有的能量（或频率）恰好符合该原子从基态跃迁到激发态所需的能量（或频率）时，该基态原子就会从入射辐射中吸收能量，产生原子吸收光谱。原子的能级是量子化的，所以原子对不同频率辐射的吸收也是有选择的。这种选择吸收的定量关系服从式/E h hc νλ?==。 实验证明，在一定浓度范围内，物质的吸光度A 与吸光样品的浓度c 及厚度L 的乘积成正比，这就是光的吸收定律，也称为郎伯-比尔定律 分光光度计就是以郎伯比尔定律为原理，来测定浓度 11.为什么要水解多糖才能用DNS 因为DNS 只能与还原糖溶液在加热的条件下反应生成棕红色的氨基化合物，不能与没有还原性的多糖反应。 12.为什么要乘以0.9 以0.9才能得到多糖的含量。 13.为什么要中和后再测？ 因为DNS 要在中性或微碱性的环境下与葡萄糖反应 实验三 蛋白质的水解和纸色谱法分离氨基酸、实验四 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 1.纸色谱分离氨基酸分离原理 由于各氨基酸在固定相（水）和流动相（有机溶剂）中的分配系数不同，从而移动速度不同，经过一段时间后，不同的氨基酸将存在于不同的部位，达到分离的目的。 2.天然氨基酸为L 型 3.酸式水解的优点是：是保持氨基酸的旋光性不变，原来是L 型，水解后还是L 型，由于甘氨酸所有的R 基团是氢原子，所以它不是L 型
《生化分离工程》思考题与答案
第一章绪论 1、何为生化分离技术？其主要研究那些容？生化分离技术是指从动植物组织培养液和微生物发酵液中分离、纯化生物产品的过程中所采用的方法和手段的总称。 2、生化分离的一般步骤包括哪些环节及技术？一般说来，生化分离过程主要包括4 个方面：①原料液的预处理和固液分离，常用加热、调PH、凝聚和絮凝等方法；②初步纯化（提取），常用沉淀、吸附、萃取、超滤等单元操作；③高度纯化（精制），常选用色谱分离技术；④成品加工，有浓缩、结晶和干燥等技术。 3、生化分离工程有那些特点，及其重要性？ 特点：1、目的产物在初始物料（发酵液）中的含量低；2、培养液是多组分的混合物，除少量产物外，还有大量的细胞及碎片、其他代物（几百上千种）、培养基成分、无机盐等；3、生化产物的稳定性低，易变质、易失活、易变性，对温度、pH 值、重金属离子、有机溶剂、剪切力、表面力等非常敏感；4、对最终产品的质量要求高重要性：生物技术产品一般存在于一个复杂的多相体系中。唯有经过分离和纯化等下游加工过程，才能制得符合使用要求的产品。因此产品的分离纯化是生物技术工业化的必需手段。在生物产品的开发研究中，分离过程的费用占全部研究费用的50 ％以上；在产品的成本构成中，分离与纯化部分占总成本的40～ 80 ％；精细、药用产品的比例更高达70 ～90 ％。显然开发新的分离和纯化工艺是提高经济效益或减少投资的重要途径。
4、生物技术下游工程与上游工程之间是否有联系？ 它们之间有联系。①生物工程作为一个整体，上游工程和下游工程要相互配合， 为了利于目的产物的分离与纯化，上游的工艺设计应尽量为下游的分离纯化创造条件，例如，对于发酵工程产品，在加工过程中如果采用液体培养基，不用酵母膏、玉米浆等有色物质为原料，会使下游加工工程更方便、经济；②通常生物技术上游工程与下游工程相耦合。发酵- 分离耦合过程的优点是可以解除终产物的反馈抑制效应，同时简化产物提取过程，缩短生产周期，收到一举数得的效果。 5、为何生物技术领域中往往出现“丰产不丰收”的现象？ 第二章预处理、过滤和细胞破碎 1、发酵液预处理的目的是什么？主要有那几种方法？ 目的：改变发酵液的物理性质，加快悬浮液中固形物沉降的速率；出去大部分可溶性杂质，并尽可能使产物转入便于以后处理的相中（多数是液相），以便于固液分离及后提取工序的顺利进行。 方法：①加热法。升高温度可有效降低液体粘度，从而提高过滤速率，常用于粘度随温度变化较大的流体。控制适当温度和受热时间，能使蛋白质凝聚形成较大颗粒，进一步改善发酵液的过滤特性。使用加热法时必须注意加热温度必须控制在不影响目的产物活性的围，对于发酵液，温度过高或时间过长可能造成细胞溶解，胞物质外溢，而增加发酵液的复杂性，影响其后的产物分离与纯化；②调节悬浮液的pH 值，pH 直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH 可以改善其过滤特性；③凝聚和絮凝；④使用惰性助滤剂。
生化实验操作考核要点(新)
【实验操作考核要点】 一、目的要求 1．掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。 2．了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。 3．正确操作使用刻度吸管和可调微量移液器。 4．熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。 5．正确掌握溶液转移的操作。 6．正确操作使用分光光度计。 二、操作考核内容 按百分制计。 1．吸量管操作（20分）； 2．可调式微量移液器操作（20分）； 3．溶液混匀操作（视具体情况，采用合适的混匀方法）（15分）； 4．溶液转移操作（10分）； 5．分光光度计比色操作（25分）。 6．整体表现（10分）。 三、操作考核标准 （一）吸量管操作（20分，每项操作5分） 1．执管 要求右手拿吸量管，左手拿橡皮球，只能用食指而不能用拇指按压吸量管上口来调节吸取液量的刻度；吸液、排液整个操作过程吸量管应始终保持垂直。 2．坐姿 要求腰、背保持竖直，看刻度时眼睛保持平视。 3．吸取溶液 吸量管插入液面深度约0.5cm，不能一插到底，也不能插入过浅而吸进空气致使溶液进入橡皮球内；调控吸量管吸取液量的刻度时，吸量管尖应离开液面靠在容器内壁上。 4．排出液体
吸量管尖应靠上受纳容器内壁，让管内溶液自然流出。不能用橡皮球吹压，而且在流净后吸量管尖停靠受纳容器内壁至少3秒。 （二）可调式微量移液器操作（20分，每项操作5分） 1．设定容量值 转动加样器的调节旋钮，反时针方向转动旋钮，可提高设定取液量。顺时针方向转动旋钮，可降低设定取液量。在调整设定移液量的旋钮时，不要用力过猛，并应注意使取液器显示的数值不超过其可调范围。 2．吸液 （1）选择合适的吸头安放在取液套筒上，稍加扭转压紧吸嘴使之与套筒之间无空气间隙； （2）把按钮压至第一停点，垂直握持加样器,使吸头浸入液面下2~3毫米处,然后缓慢平稳地松开按钮，吸入液体，等一秒钟，然后将吸头提离液面，贴壁停留2-3秒，使管尖外侧的液滴滑落。 3．放液 （1）将吸头口贴到容器内壁底部并保持100°~40°倾斜； （2）平稳地把按钮压到第一停点，等一秒钟后再把按钮压到第二停点以排出剩余液体； （3）压住按钮，同时提起加样器，使吸头贴容器壁擦过，再松开按钮。按吸头弹射器除去吸头。 4．压放按钮时保持平稳；加样器不得倒转；吸头中有液体时不可将加样器平放。取液器吸嘴为一次性使用。实验完毕，将取液器读数调至最大量程值，竖立放于支架上。 （三）溶液的混匀（操作流程中下划实线的三处，每项操作5分，共15分）1．肝糖原的提取与鉴定操作中，肝匀浆上清液中加5ml 95%乙醇后的混匀最好用倾倒混匀，也可用滴管或吸量管吸、吹混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。 2．肝糖原定量测定中，肝组织消化液沸水浴后全部转入100 ml容量瓶，加水至刻线后的混匀应采用倒转混匀。 3．肝糖原定量测定中，加蒽酮溶液后的混匀，可将试管倾斜约45o再作旋转混匀。因蒽酮溶液（浓硫酸配制）比重大于样品水溶液很多，一加入便沉于管
生化,分子,细胞试验汇总
主要培养基的配制 LB液体培养基 胰蛋白胨10 g，酵母浸出物 5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1000 ml，用 1 mol/L HCl 调节pH 至7.4，121℃高压灭菌20 min。如果需要加抗生素，则待灭过菌的培养基温度降到55℃以下后加入适量的抗生素储存液。 LB 固体培养基 在LB液体培养基中加入2%琼脂。 DMEM细胞培养基 DMEM溶液90%(v/v)，FBS 10%(v/v)，青霉素100U/ml，链霉素100 μg/ml McCoy’s 5A细胞培养基 McCoy’s 5A溶液90%(v/v)，FBS 10%(v/v),青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml
实验试剂及药品的配制 1 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 在800 ml的双蒸水中溶解Tris(三羟甲基氨基甲烷)121.1 g，用浓盐酸调pH 至8.0，用双蒸水定容至1000 ml。121℃高压灭菌15 min，备用。 TE 缓冲液(pH8.0) 1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)10 ml和500 mmol/L EDTA(pH8.0)溶液 2 ml，用双蒸水定容至1000 ml。121℃高压灭菌15 min，备用。 500 mmol/L 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8.0) 在800 mL 的双蒸水中加入18.6 g 乙二铵四乙酸二钠，充分溶解后，用10 mol/L NaOH 溶液调pH 至8.0，用双蒸水定容到1000 ml。121℃高压灭菌15 min，备用。 溴化乙锭(EB) 1 g EB，加入100 ml 灭菌双蒸水中，磁力搅拌数h以确保其完全溶解，然后转入棕色瓶中，4℃保存。 TAE 电泳缓冲液(50×) 242 g Tris碱，57 ml冰乙酸，100 ml 0.5M EDTA，加灭菌去离子水定容至1000 ml，使用时稀释50倍。 10% SDS 将10 g高纯度的SDS置于烧杯中，加入约80 ml的ddH2O，68℃加热溶解，滴加盐酸调节pH值至7.2，定容至100 ml后，室温保存。 G418 (Neomycin) 用PBS (pH 7.4) 配成浓度为50 mg/ml的原液，0.22 m滤膜过滤除菌，分装储于-20℃备用。
生化实验思考题参考答案[1].
生化实验讲义思考题参考答案 实验一淀粉的提取和水解 1、实验材料的选择依据是什么？ 答：生化实验的材料选择原则是含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低。从科研工作的角度选材，还应当注意具体的情况，如植物的季节性、地理位置和生长环境等，动物材料要注意其年龄、性别、营养状况、遗传素质和生理状态等，微生物材料要注意菌种的代数和培养基成分的差异等。 2、材料的破碎方法有哪些？ 答：(1) 机械的方法：包括研磨法、组织捣碎法； (2) 物理法：包括冻融法、超声波处理法、压榨法、冷然交替法等； (3) 化学与生物化学方法：包括溶胀法、酶解法、有机溶剂处理法等。 实验二总糖与还原糖的测定 1、碱性铜试剂法测定还原糖是直接滴定还是间接滴定？两种滴定方法各有何优缺点？ 答: 我们采用的是碱性铜试剂法中的间接法测定还原糖的含量。间接法的优点是操作简便、反应条件温和，缺点是在生成单质碘和转移反应产物的过程中容易引入误差；直接法的优点是反应原理直观易懂，缺点是操作较复杂，条件剧烈，不易控制。 实验五粗脂肪的定量测定─索氏提取法 （1）本实验制备得到的是粗脂肪，若要制备单一组分的脂类成分，可用什么方法进一步处理？ 答：硅胶柱层析，高效液相色谱，气相色谱等。 （2）本实验样品制备时烘干为什么要避免过热? 答：防止脂质被氧化。 实验六蛋白质等电点测定 1、在等电点时蛋白质溶解度为什么最低？ 请结合你的实验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。
蛋白质是两性电解质，在等电点时分子所带净电荷为零，分子间因碰撞而聚沉倾向增加，溶液的粘度、渗透压减到最低，溶解度最低。结果中pH约为4.9时，溶液最浑浊，达到等电点。 答： 2、在分离蛋白质的时候，等电点有何实际应用价值？ 答: 在等电点时，蛋白质分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，所以处于等电点的蛋白质最容易沉淀。在分离蛋白质的时候，可以根据待分离的蛋白质的等电点，有目的地调节溶液的pH使该蛋白质沉淀下来，从而与其他处于溶液状态的杂质蛋白质分离。 实验七氨基酸的分离鉴定－纸层析法 1、如何用纸层析对氨基酸进行定性和定量的测定？ 答: 将标准的已知氨基酸与待测的未知氨基酸在同一张层析纸上进行纸层析，显色后根据斑点的Rf值，就可以对氨基酸进行初步的定性，因为同一个物质在同一条件下有相同的Rf 值；将点样的未知氨基酸溶液和标准氨基酸溶液的体积恒定，根据显色后的氨基酸斑点的面积与点样的氨基酸质量成正比的原理，通过计算斑点的面积可以对氨基酸溶液进行定量测定。 3、纸层析、柱层析、薄层层析、高效液相层析各有什么特点？ 答:
华中农业大学《生物化学实验》试卷
华中农业大学本科生课程考试试卷 考试课程与试卷类型：植物生理学实验原理与技术（A）姓名： 学年学期：2008－2009－1 学号： 考试时间：2009－－班级： 一、名词解释 ( 每题 4 分 , 共 12分 ) 1. 聚丙烯酰胺凝胶 2. 离心技术 3．可见光分光光度法/反相纸层析 二、填空题 ( 每空 2 分 , 共 42分 ) 1. 反相纸层析法分离油菜不饱和脂肪酸的实验中 ,分离后的不饱和脂肪酸经红氨酸溶液显色后 , 其最终产物颜色是（1）,从点样端起层析谱带所对应的脂肪酸依次是 (2) 、（3）、（4）、（5）、（6）。 2. 圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物酶同工酶的实验中 , 电泳时上槽接电源（7）极 ,下槽接电源 (8) 极 , 电泳开始电流应调节至每管（9）mA, 十分钟后电流调节至每管 (10) mA; 在上槽或样品中加入溴酚蓝是起（11）的作用。 3. 核酸提取过程中 , 将含有 DNA 的溶液置72℃处理 3 分钟，其目的是（12）；在淀粉酶活性测定过程中将淀粉酶液置于 70℃下处理 15 分钟的目的是（13）。 4．在微量凯氏定氮法测定植物组织中的总氮和蛋白氮，有三个主要的实验阶段，它们分别是（14）、（15）和（16）。在第二阶段，若收集三角瓶中的溶液颜色由_（17）变为（18），表明反应完全。第三阶段所用的标准浓度的滴定溶液名称是（19）。 5. DNA 提取研磨时加入的研磨缓冲液的NaCl浓度是（20），研磨时加入SDS的作用是（21）
三、是非判断题 (判断对错，对的标T，错的标F，每题 2 分，共 10 分 ) 1．萌发的小麦种子中含有很高活性的淀粉酶，其中α－淀粉酶不耐热，在70℃迅速钝化。（） 2．本学期测定还原性糖和可溶性蛋白含量时都用到了斐林试剂，这两个实验中所用的斐林试剂的配方是相同的。（） 3．DNA提取中，加入冷乙醇是为了使DNA分子复性变粗。（） 4．离心机使用中，要求同一台离心机所用的离心管都有相同的重量。（）5．油菜种子硫甙葡萄糖苷的快速分析法中，反应的实质是测定水解硫苷产生的葡萄糖的数量。（） 四、问答题（共36分） 1．试述维生素C测定的基本原理及其实验过程中的注意事项（12分） 2．简述凯氏定氮法测定蛋白质含量的基本原理。为什么一些不法商人要在蛋白质制品中加入三聚氰胺？（12分） 3．凝胶电泳法测定同工酶的原理是什么？为什么本学期所作的胶条染色后显示的谱带就是过氧化物同工酶带？（12分）
生化知识点整理(特别全)
第一章 蛋白质的元素组成（克氏定氮法的基础） 碳、氢、氧、氮、硫（C、H、O、N、S ） 以及磷、铁、铜、锌、碘、硒 蛋白质平均含氮量（N%）：16% ∴蛋白质含量=含氮克数×6.25（凯氏定氮法） 基本组成单位 氨基酸 熟悉氨基酸的通式与结构特点 ● 1. 20种AA中除Pro外，与羧基相连的α-碳原子上都有一个氨基，因而称α-氨 基酸。 ● 2. 不同的α-AA，其R侧链不同。氨基酸R侧链对蛋白质空间结构和理化性质有 重要影响。 ● 3. 除Gly的R侧链为H原子外，其他AA的α-碳原子都是不对称碳原子，可形成 不同的构型，因而具有旋光性。 ● 氨基酸分类P9 按侧链的结构和理化性质可分为： 非极性、疏水性氨基酸 极性、中性氨基酸 酸性氨基酸 碱性氨基酸 等电点概念 在某一溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，呈电中性，此时该溶液的pH值即为该氨基酸的等电点(isoelectric point，pI )。 紫外吸收性质 含有共轭双键的芳香族氨基酸Trp(色氨酸), Tyr（酪氨酸）的最大吸收峰在280nm波长附近。 氨基酸成肽的连接方式 两分子脱水缩合为二肽，肽键
由10个以氨基酸相连而成的肽称为寡肽。 而更多的氨基酸相连而成的肽叫做多肽；多肽链有两端，其游离a-氨基的一端称氨基末端或N-端，游离a-羧基的一端称为羧基末端或C-端。 肽链中的氨基酸分子因脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基。 蛋白质就是由许多氨基酸残基组成的多肽链。 谷胱甘肽GSH GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽。 (1) 体重要的还原剂保护蛋白质和酶分子中的巯基免遭氧化，使蛋白质处与活性状态。 (2) 谷胱甘肽的巯基作用可以与致癌剂或药物等结合,从而阻断这些化合物与DNA、RNA 或蛋白质结合，保护机体免遭毒性损害。 蛋白质1~4级结构的定义及维系这些结构稳定的作用键 蛋白质是氨基酸通过肽键相连形成的具有三维结构的生物大分子 蛋白质的一级结构就是蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序。主要化学键是肽键，有的还包含二硫键。 蛋白质二级结构是指多肽链的主链骨架中若干肽单元，各自沿一定的轴盘旋或折叠，并以氢键为主要次级键而形成的有规则或无规则的构象，如α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲等。蛋白质二级结构一般不涉及氨基酸残基侧链的构象。 二级结构的主要结构单位——肽单元（peptide unit）[肽键与相邻的两个α-C原子所组成的残基，称为肽单元、肽单位、肽平面或酰胺平面(amide plane)。它们均位于同一个平面上，且两个α-C原子呈反式排列。] 二级结构的主要化学键——氢键(hydrogen bond) 蛋白质的三级结构是指多肽链在二级结构的基础上,由于氨基酸残基侧链R基的相互作用进一步盘曲或折迭而形成的特定构象。也就是整条多肽链中所有原子或基团在三维空间的排布位置。蛋白质三级结构的形成和稳定主要靠次级键，包括氢键、盐键、疏水键以及德华力等。此外，某些蛋白质中二硫键也起着重要的作用。 由两个或两个以上亚基之间彼此以非共价键相互作用形成的更为复杂的空间构象，称为蛋白质的四级结构。[亚基(subunit)：由一条或几条多肽链缠绕形成的具有独立三级结构的蛋白质。] 蛋白质二级结构的基本形式？重点掌握α-螺旋、β-折叠的概念 α-螺旋(α-helix) β-折叠(β-pleated sheet) β-转角(β–turn or β-bend) 无规卷曲(random coil) α-helix ①多个肽平面通过Cα的旋转，相互之间紧密盘曲成稳固的右手螺旋。 ②主链螺旋上升，每3.6个氨基酸残基上升一圈，螺距0.54nm。肽平面和螺旋长轴平行。 ③相邻两圈螺旋之间借肽键中羰基氧(C＝O)和亚氨基氢(NH)形成许多链氢键，即每一
整理生物化学与分子生物学实验
生物化学与分子生物学实验 1.分光光度计 （1）基本原理：溶液溶质在其一定波长的吸收光中，其吸光度值与液层厚度和溶液浓度的乘积成正比，即遵循朗伯—比尔定律，通过也在一定 液体厚度时测定其吸光度来与标准曲线比较从而测得待测液溶质浓 度。 （2）吸光度与液层厚度和溶液浓度的乘积成正比，称为朗伯—比尔定律，简称比尔定律，即光的吸收定律。其数学表达式为： A＝-lgT＝εbc A：吸光度，又称光密度“O.D”； ε：吸光系数（L·mol－1·cm－1）；比例常数，称吸光系数 b：样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收池，则b=1cm； c：样品浓度（mol/L）。 吸光度“A”具有加和性,即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光度的算术和。这是多元混合物分光光度法定量分析的基础。 若溶液中各溶质的吸光系数ε相同，则各溶质吸光度的大小与溶质浓度成比例。 例：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定260nm的吸光度为0.650，用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为0.070，已知其摩尔吸光系数= 8.2×103 M-1cm，计算其摩尔浓度. ∵A＝εbC ∵A＝（溶剂加样品的吸光度）－（溶剂的吸光度） ∴A＝0.650－0.070＝0.580 ∵b＝1cm ∴C==7.1×10-5 mol / L （2）等电点的计算方法； 标准曲线的制作 （1）配置一系列浓度不同的标准溶液。 （2）在测定条件相同的情况下，分别测定其吸光度。 （3）以标准溶液浓度为横坐标（不必考虑显色剂等引起的浓度变化），以相应的吸光度为纵坐标，绘制A-C关系图。 （4）在相同条件下测出样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出浓度。
食品·微生物学实验思考题答案
食品微生物学技术思考题答案1.如何区别高倍镜和油镜 答：（1）油镜更接近标本片（2）油镜与标本间的介质是香柏油（3）油镜刻有“oil”或“Hi”字样，也刻有一圈红线或黑线为标记。 2．为什么在使用高倍镜及油镜是应特别注意避免粗调节器的错误操作答：使用高倍镜及油镜时镜头距离标片很近，而粗调节器的调节幅度较大，粗调节器的错误操作会使镜头大幅度向标本移动，很容易损坏标本和镜头。一般先用低倍镜找到物象后换到高倍镜，就只需要用细调节器了。 3.用油镜观察时应注意哪些问题在载破片和镜头之间加滴什么油起什么作用 答：（1）应该先用擦镜纸将镜头擦干净，以防止上次实验的污染，操作时，先低倍再高倍，用完要擦掉油。（2）在转换油镜时，从侧面水平注视镜头注视镜头与玻片的距离。使镜头浸入油中而不以压破载玻片为宜。（3）从目镜内观察，把孔径光阑开到最大，使其明亮。然后用微调将镜台下降，直至视野内物象清晰。如油镜已离开油面仍未见物象，需重复操作。加的是香柏油。作用是增加折光率，增加显微镜的分辨率。 4.在调节焦距时，往往出现一些疑似观察标本的物象点，物象点可能是目镜或物镜上的杂质，也可能是标本片上的观察对象，如何通过操作判断这些物象点是否在标片上 答：移动标本片，看物象点是否移动，如果不移动，则不在标本片上。 5．如果涂片未经热固定或固定温度过高、时间过长，会出现什么现象答：固定时间是杀死菌体，使菌体蛋白质凝固黏附于载玻片上，增加菌体对染色剂的结合力，易于着色。但是如果没固定，不容易着色，且容易被清水冲走。
温度过高会使细胞收缩变形，时间过长会导致菌体变形或形态破坏，难以着色，从而导致难以着色。 6.为什么要培养18-24h的细菌菌体进行革兰氏染色 答:此时菌体进入比较活泼的繁殖生长期，细胞壁比较好着色。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应，关键在于细胞壁的通透性的改变。如果菌龄过老，不便于显微镜下观察时阴性还是阳性菌。 7．如何操作才能保证革兰氏染色结果正确，其中的关键环节是什么答：具体操作步骤为（1）涂片，与简单染色法相同，要求薄而均匀。（2）干燥、固定，在空气中自然晾干，或将涂面朝上，在酒精灯微小火焰上干燥；在酒精灯火焰上通过3-4次，温度不宜过高。（3）染色，用结晶紫进行初染1min,然后水洗。用碘液进行媒染，用碘液覆盖染色部位1min,水洗。在涂有细菌的部位连续滴加95%乙醇，约30s，水洗脱色。用番红溶液复染1min,水洗。（4）干燥，自然干燥或用吸水纸吸干，也可以用电吹风吹干。（5）镜检。 关键环节是酒精脱色。 8．为何常用插片法培养放线菌观察个体形态 答：放线菌的营养菌丝生长在培养基表面或插入培养基里面，不易被接种针挑取制片。采用插片法可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长时期的形态。 9.在显微镜下，如何区分基内菌丝和气生菌丝 答：一般气生菌丝颜色较深，直生或分枝丝状，比基内菌丝粗；而基内菌丝色浅、发亮，可看到隔膜，继而断裂成球状或杆状小体。 10.放线菌与细菌的菌落最显着的差异是什么
2015高级生物化学及实验技术试题答案
高级动物生化试题 问答题： 1. 简述非编码RNA（non-coding RNA）的种类、结构特点及其主要功能。 非编码RNA的种类结构和功能 1tRNA转运RNA（transfer RNA，tRNA） 结构特征之一是含有较多的修饰成分，核酸中大部分修饰成分是在tRNA中发现的。修饰成分在tRNA分子中的分布是有规律的，但其功能不清楚。5’末端具有G（大部分）或C。3’末端都以ACC的顺序终结。有一个富有鸟嘌呤的环。有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子（anticodon）.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。有一个胸腺嘧啶环。tRNA具有三叶草型二级结构以及“L”型三级结构，tRNA 的不同种类及数量可对蛋白质合成效率进行调节。tRNA负责特异性读取mRNA中包含的遗传信息，并将信息转化成相应氨基酸后连接到多肽链中。 tRNA为每个密码子翻译成氨基酸提供了结合体，同时还准确地将所需氨基酸运送到核糖体上。鉴于tRNA在蛋白质合成中的关键作用，又把tRNA称作第二遗传密码。tRNA还具有其他一些特异功能，例如，在没有核糖体或其他核酸分子参与下，携带氨基酸转移至专一的受体分子，以合成细胞膜或细胞壁组分；作为反转录酶引物参与DNA合成；作为某些酶的抑制剂等。有的氨酰-tRNA还能调节氨基酸的生物合成。 2rRNA核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA） 核糖体RNA是细胞中最为丰富的RNA，在活跃分裂的细菌细胞中占80%以上。
他们是核糖体的组分，并直接参与核糖体中蛋白质的合成。核糖体是rRNA 提供了一个核糖体内部的“脚手架”，蛋白质可附着在上面。这种解释很直接很形象，但是低估了rRNA在蛋白质合成中的主动作用。较后续的研究表明，rRNA并非仅仅起到物理支架作用，多种多样的rRNA可起到识别、选择tRNA以及催化肽键形成等多种主动作用。例如：核糖体的功能就是,按照mRNA的指令将氨基酸合成多肽链。而这主要依靠核糖体识别tRNA 并催化肽键形成而实现。可以说核糖体是一个大的核酶( ribozyme)。而核糖体的催化功能主要是由rRNA来完成的,蛋白质并没有直接参与。 3 tmRNA tmRNA主要包括12个螺旋结构和4个“假结”结构，同时还包括一 个可译框架序列的单链RNA结构。tmRNA中H1由5’端和3’端两个末端形成，与tRNA的氨基酸受体臂相似。H1和H2的5’部分之间有一个由10-13nt 形成的环，类似tRNA中的二氢尿嘧啶环，称为“D”环。H3和H4，H6和H7，H8和H9，H10和H11之间分别形成Pk1，pK2，pK3，pK4。H4和H5之间则由一段包含编码标记肽ORF的单链RNA连接。H12由5个碱基对和7nt 形成的环组成，类似tRNA中的TΨC臂和TΨC环，称为“T”环。tmRNA 结构按照功能进行划分可分为tRNA类似域（TLD）和mRNA类似域（MLD），TLD主要包括H1,H2,H12,“D”环和“T”环，MDL则包括ORF和H5，这两部分分别具有类似tRNA和mRNA的功能。tmRNA是一类普遍存在于各种细菌及细胞器（如叶绿体，线粒体）中的稳定小分子RNA。它具有mRNA分子和tRNA分子的双重功能，它在一种特殊的翻译模式——反式翻译模式中发挥重要作用。同时，它与基因的表达调控以及细胞周期的调控等生命过程密切相关，是细菌体内蛋白质合成中起“质量控制”的重要分子之一。识别翻译或读码有误的核糖体，也识别那些延迟停转的核糖体，介导这些有问
生物化学知识点总整理
一、蛋白质 1.蛋白质的概念：由许多氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合物，由C、H、O、N、S元素组成，N的含量为16%。 2.氨基酸共有20种，分类：非极性疏水R基氨基酸、极性不带电荷R基氨基酸、带正电 荷R基氨基酸（碱性氨基酸）、带负电荷R基氨基酸（酸性氨基酸）、芳香族氨基酸。 3.氨基酸的紫外线吸收特征：色氨酸和酪氨酸在280纳米波长附近存在吸收峰。 4.氨基酸的等电点：在某一PH值条件下，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相同，溶液中氨基酸的净电荷为零，此时溶液的PH值称为该氨基酸的等电点；蛋白质等电点： 在某一PH值下，蛋白质的净电荷为零，则该PH值称为蛋白质的等电点。 5.氨基酸残基：氨基酸缩合成肽之后氨基酸本身不完整，称为氨基酸残基。 6.半胱氨酸连接用二硫键（—S—S—） 7.肽键：一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸α-氨基脱水缩合形成的化学键。 8.N末端和C末端：主链的一端含有游离的α氨基称为氨基端或N端；另一端含有游离的 α羧基，称为羧基端或C端。 9.蛋白质的分子结构：（1）一级结构：蛋白质分子内氨基酸的排列顺序，化学键为肽键和二硫键；（2）二级结构：多肽链主链的局部构象，不涉及侧链的空间排布，化学键为氢键， 其主要形式为α螺旋、β折叠、β转角和无规则卷曲；（3）三级结构：整条肽链中，全部氨基 酸残基的相对空间位置，即肽链中所有原子在三维空间的排布位置，化学键为疏水键、离子键、氢键及范德华力；（4）四级结构：蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和 相互作用。 10.α螺旋：(1)肽平面围绕Cα旋转盘绕形成右手螺旋结构，称为α螺旋；(2).螺旋上升一圈，大约需要3.6个氨基酸，螺距为0.54纳米，螺旋的直径为0.5纳米；(3).氨基酸的R基分布在 螺旋的外侧；(4).在α螺旋中，每一个肽键的羰基氧与从该羰基所属氨基酸开始向后数第五个氨基酸的氨基氢形成氢键，从而使α螺旋非常稳定。 11.模体：在许多蛋白质分子中可发现两个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体。 12.结构域：大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域。 13.变构效应：蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。 14.蛋白质胶体结构的稳定因素：颗粒表面电荷与水化膜。 15.什么是蛋白质的变性、复性、沉淀？变性与沉淀关系如何?导致蛋白质的变性因素？举 例说明实际工作中应用和避免蛋白质变性的例子？ 蛋白质的变性：在理化因素的作用下，蛋白质的空间构象受到破坏，其理化性质发生改变，生物活性丧失，其实质是蛋白质的次级断裂，一级结构并不破坏。 蛋白质的复性：当变性程度较轻时，如果除去变性因素，蛋白质仍能恢复或部分恢复其原 来的构象及功能，这一现象称为蛋白质的复性。
生物化学实验理论考试题答案
生物化学实验理论考试题答案 1.醋酸纤维薄膜电泳时点样端应靠近电极的哪一端，为什么？ 答；电泳时点样端应靠近负极，因为血清中各种蛋白质在PH为8.6的环境中均带负电，根据同性相吸，异性相斥原理，点样端在负极时蛋白质向正极泳动从而实现蛋白质分离。 2.用分光光度计测定物质含量时，设置空白对照管的作用,为什么？ 答；空白对照是为了排除溶剂对吸光度的影响。溶液的吸光度表示物质对光的吸收程度，但是作为溶剂也能吸收，反射和透射一部分的光，因此必须以相同的溶剂设置对照，排除溶剂对吸光度的影响。 3.简述血清蛋白的醋酸纤维薄膜的电泳原理？ 答；血清蛋白中各种蛋白质离子在电场力的作用下向着与自身电荷相反的方向涌动，而各种蛋白质等电点不同，且在PH为8.6时所带电荷不同，分子大小不等，形状各有差异，所以在同一电泳下永动速度不同从而实现分离。 4.何谓Rf值？影响Rf值的因素？ 答;Rf是原点到层析中心的距离与原点到溶剂前沿的距离之比。Rf的大小与物质的结构，性质，溶剂系统，层析滤纸的质量和层析温度有关，对同一种物质来讲Rf是一个常量。 5.什么是盐析？盐析会引起蛋白质的变性吗？一般用什么试剂? 答;盐析是指当溶液中的中性盐持续增加时，蛋白质的溶解度下降，当中性盐的浓度达到一定程度的时候，蛋白质从溶液中析出的现象。盐析不会引起蛋白质的变性，因为蛋白质的结构并未发生改变，去掉引起盐析的因素蛋白质仍能溶解；一般用饱和硫酸铵溶液进行盐析 6.简述DNS法测定还原糖浓度的实验原理？ 答;还原糖与DNS在碱性条件下加热被氧化成糖酸，而DNS被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内还原糖的量与3-氨基-5硝基水杨酸颜色的深浅成正比，用分光光度计测出溶液的吸光度，通过查对标准曲线可计算出3-氨基-5硝基水杨酸的浓度，从而得出还原糖的浓度。 7.影响蛋白质沉淀的因素是什么？沉淀和变性有什么联系？ 答;水溶液中的蛋白质分子由于表面形成水化层和双电层从而形成稳定的亲水胶
生物化学知识点汇总
生物化学知识点486 时间：2011-8-10 18:04:44 点击： 、大多数的蛋白质都是由（碳）、（氢）、（氧）、（氮）等主要1生物化学一、填空题核心提示：折、蛋白质二级结构的主形式是（a-螺旋）、（B-元素组成的，组成蛋白质的基本单位是（氨基酸）。2（疏3、维行蛋白质的空间结稳定的化 学键主要有（氢键）、（盐键）、叠）（B-转角）（无规则卷曲）。... 水键）、（范德华力）等生物化学 一、填空题 、大多数的蛋白质都是由（碳）、（氢）、（氧）、（氮）等主要元素组成的，组成蛋白1 质的基本单位是（氨基酸）。 转角）（无规则卷曲）。、蛋白质二级结构的主形式是（a-螺旋）、（B-折叠）（B-2、维行蛋白质的空间结稳定的化学键主要有（氢键）、（盐键）、（疏水键）、（范德华3 力）等非共价键和（二硫键）。 、使蛋白质沉淀常用的方法有（盐析法）、（有机溶剂沉淀法）、、4 （重金 属盐沉淀法）。、核酸分（核糖核酸）和（脱氧核糖核酸）两大类。构成核酸的基本单位是（氨基酸），5 核酸彻底水解的最终产物是（碳酸）、（戊糖）、（含氮碱），此即组成核酸的基本成分。）、CA）和（鸟嘌呤B）两种，嘧啶碱主要有（胞嘧啶6、核酸中嘌呤碱主要有（腺嘌呤）和（胸腺嘧啶T）三种。（尿嘧啶U、酶是指（由活细胞产生的能够在体内外起催化作用的生物催化剂），酶所催化的反应称7 为（酶促反应），酶的活性是指（酶的催化能力）。 8、酶促反应的特点有（催化效率高）、（高度专一性）（酶活性的不稳定性）。 、酶促反应速度受许多因素影响，这些因素主要有（酶浓度）、（底物浓度）、（温度）、9 ）、（激活剂）、（抑制剂）（PH），糖的来源有（食物中糖的消化吸收）、3.9-6.1mmol/L10、正常情况下空腹血糖浓度为（（肝糖原的分解）、（糖异生作用），糖的正常去路有（氧化供能）、（合成糖原）、（转化成脂肪等），异常去路有（尿糖）。，反应在（线12）分子ATP411、三羧酸循环中有（2）次脱羧（）次脱氧反应，共生成（酮戊二酸脱氢酶粒）中进行，三种关键酶是（柠檬酸合成酶）、（异柠檬酸脱氢酶）、（a- 系）。、由于糖酵解的终产物是（乳酸），因此，机体在严重缺氧情况下，会发生（乳酸）中12 毒。 、糖的主要生理功能是（氧化供能），其次是（构成组织细胞的成分），人类食物中的13 糖主要是（淀粉）。、糖尿病患者，由于体内（胰岛素）相对或绝对不足，可引起（持续）性（高血糖），14 1 甚至出现（糖尿）），并释放能量的过程称（生H2O、营养物质在（生物体）内彻底氧化生成（CO2）和（15 物氧化），又称为（组织呼吸）或（细胞呼吸）。琥珀酸氧化呼吸链），两FADH2、体内重要的两条呼吸链是（NADH氧化呼吸链）和（16 2ATP）。条呼吸链ATP的生成数分别是（3ATP）和（）H2O17、氧化磷酸化作用是指代谢物脱下的（氢）经（呼吸链）的传递交给（氧）生成（ATP）的过程相（偶联）的作用。的过程与（ADP）磷酸化生成（ATP的主 要方式为（氧化磷酸化），其次是（底物水平磷酸化）。18、体内生成脱a-CO2是通过（有机物）的脱羧反应生成的，根据脱羧的位置不同，可分为（19、体内脱羧）。羧）和（B-氧化过程包括（脱氢）、（加水）、（再脱氢）、（硫解）四个步每一次B-20、脂酰CoA ）。）和比原来少2
生物化学(含实验)汇总
单选题 1：合成脂酸的亚细胞部位是1 2：DNA复制过程中连续合成是的哪条链？1 3：一个生物样品的含氮量为5%，它的蛋白质含量为5 4：每循环一次进位、成肽和转位三个步骤（狭义核糖体循环）的产物是1 5：胸腺嘧啶（T）不存在于1 6：转氨酶的辅酶3 7：核苷类似物5 8：结构与叶酸相似，竞争抑制二氢叶酸还原酶的活性4 9：转录后需要加工的mRNA 是1 10：DNA半保留复制2 11：真核生物的mRNA 5 12：决定氧化磷酸化速率的最主要的因素是1 13：关于核苷酸的功能叙述错误的是3 14：脂酸β-氧化的终产物是2 15：抗叶酸类4 16：体内还原型辅酶Ⅱ（NADPH+H+）主要产生于2 17：蛋白质生物合成的模板是2 18：以下不能促进脂肪动员的激素是4 19：在糖元分解中起始步骤是生成2 20：原核生物DNA的高级结构是2
1：生物大分子主要是指5 2：下列哪一个不是一碳单位5 3：糖异生最重要的生理意义是2 4：巴斯德效应是指氧供给充足时4 5：脂肪最主要的生理功能是1 6：嘌呤核苷酸的从头合成的特点是1 7：体内生成ATP的最主要方式是2 8：转录时涉及2 9：在肠道细菌作用下生成的胆汁酸属于2 10：尿嘧啶（U）不存在于2 11：DNA合成需要的原料是3 12：抗嘌呤类2 13：关于转氨基作用，描述错误的是3 14：翻译过程的终止是因为4 15：Tm值是指3 16：氮杂丝氨酸是下列哪种氨基酸类似物4 17：糖异生的关键酶4 18：前列腺素是下列何种物质的衍生物2 19：人体内各种活动的直接能量供给者是3
20：以下不能促进脂肪动员的激素是4 1：DNA复性是指2 2：关于酶的不可逆性抑制正确的是3 3：合成磷脂酰乙醇胺（脑磷脂）的活化碱基是1 4：转运内源性胆固醇3 5：S-腺苷甲硫氨酸的重要作用是5 6：冈崎片段产生的原因是4 7：糖原分子中的一个葡萄糖单位酵解成乳酸时净生成的ATP的摩尔数是2 8：酰基转移酶的辅酶1 9：合成脂酸的亚细胞部位是1 10：关于酶的非竞争性抑制作用正确的是2 11：抗谷氨酰胺类1 12：体内氨的储存和运输形式是3 13：DNA双螺旋结构模型是1 14：原核生物DNA的高级结构是2 15：脂蛋白的基本组成不包括5 16：转录后需要加工的mRNA 是1 17：Km值是3 18：转运内源性甘油三酯1 19：巴斯德效应是指氧供给充足时4
生物化学实验思考题
生物化学实验思考题
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生物化学实验考试试题
细胞破碎 1 常用的细胞破碎的方法有哪些？ 机械法：研磨，高速捣碎机;物理法:反复冻溶,超声波破碎，压榨法；化学与生物化学法:自溶，溶胀法，酶解法，有机溶剂处理。 2 有机溶剂法破碎细胞原理，常用的有机溶剂有哪些? 有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳。比如笨、甲苯、氯仿、二甲苯及高级醇等 ３酶法破碎细胞原理:酶分解作用 4反复冻融法破碎细胞原理：通过反复将细胞放在低温下突然冷却和室温下融化达到破壁作用 层析技术 1.什么叫层析技术？ 层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别（分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等),使各组分以不同程度分布在两个相，其中一个是固定相，另一个是流动相,从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。 2、按层析过程的机理，层析法分哪几类？按操作形式不同又分哪三类? 根据分离的原理不同分类,层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。 按操作形式不同又分层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。 3.指出常用层析技术的应用范围。 凝胶层析法:⑴脱盐;⑵用于分离提纯；⑶测定高分子物质的分子量;⑷高分子溶液的浓缩离子交换层析法：主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子 高效液相层析法:⑴液-固吸附层析；⑵液-液分配层析；⑶离子交换层析 ４.ＳeｐhadｅxG-１0０凝胶柱层析分离蛋白质原理是什么? 大小不同的分子经过的路线长短不同而达到分离作用。 ５．用SeｐhａdeｘG2５脱盐时蛋白质和盐哪个先出峰?蛋白质 6．相对分子量为8万和1０万的蛋白质能否在SephadｅxＧ－７5柱中分开？为什么？不能,分子量差距太小。 7．将分子量分别为a(9０000）、b(45０0０）、c（１10 000)的三种蛋白质混合溶液进行凝胶过滤层析,正常情况下,将它们按被洗脱下来的先后排序。ｃ、ａ、ｂ 8.离子交换层析与凝胶过滤哪种分辨率高?离子交换层析较高。 9.如果样品中只有Ala和His(Ala pI=6．0，Ｈis pＩ＝7.6)，在ｐH4条件下，这两种氨基酸那一种与CM(阳离子交换剂)结合的紧密?如果用pH4-7的洗脱液梯度洗脱，那种氨基酸先洗脱出来？Aｌa 10. 柱层析时湿装柱的注意事项有哪些？ 用水灌注、不能有气泡。 11.说说离子交换层析中洗脱液的选择原则