酵母质粒的提取
酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建和转化
酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建和转化质粒构建和转化是进行酵母菌表面展示的重要步骤之一。
在这一过程中，我们需要合成包含目标基因序列的质粒，并将其转化到酵母菌细胞中。
下面是酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建和转化的详细描述。
1. 质粒构建质粒是一种带有自主复制序列的DNA分子。
在酵母菌表面展示中，我们需要构建一种质粒，其中包含用于表达和展示目标蛋白的基因序列。
a. 选择适合的质粒载体：选择合适的质粒载体，例如pYD1或pPICZα，这些载体在酵母菌表面展示中被广泛使用。
b. 插入目标基因：根据目标基因的序列设计引物，通过PCR扩增目标基因，并在引物的末端添加限制酶切序列，以便后续的质粒构建。
c. 酶切和连接：将PCR扩增产物与质粒载体进行酶切，并使用连接酶将两者连接起来。
此步骤需要选择合适的限制酶，并优化酶切和连接的条件。
d. 转化大肠杆菌：将连接好的质粒转化到大肠杆菌中，并通过培养和筛选获得含有目标质粒的克隆。
2. 酵母菌质粒转化在完成质粒构建之后，我们需要将质粒转化到酵母菌细胞中。
转化是指将质粒导入到细胞内，并使其在细胞内复制和表达。
a. 制备质粒：从大肠杆菌培养物中提取包含目标质粒的质粒DNA。
使用质粒提取试剂盒按照厂家说明书进行质粒提取。
b. 酵母菌预处理：用含有酵母菌培养基预处理酵母菌细胞。
这一步骤可以增加酵母菌细胞对质粒的转化效率。
c. 质粒转化：将预处理后的酵母菌细胞与质粒DNA一起孵育。
孵育温度和时间依据具体的实验要求进行设置。
质粒转化的方法包括热激冷冻法、锂乙酸法等，选择合适的方法进行转化。
d. 筛选阳性克隆：将经过转化的酵母菌细胞转移到含有适当选择压力的培养基中，并在培养基上筛选出带有目标质粒的阳性克隆。
这些步骤是进行酵母菌表面展示的质粒构建和转化的基本操作流程。
在每个步骤中，实验者需要采取严谨的操作、选择合适的试剂和工具，并根据实验要求进行优化。
通过这一步骤，可以成功构建和导入目标质粒，为后续的酵母菌表面展示实验奠定基础。
质粒三种提取方法的比较(精)
（三）小量一步提取法
1.取0.5ml细菌过夜培养物，置1.5ml的Eppendolf管中 2.加入0.5ml的氯仿：异戊醇，用振荡器最大速度振荡1min， 充分混匀。 3.12000g，离心5min，取上清移至另一个Eppendolf管中， 加入500µl异丙醇混匀，立即12000g，离心5min。 4.弃上清，加入500µl70%乙醇漂洗沉淀，短暂离心。 5.弃上清，室温干燥沉淀2min，然后加入20μl无菌水溶解 DNA。
材料、设备及试剂
一ห้องสมุดไป่ตู้材料
含卡那酶素的E. coli DH5α，1.5ml塑料离心管(又称 eppendorf管), 离心管架。
二、设备
微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机，恒 温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器， 电 泳仪，琼脂糖平板电泳装置和 恒温水浴锅等。
[注意]
1. 提取过程应尽量保持低温。 2. 提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/ 氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量 除干净需多次抽提。 3. 沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时 间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA 可用异丙醇(一 般使用等体积), 无水乙醇（2-2.5倍体积），区别？。
DNA双链
变性 强碱 中性 复性 DNA单链
闭合环状的质粒DNA，在变性后不会 分离，复性快；
染色体线性DNA和或有缺口的质粒 DNA变性后双链分离，难以复性而形成 缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结 合在一起，在离心的时候沉淀下去。
变性
煮沸法：
将细菌悬浮于含Triton X-100和能消化细胞壁 的溶菌酶缓冲液中，然后加热到100℃使其裂 解。加热除了破坏细胞壁外，还有助于解开 DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体 DNA变性。但是，闭环质粒DNA彼此不会分 离，这是因为他们的磷酸二酯骨架具有互相 缠绕的拓扑结构，当温度下降后，闭环DNA 的碱基又各自就位，形成超螺旋分子，离心 除去变性的染色体核蛋白质，就可从上清中 回收质粒DNA
提取质粒的原理
提取质粒的原理质粒是一种环状的DNA分子，存在于细菌、酵母等微生物细胞中，具有自主复制和传递的能力。
质粒在基因工程中扮演着重要的角色，可以被用来携带外源基因并在宿主细胞中表达。
因此，提取质粒是基因工程实验中必不可少的步骤之一。
本文将介绍提取质粒的原理及其相关技术。
提取质粒的原理提取质粒的原理基于细胞裂解和质粒分离的过程。
一般来说，提取质粒的步骤包括以下几个方面：1. 细胞裂解首先需要将含有质粒的细胞进行裂解，使质粒从细胞内部释放出来。
细胞裂解的方法有多种，包括机械破碎、超声波破碎、化学裂解等。
其中，化学裂解是最常用的方法之一，其原理是利用化学试剂破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内部的物质释放出来。
常用的化学试剂包括SDS、EDTA、蛋白酶K等。
2. 分离质粒细胞裂解后，需要将质粒从其他细胞组分中分离出来。
质粒的分离方法有多种，包括离心、柱层析、电泳等。
其中，离心是最常用的方法之一，其原理是利用离心力将不同密度的物质分离开来。
在离心过程中，质粒会沉积到离心管底部形成沉淀，其他细胞组分则会在上层形成上清液。
此时，可以将上清液倒掉，留下质粒沉淀。
3. 纯化质粒分离出的质粒可能会受到其他杂质的污染，因此需要进行纯化。
质粒的纯化方法有多种，包括酚-氯仿法、硅胶柱层析法、离子交换柱层析法等。
其中，酚-氯仿法是最常用的方法之一，其原理是利用酚和氯仿的不同溶解度将DNA、RNA和蛋白质分离开来。
在酚-氯仿法中，质粒会在上层形成一个白色的粘稠物质，其他杂质则会在下层形成。
提取质粒的技术提取质粒的技术有多种，包括常规提取法、快速提取法、自动提取法等。
其中，常规提取法是最常用的方法之一，其步骤如下：1. 细胞裂解将含有质粒的细胞进行裂解，使质粒从细胞内部释放出来。
常用的化学试剂包括SDS、EDTA、蛋白酶K等。
2. 分离质粒将裂解后的细胞进行离心，分离出质粒沉淀。
3. 纯化质粒将分离出的质粒进行酚-氯仿法纯化。
4. 洗涤质粒将纯化后的质粒进行洗涤，去除残留的酚和氯仿。
提取质粒原理
提取质粒原理质粒是一种存在于细菌和酵母等微生物细胞内的可自主复制的DNA分子，是重要的基因工程载体。
提取质粒是基因工程中常见的操作步骤，其原理主要包括细菌培养、DNA提取、酶切、连接等多个环节。
首先，进行细菌培养。
在进行质粒提取前，首先需要进行细菌培养，将含有目标质粒的细菌菌落接种到含有适当抗生素的培养基中，进行培养。
培养的条件包括温度、pH值、氧气含量等，需要根据具体的细菌菌株来确定最适合的培养条件。
其次，进行DNA提取。
DNA提取是提取质粒的关键步骤，可以利用化学方法或商用DNA提取试剂盒进行提取。
在提取过程中，需要注意保护DNA不受到外界的污染和降解，以保证提取的DNA质量。
接着，进行酶切。
酶切是利用限制性内切酶对目标DNA进行特异性切割，得到所需的DNA片段。
在酶切过程中，需要根据酶切位点设计合适的引物，控制酶切反应的条件，以确保酶切的准确性和高效性。
然后，进行连接。
连接是将目标DNA片段与质粒进行连接，形成重组质粒。
连接的方法包括经典的T4 DNA连接酶法和无酶法连接等，需要根据实验的具体要求选择合适的方法。
最后，进行质粒鉴定。
鉴定提取的质粒是否包含目标DNA片段，可以通过PCR扩增、酶切鉴定、测序等方法进行验证。
鉴定结果的准确性直接影响后续的实验操作和研究结果的可靠性。
在实际操作中，提取质粒需要严格控制每个步骤的条件和操作，以确保提取的质粒具有高纯度、高浓度和高活性。
同时，需要根据实验的具体要求和目的，选择合适的提取方法和工具，以提高提取效率和成功率。
总之，提取质粒是基因工程中重要的操作步骤，其原理包括细菌培养、DNA提取、酶切、连接和鉴定等多个环节。
掌握提取质粒的原理和操作技巧，对于开展基因工程研究和应用具有重要的意义。
酵母质粒的提取注意事项
酵母质粒的提取注意事项1. 实验前准备在进行酵母质粒提取实验之前，需要准备好所需材料和试剂。
常用的材料包括酵母培养物、细胞裂解液、酶切酶、离心管、离心机等。
试剂方面，需要注意购买高质量的试剂，并按照说明书的要求保存和使用。
2. 细胞培养与处理在进行酵母质粒提取实验之前，需要进行酵母菌的培养和处理。
首先，将酵母菌接种到含有所需培养基的琼脂糖平板上，培养一夜，然后挑取单个菌落转移到液体培养基中，继续培养至所需菌量。
此外，在进行酵母菌细胞处理时，需要注意细胞浓度的控制，避免浓度过高或过低对实验结果产生影响。
3. 细胞裂解与质粒提取酵母菌细胞裂解是酵母质粒提取的重要步骤。
一般情况下，细胞裂解可通过化学方法、机械方法或酶解方法实现。
其中，酶解方法常用于酵母菌质粒提取，具有操作简单、效果较好的特点。
在进行细胞裂解时，需要注意裂解液的选择和浓度，以及裂解时间和温度的控制，以确保细胞完全裂解，质粒DNA充分释放。
4. 质粒DNA纯化与保存在进行质粒提取后，需要对提取得到的质粒DNA进行纯化和保存。
纯化可以通过酚/氯仿法、硅胶柱纯化法或商用质粒纯化试剂盒等方法实现。
在选择纯化方法时，需要根据实验要求和样品特点进行选择，并根据说明书的要求进行操作。
纯化后的质粒DNA应及时保存，可以用TE缓冲液稀释保存在-20°C或-80°C的冰箱中，以避免质粒DNA的降解和损失。
5. 实验操作注意事项在进行酵母质粒提取实验时，还需要注意以下几点操作事项：- 实验室操作要严格遵守无菌操作的要求，以避免外源性DNA的污染。
- 实验过程中注意个人防护，佩戴手套、口罩和实验服，避免实验中的化学品对身体造成伤害。
- 实验前应仔细阅读所用试剂的说明书，了解其性质和使用方法，按照要求准确称取和调配试剂。
- 实验中的离心操作要注意离心管的放置位置和离心速度的选择，以避免样品的溢出和离心管的破裂。
- 实验后要及时清洗实验台面和相关器材，保持实验环境的整洁和无菌。
质粒的制备
原理示意图
实验仪器、材料与试剂
（一） 仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机 5. 微量取液器
（二） 材料
• 含质粒的E. coli DH5a, JM109, Top10 菌株
（三） 试剂
• 1. LB液体培养基（1L） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至800ml 搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调 节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭 菌20 分钟。 • LB固体培养基（1L） 在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。
• 2. STE • 0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris·Cl (pH8.0) 1mmol/L EDTA(pH8.0) 在1.034×105Pa高压灭菌20分钟。 • 3. SolutionⅠ-resuspension solution Ⅰ 50 mmol/L 葡萄糖—使大肠杆菌保持悬浮，不沉淀 25 mmol/L Tris.·Cl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA (pH 8.0)--抑制DNase的活性 高压灭菌后，4℃保存备用。 • 4. SolutionⅡ(现用现配制) –lysis solution Ⅱ 0.2mol/L NaOH –裂解细胞 1% SDS –蛋白变性
Relaxed circle Linearized form Super-coiled form
13. 质粒定量：取1-5µl DNA样品，加水稀释至1ml，混匀后转 入 分光光度计的石英比色杯中(or Nanodrop)，测定 OD260 及OD280，并计算OD260/ OD280比值和DNA浓度： DNA浓度 OD260×稀释倍数×50/1000 （ µg / µl ） 浓度= 稀释倍数× 浓度
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序一、感受态细菌制备（CaCl2法）1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。
2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl 测600nm时OD值）。
3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min，4. 4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。
将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。
5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。
转移到一个离心管中，共8ml。
6. 冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。
7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。
分装成200μl 的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。
二、溶液的配置1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH 调PH至7.0，在补足水至1L。
高压灭菌20分钟备用。
2. 0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，称取1.1g CaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4℃保存。
另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份（10份）4℃保存。
3. 配置液体培养基时，高压灭菌20min备用；4. 配置固体培养基时+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min。
aidlab酵母质粒提取试剂盒
基因组 DNA 污染
质 粒 DNA 缺 口 或 者电泳时超螺旋带 前出现变性质粒带 *第一次做实验时，忘记将 RNase A 加入 YP1 溶液，RNase A 失 产物中含有 RNA 污染 活或者起始处理量过量-建议：第一次实验前确保将 RNase A 加入了溶液 YP1； YP1 溶液超过 3 个月的， 可加入一些新 RNase A；处理量不要过量；菌体重悬于 YP1 溶液后可放置几分钟让 RNase A 充分作用后再进行下一步。 *步骤 4 裂解时间过长-建议：裂解时间不要超过 5 分钟。
-20℃ -20℃ 4℃ 室温 室温 室温 室温 室温 室温 室温
试剂盒组成
RNaseA（10mg/ml） Lyticase 溶液 YP1 溶液 YP2 溶液 YP3 去蛋白液 PD 漂洗液 WB 洗脱缓冲液 EB 吸附柱 AC 收集管（2ml）
50 次
µl 150 150µ 0U 250 2500U 15 ml 15 ml 20 ml 25 ml 15 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 15 ml 50 个 50 个
3.
13,000rpm 离心 1 分钟，尽可能吸弃上清，加入 250μl 溶液 YP1 重悬菌体沉淀， 涡旋振荡至彻底悬浮。 如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
4.
加 250μl 的溶液 YP2， 温和地上下翻转 4 -7 次使菌体充分裂解， 室温放置 4 分钟。 温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组 DNA 剪切断裂！所用时间不应超过 5 分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘 -4-
1.
取 1.5-5 毫升酵母培养物(不超过 5X10 cells)，9,000rpm 离心 30 秒，尽可能的吸 弃上清，收集菌体。 收集超过 1.5 毫升菌液，可以离心弃上清后，在同一个 1.5ml 管内加入更多的菌 液，重复步骤 1，直到收集到足够的菌体。