细胞基因组DNA的提取.ppt
DNA的复制PPT课件
•Molecular Biology Course
(CsCl gradient centrifuge)
N15
DNA
N14
Semi-ConservationReplication
–第三阶段为DNA复制的终止阶段。DNA复制的整个 过程中需要30多种酶及蛋白质分子参加，我们将 在DNA复制的各个阶段着重介绍它们的作用。
•Molecular Biology Course
•Molecular Biology
Course （二）、复制的起始阶段
1、复制的起点 2、复制的方向 3、复制的速度 4、DNA复制起始引发体的形成及所参与的酶和 蛋白质
1、DNA半保留复制的机理 2、DNA的半不连续复制
•Molecular Biology
Course
1、DNA半保留复制的机理
Semi-Conservation Replication
DNA作为遗传物质的基本特点就是在细胞分裂前进行准 确的自我复制，使DNA的量成倍增加，这是细胞分裂的 物质基础。
当用缺乏糖苷酶的大肠杆菌变异株（ung-进行 实验时，尿嘧啶不再被切除。）
此时，新合成的DNA有一半放射性标记出现于岗 崎片断中，另一股直接进入大的片断。由此可 见，当DNA复制时，一条链是连续的，另一条链 是不连续的，因此称为半不连续复制（semidiscontinuous replication） 。
二、复制的起始阶段
•Molecular Biology Course
复制叉（ replication fork ）：DNA分子中正在进行 复制的分叉部位。它由两条亲代链及在其上新合成的子 链构成。
6动物组织细胞基因组DNA的提取和定量
10.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃ 或–20℃保存备用。
11.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。
【注意事项】
标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。
所用EP管、吸嘴等器物及ddH2O、试剂 等应高压灭菌，操作尽量在4℃以下进行。 混匀试剂、吸取上清等操作时应避免动 作剧烈。 弃异丙醇时动作应轻，切忌甩干，以免 DNA丢失。
动物细胞基因组DNA的 提取及定量
真核细胞基因组DNA的分离纯化
核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中
都以与蛋白质结合的状态存在。
真核生物的染色体DNA为双链线性分子.
大多数生物体内RNA分子为单链线性分子
分离纯化核酸总的原则：
应保证核酸一级结构的完整性 排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染 无其他核酸分子的体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝 状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新溶解。
4.加等量的酚·氯仿·异戊醇振荡混匀，
离心12000 rpm，5min。
5.取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿·异戊
醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。
6. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L
3. 对于很稀的核酸溶液，可用荧光光度法进行测 定。核酸经凝胶电泳后，在ＥＢ（溴化乙锭）中 浸染，核酸分子与溴化乙锭结合后， 能吸收300360nm波长的紫外光，同时诱发出波长为590nm 的红橙色荧光，从而可通过照像机摄影，凝胶成 像系统记录实验结果。此方法灵敏度高，10ng或 更少的DNA即可检出。
一、实验目的
掌握DNA定量的原理 掌握紫外分光光度仪的正确使用。
二、实验原理
植物生物工程实验二植物DNA的提取讲课文档
第三十三页，共41页。
6. 重复第3、第4步。
7. 每支离心管中加入等体积异丙醇（400－500μl）。上下颠倒 几次，4℃静置20分钟（或－20℃，15分钟）。（异丙醇用于 沉淀DNA）
8. 14，000rpm离心20分钟。小心倒出上清夜，避免DNA颗粒丢 失。倒置离心管，空气干燥（1－2分钟）。
第十六页，共41页。
测定结果分析
A：测DNA： 纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／OD230应大
于2.0。 1) OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。 2) 小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染； 3) OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如
第十九页，共41页。
根据OD260定量：
測定260nm吸光值，OD=1.0代表值如下：
a. ds DNA (double stranded DNA) = 50 mg/ml
b. ss DNA (single stranded DNA) = 40 mg/ml c. oligonucleotide = 33 mg/ml
1. 称取100mg新鲜叶片，置于预冷1.5ml离心管中，加入液氮， 研为细粉。加入350μl新鲜2×CTAB缓冲液，再仔细研磨。 （CTAB用于抽提DNA）
2. 用350μl新鲜2×CTAB缓冲液，冲洗研磨棒，加入2μlβ－ 巯基乙醇，混匀。65℃水浴45分钟，每15分钟摇动一次。 冷却至室温，静置2分钟。
抽提液
贮存液l 168ul 4032ul
异丙醇；70%乙醇；90%乙醇；10mg/ml EB
不可忽视的细节—血液基因组提取PPT课件
DNA提取原则2：DNA产物纯度
• 严格要求产物纯度
▪ 存档、产物长期保存 ▪ Southern杂交 ▪ 荧光定量PCR ▪ SNP Microarray ▪ CGH (比较基因组杂交)
• 没有严格要求
▪ 常规PCR
内容
DNA提取的原则 基因组提取方法 样本保存和前处理 基因组提取流程 DNA保存及检测方法 试剂选择原则
红细胞裂解充分的现象： 得到的沉淀应为白色沉淀或淡粉色沉淀。有时血液需要进 行两次裂解，注意第二次加入裂解液后需要将沉淀votex 彻底混匀。
核细胞裂解
如果有裂红的步骤，请尽量将上清去除再加入裂解液。 加入裂解液（如：TIANGEN试剂盒中的GB或FG）和蛋白酶K需要彻底混匀。 将沉淀打散混匀后再进行水浴。 水浴时看到溶液变清，没有粘稠物或沉淀时即可进行下步操作，通常水 浴时间10-30min. 若采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，动作要轻柔。离心分离两相 时，应保证一定的转速和时间，且吸取上清时注意不要吸取到中间层及 有机相。
不可忽视的细节
—血液基因组提取
天根生化科技（北京）有限公司
内容
DNA提取的原则 基因组提取方法 样本保存和前处理 基因组提取流程 DNA保存及检测方法 试剂选择原则
DNA提取原则1：DNA片段长度
DNA Length
严格要求片段长度:▪ 构建 ▪ PFGE(脉冲场凝胶电泳)没有严格要求:
▪ PCR ▪ Southern Blots ▪ RFLP
样本保存和前处理－微量血液/干血点/羊水/胸水
保存 微量血液：抗凝血液-20或-70℃保存； 干血点：干燥后室温或4℃保存； 羊水： -20或-70℃保存。 样本前处理 1. 微量血液处理同抗凝血液，不同之处是无需进行红细胞裂解步骤。 2. 干血点加入缓冲液直接进行提取。 3. 羊水/胸水提取时先离心得到沉淀，再进行裂解提取核酸。
实验三-细胞外周血DNA提取
步骤
6. 弃乙醇，敞开Eppendorf管盖，烘干（37℃恒温 箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA。（制成的 DNA液置于-20℃冰箱保存备用）
7．用DNA／RNA Calculator检测DNA的含量和纯 度。纯DNA的此比值约为1.8～2.0。纯RNA的比值 约为大于2.0。
步骤
8、限制性内切酶酶切：
实验三、外周血细胞基因组 DNA的提取 (NaI法)
基因组DNA提取原理
Loparev等报道利用NaI提取DNA的方法，从全血制 备白细胞DNA，可用双蒸水溶涨红细胞及白细胞膜， 释放出血红蛋白及细胞核。加NaI破核膜并使DNA 从核蛋白中解离，用氯仿/异戊醇抽提使蛋白质沉淀 完全（异戊醇去泡沫），DNA存在于上层水相中， 以异丙醇沉淀 DNA，离心弃去异丙醇，并重复操作 一次，即可获得白细胞DNA。
9、聚合酶链式反应：
步骤
a、25 ul标准PCR反应体系各成分终浓度如下：
b、标准PCR反应循环参数：
95℃：5 min预变性；94℃ 30s
63℃ 30s、 72℃ 60s， 共30个循环； 72℃ 7min。 c、置于4℃或-20℃保存。
模板DNA50～10ຫໍສະໝຸດ ngTaq DNA聚合酶
0.5～1 uL
PCR反应反复进行三步骤的循环过程： 热变性——退火——引物延伸 1）热变性：基因组DNA在95 ℃下加热5分，双螺旋结构被热变
性解链为两股单链。 2）退火：将反应混合物降温至55~65℃，引物与上述单链DNA
上互补的序列杂交在一起，即退火，形成模板——引物复合。 3）引物延伸：将反应混合物调节至72℃，在DNA聚合酶作用下，
上游引物 (10 uM)
1 uL
真核细胞基因组DNA的提取与鉴定
真核细胞基因组DNA的提取与鉴定一、目的要求掌握真核细胞基因组DNA的提取方法，掌握紫外分光光度法测定DNA含量的方法和DNA电泳方法。
重点实践植物 DNA 的抽提，掌握 CTAB 法快速抽提白三叶草 DNA 。
二、基本原理植物DNA的抽提常采用两种方法：（1）SDS 法：离子去污剂，过程长，纯度高；（2）CTAB 法：该方法简便、快速，DNA产量高(纯度稍次，适用于一般分子生物学操作) 。
CTAB是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。
CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM ）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl ）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。
经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。
再经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA 沉淀分离出来。
现生物试剂公司多依据此原理，经过改造，以吸附膜吸附DNA，除去杂质，从而减少了使用有害药品氯仿抽提的步骤。
琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法之一。
琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，将其熔化在所需缓冲液中使成清澈、透明的溶液，然后倒入胶模令其固化。
不同浓度的琼脂糖形成的固体基质具有不同的密度（或孔隙度），因此适宜分离不同大小的DNA片段。
在电场中，DNA分子主要因其分子大小不同而被分离。
三、实验步骤（具体见试剂盒操作说明）植物基因组DNA的提取（参考步骤）1．采集适量幼嫩叶片，用液N2 研成粉末，0.4 g 装入1.5ml 离心管中（-20 ℃预冷）。
2．预热 1.5 ×CTAB 到95 ℃，加1ml 到装有叶片粉末的离心管中，混匀（防止冻融）。
细胞基因组dna提取
细胞基因组dna提取一、细胞基因组DNA提取的概念细胞基因组DNA提取是指从生物体内的细胞中提取出其基因组DNA，以便进行分子生物学实验。
DNA提取是许多分子生物学技术和实验的前提，如PCR、限制性酶切、电泳等。
二、细胞基因组DNA提取的原理1. 细胞破碎：将细胞破碎以释放DNA。
可以使用机械方法（如超声波）、化学方法（如溶液中加入洗涤剂）或酶解方法（如加入蛋白酶）等方式进行破碎。
2. DNA分离：将破碎后的混合物离心，使得DNA沉淀到底部。
然后通过去除上层液体和洗涤沉淀来纯化DNA。
3. DNA溶解：将沉淀的DNA溶解在适当的缓冲液中，以便进行后续实验操作。
三、细胞基因组DNA提取的步骤1. 收集样品：收集需要提取DNA的样品，如血液、组织或菌落等。
2. 细胞破碎：使用适当的方法对样品中的细胞进行破碎，释放出DNA。
3. 清洁DNA：通过离心等方法将DNA沉淀到底部，去除上层液体和洗涤沉淀来清洁DNA。
4. 溶解DNA：将沉淀的DNA溶解在适当的缓冲液中，以便进行后续实验操作。
四、细胞基因组DNA提取的影响因素1. 样品来源：不同的样品来源对细胞基因组DNA提取有不同的影响。
如血液、组织或菌落等。
2. 细胞数量：细胞数量越多，提取到的DNA量越多。
3. 细胞类型：不同类型的细胞具有不同的细胞壁和膜结构，需要采用不同的破碎方法。
4. 存储条件：样品在收集后需要妥善存储，避免样品受到污染或降解。
五、细胞基因组DNA提取常用方法1. CTAB法：CTAB法是一种化学法，使用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）来裂解细胞壁和膜，并与核酸结合形成复合物。
该方法适用于高含量多酚类物质的样品。
2. 盐溶法：盐溶法是一种简单易行的方法，使用盐和洗涤剂来裂解细胞壁和膜，并与核酸结合形成复合物。
该方法适用于低含量多酚类物质的样品。
3. 商业化试剂盒：商业化试剂盒是一种快速方便的DNA提取方法，通过购买商业化试剂盒来进行DNA提取。
动物组织细胞基因组DNA提取
动物组织细胞基因组DNA提取一、实验原理真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组DNA。
真核生物的DNA 是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、月旨类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。
提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。
在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离,EDTA则抑制细胞中Dnase的活性;而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA 分子完整地分离出来。
二、仪器及试剂1. 仪器：恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（GeneQuant）、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）2. 试剂：（1）细胞裂解缓冲液：Tris（pH8.0）100mmol/LEDTA（pH8.0）500mmol/LNaCL20mmol/LSDS10%胰RNA酶20ug/ml(2)蛋白酶K：称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，C20°C备用。
(3)TE缓冲液(pH8.0):高压灭菌，室温贮存。
(4)酚？氯仿？异戊醇(25:24:1)、(5)异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。
三、操作步骤1.取新鲜或冰冻动物组织块0.1g(0.5cm3)，尽量剪碎。
置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K(500ug/ml)20pl,混匀。
在65C恒温水浴锅中水浴30min,也可转入37C水浴12〜24h,间歇振荡离心管数次。
于台式离心机以12000rpm离心5min,取上清液入另一离心管中。
2•加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul吸头挑出，凉干，用200ulTE 重新溶解。
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? 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间
? 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相 应的去杂质的方法
四、注意事项 ——核酸沉淀、溶解
? 当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀， 沉淀会更充分
? 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利 于充分沉淀
? 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量 少，纯度低
? 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：
? 植物材料－－液氮研磨 ? 动物组织－－匀浆或液氮研磨 ? 组培细胞－－蛋白酶K ? 细菌－－溶菌酶破壁 ? 酵母－－破壁酶或玻璃珠
? 高温温浴时，定时轻柔振荡
四、注意事项 ——核酸分离、纯化
? 采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提 供相应的缓冲体系
原 因
1. DNA中含有蛋白、 多糖、多酚类杂质
2. DNA在溶解前，有
酒精残留，酒精抑 对
制后续酶解反应
策
3. DNA中残留有金属 离子
1. 重新纯化DNA，去 除蛋白、多糖、多酚 等杂质
2. 重新沉淀DNA，让 酒精充分挥发
3. 增加70％乙醇洗涤 的次数（2-3次）
五、DNA提取常见问题
?问题二： DNA 降解
以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂
? 核酸提取的一般过程 2）破碎抽提核酸除去杂质
1．首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与 其它成分分离 2．使核酸与蛋白质分离 3．除去脂类 4．多糖的除去
? 核酸提取的一般过程
3）核酸的纯化 根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污
染,并除去提取过程中的系列试剂 (盐、有机溶剂 等）杂质，最后得到均一的核酸样品。
? 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和 噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。
一、实验原理
2、核酸制备的一般原则
? 分离纯化核酸总的原则： ①应保证核酸一级结构的完整性； ②排除其它分子的污染。
? 核酸纯化应达到的要求： ①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高 浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。
对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断， 但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制 RNase更重要。
? 核酸酶的抑制和抑制剂
DNase抑制
①加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA 或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 ②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使 DNase失活。
如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC
? 核酸制备中常用的酶
DNase RNase 蛋白酶 K 溶菌酶
? 核酸提取的一般过程 1）破碎细胞（防止核酸酶的作用）
微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。
酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。 动物：液氮处理后用匀浆器破碎。 细胞器DNA：首先纯化细胞器。
细胞基因组DNA的提取
银巍 中山医学院生化教研室
实验一 细胞基因组 DNA的提取
一、实验原理
1、核酸的分类
? DNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA， 如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA （cpDNA），质粒DNA。
? RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。
如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、 三异丙基萘磺酸钠
? 核酸制备中常用的蛋白质变性剂
蛋白质变性剂的作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造
成蛋白污染。 2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。
? 沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等 ? 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） ? 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解
? TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase ? pH值为8.0，可防止DNA发生酸解
五、DNA提取常见问题
?问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和 Pse抑制 ①操作要带手套。 ②所有器皿要严格消毒， ③试剂处理 ④低温操作
⑤在分离过程中要加入一定的 RNase抑制剂。
? 核酸制备中常用的去垢剂
核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用 于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂， 去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸 释放出来； 3．对 RNase 、DNase 有一定的抑制作用。
4）核酸样品的保存 核酸保存的主要条件是 温度和介质
温度： 4℃（5℃）最佳和最简单 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存
保存介质 ： TE缓冲溶液 (最常用 ) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0
实验目的
材料与试剂
实验操作与注意事项
纯化
IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
一、实验原理
4、核酸制备的一般方法和原理
? 核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶
活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当 然，几个条件并用更好。
对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械 张力拉断则更重要。
一、实验原理
3、核酸制备的一般原则
? 核酸制备时应注意的事项: ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解。 ③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解。
? 核酸制备的步骤：
I.材料准备
破碎细胞
II.破碎细胞或包膜－内容物释放
提取
III.核酸分离、纯化
,1000rpm,5min离心
四、注意事项 ——材料准备
? 最好使用新鲜材料，低温保 存的样品材料不要反复冻融
? 提取血液基因组DNA时，要 选择有核细胞（白细胞）
? 组培细胞培养时间不能过长， 否则会造成DNA降解
? 含病毒的液体材料DNA含量 较少，提取前先富集
四、注意事项 ——细胞裂解