肺吸虫和血吸虫总RNA的提取及电泳分析
总RNA的提取与电泳
电泳条带不清晰或出现弥散会影响对RNA质量的评估。
详细描述
电泳条带不清晰或弥散可能是由于RNA样品中存在杂质、电泳条件不合适、电泳槽未 彻底清洗等原因造成的。为解决这一问题，可以尝试对RNA样品进行再次纯化、调整
电泳条件、清洗电泳槽等方法。
实验操作中的安全问题
总结词
总RNA提取与电泳实验涉及多种危险因素， 需采取安全措施。
通过总RNA提取和电泳，可以对特定 组织或细胞中的基因表达谱进行分析， 了解基因在不同条件下的表达变化。
转录组学研究
总RNA提取和电泳是转录组学研究的 重要手段，有助于揭示基因转录水平 和调控机制，为疾病机制和药物研发 提供重要信息。
在疾病诊断和治疗中的应用
诊断标志物筛选
通过总RNA提取和电泳，可以发现与疾病相关的差异 表达基因，为疾病诊断提供新的标志物和检测方法。
核糖体RNA（rRNA）
由DNA转录而来，负责编码蛋白质，是细 胞表达蛋白质的主要方式。
存在于核糖体中，是合成蛋白质的必要成 分。
转运RNA（tRNA）
其他非编码RNA（ncRNA）
负责将氨基酸转运到核糖体，参与蛋白质 合成。
包括小干扰RNA（siRNA）、微小RNA （miRNA）等，在基因表达调控中发挥重要 作用。
详细描述
实验过程中涉及细胞培养、有机溶剂的使用 等，可能产生生物污染和化学污染。为确保 实验安全，应遵循实验室安全规定，穿戴适 当的防护服和手套，避免直接接触试剂和样 品，及时处理废物，保持实验室清洁卫生。
05 总RNA提取与电泳实验的应用和发展前景
CHAPTER
在基因表达研究中的应用
基因表达谱分析
3. 将混合物加入到凝 胶孔中；
总RNA的提取和检测 实验报告
实验二总RNA的提取和检测实验目的1.掌握从动物组织细胞中提取总RNA的方法；2.熟悉紫外吸收法检测RNA浓度与纯度的原理及测定方法；3.掌握RNA琼脂糖凝胶电泳方法并分析总RNA的电泳图谱；实验原理（一）概述1. 10-5µg RNA/细胞含有rRNA 80-85%：28S 18S 5StRNA, snRNA 10-15%mRNA 1-5%2. mRNA 3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA) 结构，可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。
3.RNA分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。
4.目前常用的是Trizol法。
（二）Trizol的主要成分1.Trizol 是一种新型总RNA 抽提试剂，主要成分是异硫氰酸胍和苯酚。
异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。
2.酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。
3.溶解组织细胞的混合物在氯仿作用下溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相中。
4.取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA。
(三)总RNA的纯度检测原理：不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系。
RNA在260nm紫外光波长处有最大的吸收峰。
因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/mL 的单链RNA。
用PH=7.6 的TE（tris HCl缓冲液）稀释RNA样品n倍并以TE为空白对照，根据此时读出的OD 260 值即可计算出样品稀释前的浓度:RNA (mg/mL) = 40×OD 260 读数×稀释倍数(n)/1000实验步骤（一）样品处理与Trizol用量1.提取组织RNA时，每50～100mg组织（即0.5×0.5×0.5cm,约合0.1cm3）用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；2.悬浮细胞先离心沉淀，每5-10×106个细胞加1mL Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。
运用Solexa高通量测序法鉴定日本血吸虫miRNAs
ＭｉｒＲＮＡ （ ＲＮＡ） 是 由 约 ２ ｃｏ ｍｉ ２个 核 苷 酸 组 成
按 常规方 法逸 出尾蚴 ，新西 兰大 白兔经腹 部贴
片感染 约２５ ０ 尾 蚴 ，４ ０ 条 ２ ｄ后 颈 动 脉 放 血处 死 兔
子 ，解 剖 ，打开胸 腔 ，用 门脉 冲虫法 分别收集 １ ４ｄ
ｇ的 总 ＲＮＡ， 回 收 １ ８～３ 个 碱 基 的 片 段 ， 用 ０
Ｓ ｐ ｒ ｒ ｔ Ｉ（ｎ ｉｏｅ ） 进行 反转 录 ，而 后 分 别 ｕ ｅ ｃｉ ｓ ｐ Ｉ ｉ ｔ ｇｎ ｖｒ
ｍ Ｒ Ａ ， 中保 守 ｍｉ Ｎ ｓ６条 ， 日本 血 吸 虫 特 有 的 ｍｉ Ｎ ｓ１ 条 。该 法 避 免 传 统 克 隆 方 法烦 琐 的程 序 ，具 有 成 ｉＮ ｓ 其 Ｒ Ａｌ Ｒ Ａ ８
本 低 ，效 率 高 的特 点 。
关 键 词 ： 日本血 中图 分 类 号 ：Ｓ８ ２ ７ ５ ５ ． ３ 文 献 标 志 码 ：Ｂ 文 章 编 号 ：０ ２ —０ ７ ２ １ ） ４０ ３ —３ ５ ８９ １ （ ０ １ ０ — ７ ０ ９
移 到 一 ０ 冰箱 保存 。 ８℃
１ １ ２ 总 ＲＮＡ 的提 取 ． ．
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取 适量 的 Ｅ本 血吸虫 虫体 于 １ ５ｍ Ｐ管 中液 ｔ ． ＬＥ 氮研 磨 ，应 用 Ｉｖｔ ｇｎ公 司 的 Ｔｉ ｌＲ ａｅｔ ｎ ｉｏｅ ｒ ｒ ｏ ｅｇｎ 提 ｚ 取 ，但在异 丙 醇沉 淀 时需 一 ２ ０℃过 夜 ，方 能彻 底 将
人类细胞质RNA提取RTPCR的原理方法琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用分析
2018/11/27
提取RNA
（三）、注意事项
6、设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。 7、防止RNA酶污染 （1）RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌 等 （2）严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操 作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻 璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污 染。 （3）最大限度地抑制内源性的RNA酶；而各种组织和细胞中 则含有大量内源性的RNA酶。
操作步骤
（三）cNDA合成 （2）一步法RT-PCR
在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转 录和PCR优化的条件下，在同一管内进行。 优势：在处理大量样品时易于操作；减少残余 污染；可以得到更高的灵敏度。 缺点：无法优化反应条件；一旦失败，必须重 新提取总RNA。
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操作步骤
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RT-PCR的原理、方法
实验原理
1、单拷贝基因表达存在逐步放大 机制。 2、PCR技术，即聚合酶链式反应。 反应分三步：变性，退火，延伸。 3、逆转录酶。可以以RNA为模板合 成cDNA第一条链，或者以第一条 DNA链为模板合成互补的双链 cDNA。
可见，RT-PCR是一种将cDNA 合成与PCR技术结合分析基因表达 的快速灵敏的方法。
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选择缓冲液系统
STEPS
does matter
常用的电泳缓冲液有EDTA （pH8.0）和Tris-乙酸（TAE）， Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE） 等，浓度约为50mmol/L (pH7.5~7.8)。
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凝胶的制备
以稀释的电泳缓冲液为溶剂， 用微波炉配制一定浓度的溶胶， 灌入水平胶框或垂直胶膜，插入 梳子，自然冷却。
总RNA 的提取电泳检测及浓度和纯度的测定
总RNA 的提取、电泳检测及浓度和纯度的测定撰写人：黄晶一、实验原理1、总RNA的提取见分子克隆（第三版）上册P522 “用一步法从细胞和组织中同时制备DNA、RNA和蛋白质”2、RNA的电泳见分子克隆（第三版）上册P540 “按大小分离RNA: 在含有甲醛的琼脂糖凝胶上进行的RNA电泳”3、RNA的浓度及纯度测定见分子克隆（第三版）下册P1695 “DNA或RNA的分光光度法测定”二、实验准备1、配制0.1%的DEPC水，37℃培养箱内放置过夜，之后灭菌两次。
2、准备大、中、小进口枪头各一盒，1.5ml进口离心管、0.2ml 进口PCR管各一瓶，灭菌两次（公用）3、准备研钵（n）、勺子（n+1）、50ml、100ml量筒各一个，180℃烤4小时以上（n=提取RNA的个数）4、10×MOPS缓冲液、甲醛、30％双氧水、胶布、氯仿（sigma）、异丙醇（sigma）、75％乙醇（以上试剂及物品公用，实验前请确定其是否齐备）三、实验步骤（一）总RNA的提取1．液氮研磨组织，取100mg组织，加入1ml Trizol，室温放置5min2．加入200ul氯仿，剧烈振荡混匀，室温放置3min，之后4℃，12000g,离心15min 3．上清移入新管，加入1/5体积的氯仿，剧烈振荡混匀，室温放置3min, 之后4℃，12000g,离心15min4．上清移入新管，加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10min,之后4℃，12000g,离心15min5．弃上清，加入1ml 75%乙醇，振荡，4℃，7500g,离心5min6．弃上清，室温晾干，之后加入40ul DEPC水溶解（RNA不要完全干燥，否则不利于溶解）（二）RNA的电泳1．用3％-30％的双氧水浸泡RNA专用的电泳槽及胶板、梳子10分钟以上2．之后用0.1%的DEPC水洗涤3．配制1.2%的含有甲醛的琼脂糖凝胶1）称取0.36g RNA专用的琼脂糖，加入24ml DEPC水，熔化后冷却到60℃2）加入3ml 10×MOPS，混匀后再加入3ml甲醛，之后再加入3ul EB4．用DEPC水配制1×MOPS 100ml作为电泳缓冲液，55V 预电泳30-40min5. RNA电泳样品的制备1）将6ul RNA样品、1ul 10×MOPS、1ul甲醛、2ul RNA上样缓冲液混匀2）65℃加热10min,之后冰浴2min,短暂离心后可上样6．60V 电泳30-40min7．紫外检测（三）RNA浓度及纯度的测定1. 运行分光光度计中测定RNA的程序2. 200ul DEPC水作为空白, 5ul RNA样品+295ul DEPC水作为测量样品3. 测量的RNA样品的OD260/280应在1.8-2.0之间4. RNA样品的实际浓度等于分光光度计显示浓度ｘ60四、注意事项1. 整个实验过程中要戴口罩、一次性手套，一次性手套应经常更换，防止污染RNase2. 实验试剂及物品大多数为公用，请养成良好的实验习惯，用毕放回原处，试剂或物品用完或快用完，告知负责人，及时补充3．烤箱不能过夜工作，以免发生火灾4．DEPC为疑似致癌物，操作时应戴口罩、手套，小心吸取，避免污染实验台及物品注：10×MOPS的配制方法0.627g MOPS溶于12ml DEPC水中，加入1.2ml 1M NaAc (DEPC水配制)，用2M NaOH 调pH 7.0, 加入0.75ml 0.2M EDTA, 之后加入DEPC水定容为15ml。
13 【终版】RNA的提取和电泳检测
1 实验背景目的基因的获得RT-PCRNorthern 杂交cDNA 克隆 差异显示为什么提取RNA ？第一讲总RNA 的提取和电泳检测1 实验背景蛋白质, DNA, RNA, 糖类, 脂质, 多肽, 小分子物质等目标产物分离纯化杂质生物大分子提取的依据1 实验背景生物分子间差异电荷溶解度生物学性质亲和性物理化学性质分子量形态1 实验背景生物大分子提取流程原料的选择、前处理粗提纯化浓缩和保存样品分析与检测生物大分子提取的一般原则1 实验背景完整性纯度效率一级结构高级结构产量经济一般原则2 实验设计mRNA的特性单链线性分子核蛋白体核糖核酸，不稳定性，易被降解（2,3位有一OH，反应活性高）均一性: rRNA（28S、18S、5.8S、5S，占80%）mRNA（1%～5%）tRNA和小分子RNA （10%～15%)容易被RNA酶（RNase）破坏2 实验设计提取RNA的来源细菌酵母血液动植物组织（小鼠脾细胞）培养细胞同一来源的不同组织（如植物幼嫩叶片、成熟根和茎等）如何从脾细胞中提取总RNA？2 实验设计RNA 提取的基本过程浓缩检测脾细胞获得、培养12345纯化逆转录保存2 实验设计RNA 酶哪里有？外源：环境、器皿、耗材、试剂内源：组织本身含有的RNA酶RNA酶有链内二硫键，所以抗长时间煮沸和温和变性剂，变性后迅速重新折叠；RNA酶不需要二价阳离子激活，所以EDTA没用最好的办法是避免污染2 实验设计如何避免RNA酶的污染？试剂专用，最好使用新开封的，分小份保存，用后丢弃器皿、耗材、取液器专用勤换手套尽量简化操作步骤、缩短提取过程，以减少各种有害因素对RNA的破坏，把杂质的污染等降到最低程度等在操作中避免讲话使用RNA操作专用台2 实验设计如何破坏RNA酶的活性？变性剂：异硫氰酸胍、苯酚（蛋白质变性）、氯仿（除脂）等异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶变性剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。
昆虫总RNA提取
提取方法：SDS蛋白酶K法提取试剂：A液：Tris 0.05mol/L；NaCl 0.1mol/L；EDTA 0.1mol/L；Ph=7.0~8.0.B液：5%SDSC液：20mg/ml 蛋白酶KRNase 10mg/ml、Tris饱和酚（pH=8.0）、氯仿/异戊醇（24：1）提取步骤：（1）提取DNA前，先用70%的乙醇和无菌水先清洗虫体三遍，以去除虫体表面可能附着的杂质。
（2）取昆虫组织加入1.5ml离心管中，加入100µlA液用研磨棒研磨至基本透亮，再加入380µlA液冲洗研磨棒，然后加入B液60µl、C液6µl。
58℃金属浴3~4小时。
（3）加入RNase至终浓度100µg/ml，充分混匀后60℃金属浴30min。
（4）反应液冷却至室温，加入等体积的饱和酚，温和地上下转动混匀，反复该动作10min，切勿剧烈震荡。
温室5000g离心15min。
取上清至一干净的离心管中。
重复该步直至水相与液相交界处看不到白色的蛋白质为止，取上清。
（5）上清中加入等体积的氯仿/异戊醇，上下缓慢颠倒10次，室温8000g离心10min，取上清。
（6）上清中加入两倍体积的预冷无水乙醇，-20℃冰箱内放置10min，沉淀DNA，12000g 离心10min，弃上清。
（7）在留有沉淀的离心管中加入1ml 70%的预冷无水乙醇洗涤DNA，12000g离心5min，弃上清。
（8）管口向下，在室温自然干燥DNA，向干燥的DNA中加入适量TE（30~50µl）溶解，4℃保存。
DNA的检测纯度及浓度检测：使用微量分光光度计（NanoDrop2000/2000c）对所提取DNA进行检测，若OD260/OD280的值在1.7~1.9之间(>1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染)。
用于PCR扩增的DNA浓度应在100ng/µl左右。
完整性检测：取2~5µl样品与载样缓冲液（Loading Buffer）2µl混合，点样于1.0%的琼脂糖凝胶,然后置于1×TAE缓冲液中电泳，电泳电压为110V，时间约30min。
肺吸虫.血吸虫(2学时)PPT课件
病例分析与讨论
分析病例1
患者李某的咳嗽、咳痰、胸痛等症状与肺吸虫感染相符， 经检查发现肺部有虫卵和成虫，确诊为肺吸虫感染。
分析病例2
患者张某的腹痛、腹泻、发热等症状与血吸虫感染相符， 经检查发现粪便中有血吸虫卵，确诊为血吸虫感染。
分析病例3
患者王某同时出现肺吸虫和血吸虫感染的症状，经检查发 现肺部有肺吸虫卵和成虫，粪便中有血吸虫卵，确诊为肺 吸虫和血吸虫混合感染。
02
肺吸虫病的症状与诊断
症状表现
胸痛
感染肺吸虫后，患者可能会出 现胸痛症状，通常为胸骨下疼 痛，可放射至肩背部。
发热
部分患者感染肺吸虫后ຫໍສະໝຸດ 出现 发热症状，体温可升高至38℃ 以上。
咳嗽、咳痰
肺吸虫感染后，患者会出现咳 嗽、咳痰等症状，痰液多为白 色或黄色粘痰。
呼吸困难
肺吸虫感染严重时，患者可能 会出现呼吸困难，表现为呼吸 急促、气短等症状。
虫感染。
肺吸虫病的预防与治疗
01
02
03
注意饮食卫生
避免食用生的或未煮熟的 螺类、蟹类等水产品，以 预防肺吸虫感染。
加强环境卫生
改善居住和工作环境的卫 生条件，减少与肺吸虫感 染相关的风险。
治疗肺吸虫病
一旦确诊为肺吸虫感染， 应及时进行治疗。治疗主 要包括使用抗肺吸虫药物 和对症治疗。
03
血吸虫病的传播与预防
是肺吸虫感染还是血吸虫感染。
注意事项与误诊避免
注意事项
在诊断过程中，应注意询问患者的病史和流行病学情况，结合临床表现和实验室检查结果进行综合判 断。
误诊避免
避免仅凭一两个检查结果或临床表现就做出诊断，应综合考虑多方面的信息，避免漏诊和误诊。同时 ，对于无法确诊的患者，应及时转诊至上级医院进行进一步检查和治疗。
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肺吸虫和血吸虫总RNA的提取及电泳分析
吴宜琴;倪忠耘;张耀娟
【期刊名称】《南京医科大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】1999(000)004
【摘要】目的为构建肺吸虫ｃＤＮＡ文库，获得目的重组抗原，用以肺吸虫病的
诊断，而制备卫氏肺吸虫的总ＲＮＡ。
方法采用改进的一步法（Ａ和Ｂ）提取了卫氏肺吸虫成虫的总ＲＮＡ，提取了日本血吸虫成虫及其虫卵、小鼠肝脏的ＲＮＡ。
结果人睾丸组织的总ＲＮＡ经琼脂糖凝胶电泳，观察到方法Ａ所提取的肺吸虫、血吸虫及其虫卵的总ＲＮＡ在凝胶上只有一条略大于１８Ｓ的条带。
用方法Ｂ提取的肺吸虫以及血吸虫的总ＲＮＡ则出现２条条带，其中
【总页数】1页(P291)
【作者】吴宜琴;倪忠耘;张耀娟
【作者单位】南京医科大学寄生虫学教研室;南京医科大学寄生虫学教研室
【正文语种】中文
【中图分类】R383.2
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3.一种快速提取香蕉叶片总核酸、总RNA和总DNA的新方法 [J], 柴娟;冯仁军;
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刚;龙华晴;戴关海;任泽明;童晔玲;杨锋
5.昆虫离体细胞总膜蛋白的提取及双向电泳分析 [J], 蒋才富;刘凯余;洪华珠;彭蓉;郑进;彭建新
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