第2章 离心分离技术

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离心机的种类与用途
常速离心机 按照转速分类 高速离心机 超速离心机
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常速离心机

转速 <8000r/min R.C.F <1×104g 用途：分离细胞、细胞碎片、培养基残渣等固形 物的分离，也可用于酶的结晶等较大颗粒的分离
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高速离心机


转速 1×104～2.5×104 r/min R.C.F 1×104g～105g 用途：分离各种沉淀物、细胞碎片及较大的细胞 器等 为了防止离心过程中温度升高而造成酶等生物分 子的变性失活，有些高速离心机装设有冷冻装 置，谓之冷冻高速离心机。
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第一节 离心机的种类与用途
3.离心管 离心管主要用塑料和不锈钢制成： 不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。但用时 也应避免接触强腐蚀性的化学药品，如强酸、强碱等。
塑料离心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯
（PP）等，其中PP管性能较好。 塑料离心管的优点是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法 取出梯度。缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。 塑料离心管都有管盖，离心前管盖必须盖严，倒置不漏液。管 盖有三种作用：①防止样品外泄。用于有放射性或强腐蚀性的样品 时，这点尤其重要。②防止样品挥发。③支持离心管，防止离心管 变形。
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第一节 离心机的种类与用途
超速离心机：
r/min，最大离心力106g，有驱动和 速度控制系统，温度控制系统，真空系统（减少摩擦）。 新式的有微处理机（按编定程序运转，自动计算速度和 时间）。 z有40多种不同容量和性能的转头给用户选择。离心容 量由几十毫升至2升，分离的形式是差速沉降分离和密 度梯度区带分离，离心管平衡允许的误差要小于0.1克。 z超速离心机的出现，使生物科学的研究领域有了新的 扩展，它能使过去仅仅在电子显微镜观察到的亚细胞器 得到分级分离，还可以分离病毒、核酸、蛋白质和多糖 等。
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第一节 离心机的种类与用途
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第一节 离心机的种类与用途
分析性超速离心机的转头是椭圆形的，以避免应力集中于孔处。转头
通过一个有柔性的轴联接到高速的驱动装置上，转头在低温和真空的腔 室中旋转，转头上有2-6个装离心杯的小室，离心杯是扇形石英的，可以 上下透光，离心机中装有光学系统，在整个离心期间都能通过紫外吸收 或折射率的变化监测离心杯中沉降着的物质，在预定的期间可以拍摄沉 降物质的照片，在分析离心杯中物质沉降情况时，在重颗粒和轻颗粒之 间形成的界面就像一个折射的透镜，结果在检测系统的照像底板上产生 了一个“峰”，随着沉降的不断进行，界面向前推进，因此峰也移动，从 峰移动的速度可以计算出样品颗粒的沉降速度。
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离心机其他分类方式
间歇 半连续 连续
根据操作方式可分为
根据用途可分为
分析用 制备用 分析-制备两用
工业离心设备中，常见的有管式和碟片式两大类
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离心机简单示意
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第一节 离心机的种类与用途
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管式离心机
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碟片式离心机（喷嘴型）
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第一节 离心机的种类与用途
二.离心机的主要构造和类型：
离心机可分为工业用离心机和实验用离心机。实验用离心
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第一节 离心机的种类与用途
⑵ 荡平式转头：
这种转头有4或6个自由活动的吊桶（离心 套管），当转头静止时，吊桶垂直悬挂，当转 头转速达到每分钟200到800转时，吊桶荡至水 平位置，这种转头最适合做密度梯度区带离心 优点是梯度物质可放在保持垂直的离心管 中，离心时被分离的样品带垂直于离心管纵 轴，而不像角式转头中样品沉淀物的界面与离 心管成一定角度，因而有利于离心结束后由管 内分层取出已分离的各样品带。 其缺点是颗粒沉降距离长，离心所需时间 也长。
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第一节 离心机的种类与用途
高速离心机：
z最大转速为10000-25000rpm（r/min），最大相对离心力为
100000×g，分离形式也是固液沉降分离，通常配有各种角 式转头、荡平式转头、区带转头、垂直转头和大容量连续流 动式转头。 z一般都有制冷系统，以消除高速旋转转头与空气之间摩擦 而产生的热量，离心室的温度可以调节和维持在0-40oC，转 速、温度和时间都可以严格准确地控制，并有指针或数字显 示。 z通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、蛋白质的硫 酸铵沉淀物和免疫沉淀物等的分离纯化工作，但不能有效地 沉降病毒、小细胞器(如核蛋白体)或单个分子。
的离心机转数，然后将这两点间划一条直线，与图中RCF标 尺上的交叉点即为相应的相对离心力数值。
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转 速、 离 心 力 与 离 心 半 径 的 关 系
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第二节
离心方法的选择 X1：离心前粒子到旋转 轴的距离。 X2：离心后粒子到旋转 轴的距离。 S：一般在10-13秒左 右，故把沉降系数10-13秒 称为一个Svedberg单位， 简写S，量纲为秒。 例如，动物细胞的核 糖体沉降系数等于80S，它 的含义就是：80×10-13 s。 细胞及细胞的各组分的沉 降系数有很大的差异，所 以可以利用生物样品沉降 系数的差异采用离心技术 将他们彼此分开。 33
20Βιβλιοθήκη 第一节 离心机的种类与用途
⑷ 垂直转头： 其离心管垂直 放置，样品颗 粒的沉降距离 短，离心所需 时间也短，适 用于密度梯度 区带离心，离 心开始时和结 束时液面和样 品区带要作九 十度转向，因 而降速要慢。
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第一节 离心机的种类与用途
⑸ 连续流动转头： 可用于大量培养 液或提取液的浓缩与 分离，转头与区带转 头类似，由转子桶和 有入口和出口的转头 盖及附属装置组成， 离心时样品液由入口 连续流入转头，在离 心力作用下，悬浮颗 粒沉降于转子桶壁， 上清液由出口流出。
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超速离心机

转速 2.5×104～12×104 r/min R.C.F 106g或更高 结构： 离心管帽、冷冻装置和温控系统、真空系统、安
全保护系统、制动系统、指示仪表等。

按用途分：
制备型超速离心机：分离纯化生物大分子、细胞器。 分析型超速离心机：测定样品纯度（根据紫外吸收率或 折光率等判断）、沉降系数、相对分子量
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第二节
离心方法的选择
centrifugal force，RCF）: 由于在转速相同的情况下，离心力会随离心机转子的半径 或者离心管至旋转轴中心的距离变化，因此在文献中常用“相 对离心力”或“数字×g”表示离心力，RCF就是实际离心场转化 为重力加速度的倍数。 RCF = Fc/Fg = 1.12×10-5×n2×r •Fc为离心力； •Fg为地心引力； •r为离心转子的半径距离，以cm为单位； •g为地球重力加速度（980cm/sec2）； •n为转子每分钟的转数（r/min,或rpm）。
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rmin
rav 旋转轴 rmax
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第二节
离心方法的选择
为便于进行转速和相对离心力之间的换算，Dole
和 Cotzias 利用RCF的计算公式，制作了转速“rpm”、相对离 心力“RCF”和旋转半径“r”三者关系的列线图，图式法比公式 计算法方便。
换算时，先在r标尺上取已知的半径和在rpm标尺上取已知
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第一节 离心机的种类与用途
1.制备性离心机可分为三类:
低速离心机:
z最大转速8000
rpm左右，最大相对离心力约为10000g，容 量为几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离。可用水 平转头，角度转头 ，其转速不能严格控制。 z通常不带冷冻系统，于室温下操作，用于收集易沉降的大 颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。 z这种离心机多用交流整流子电动机驱动，电机的碳刷易磨 损，转速是用电压调压器调节，起动电流大，速度升降不 均匀，一般转头是置于一个硬质钢轴上，因此精确地平衡 离心管及内容物就极为重要，否则会损坏离心机。
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第一节 离心机的种类与用途
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第一节 离心机的种类与用途
⑶ 区带转头：
区带转头无离心管，主要由一个转子桶 和可旋开的顶盖组成，转子桶中装有十字型 隔板装置，把桶内分隔成四个或多个扇形小 室，隔板内有导管，梯度液或样品液从转头 中央的进液管泵入，通过这些导管分布到转 子四周，转头内的隔板可保持样品带和梯度 介质的稳定。
分析性超速离心机的主要特点就是能在短时间内，用少量样品就可以
得到一些重要信息，能够确定生物大分子是否存在，其大致的含量，计 算生物大分子的沉降系数，结合界面扩散，估计分子的大小，检测分子 的不均一性及混合物中各组份的比例，测定生物大分子的分子量，还可 以检测生物大分子的构象变化等。
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二、离心方法的选择
对于常速和高速离心机，由于所分离的颗粒
大小和密度相差较大，只要选择好离心速度 和时间，就能达到分离效果。 超速离心的离心方法：差速离心、密度梯度 离心和等密度梯度离心
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第二节
离心方法的选择
一.基本原理：
⒈ 离心力（centrifugal force，Fc）：
当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速 旋转下受到的离心作用力“Fc”由下式定义： Fc = m·a = m·ω2 r a：粒子旋转的加速度， m：沉降粒子的有效质量， ω：粒子旋转的角速度， r：粒子的旋转半径( cm )。
机又分为制备性离心机和分析性离心机。
制备性离心机主要用于分离各种生物材料，每次分离的样
品容量比较大，分析性离心机一般都带有光学系统，主要用 于研究纯的生物大分子和颗粒的理化性质，依据待测物质在 离心场中的行为（用离心机中的光学系统连续监测），能推 断物质的纯度、形状和相对分子质量等。
分析性离心机都是超速离心机。
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第一节 离心机的种类与用途
4.分析性离心机
分析性离心机使用了特殊设计的转头和光学检测系 统，以便连续地监视物质在一个离心场中的沉降过程。 从而确定其物理性质。 利用特殊配置的数据处理机自动计算s(沉降系数)和 Mr。主要用于生物大分子的相对分子质量测定，估价样 品纯度和检测生物大分子构象的变化等。主要产品有美 国Beckman公司的Model E及日本日立公司的282型。