本科实验——猪丹毒杆菌的检测
猪丹毒杆菌的分离及鉴定
动物科学现代农业科技2012年第4期猪丹毒（Swine Erysipelas，SE）也叫钻石皮肤病（diamond skin disease）或红热病（red fever），是由红斑丹毒丝菌（Ery-sipelothrix rhusiopathiae）引起的一种急性、热性传染病[1]。
临床与剖检特征为高热、急性败血症、亚急性疹块性和慢性疣状心内膜炎及多发性非化脓性关节炎[2]。
该病呈世界性广泛分布，是影响欧洲、亚洲、澳洲和美洲大陆经济的一种重要疾病[1]。
猪丹毒杆菌所引起的猪丹毒病广泛流行于世界各地，为我国主要的猪传染病之一，对养猪业造成严重的经济损失。
该试验按常规方法从疑似病例中采集病料，经常规分离培养及生化鉴定、动物试验，确诊为猪丹毒病。
1材料与方法1.1试验材料1.1.1病料来源。
病料来自昆明地区某猪场，疑似猪丹毒病死猪，采用无菌手续采取脾脏等组织备用。
1.1.2生化试剂。
葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糖、菊糖、D-甘露糖、木糖、鼠李糖、木糖、靛基质、M.R.、V-P、H2S、尿素、明胶、枸橼酸盐斜面、过氧化氢等。
1.1.3培养基。
鲜血琼脂培养基、马丁肉汤、马丁肉汤琼脂培养基。
按常规方法制备备用。
1.1.4试验设备。
小试管、培养皿、超净工作台、恒温培养箱、电子分析天平、生物显微镜、高压灭菌锅、低温冰箱等，均由云南农业大学动物医学实验教学中心预防兽医学实验室提供。
1.1.5试验动物。
ICR系20日龄健康小白鼠17~20g，2只，购自昆明医学院；家鸽2只，兔子4只，均购自昆明市盘龙区龙头街市场。
1.2试验方法1.2.1病原分离培养。
无菌取肝、脾、淋巴结等病料分别接种于鲜血琼脂培养基，37℃培养24~48h后，挑取可疑菌株再接种于马丁肉汤琼脂培养基作纯培养和生化试验鉴定[3]。
1.2.2分离菌株鉴定。
具体步骤如下：①镜检。
将分离菌株纯培养物直接涂片，火焰固定后革兰氏染色，镜检。
②糖发酵试验。
将分离菌株按常规方法分别接种于葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、菊糖、棉籽糖、鼠李糖、D-甘露糖、木糖半固体培养基，37℃培养24~48h，观察其对糖的利用情况并记录结果。
猪丹毒杆菌的分离和鉴定
从血清营养琼脂平板上挑取三株分离菌的单一菌落，分别接 种于新的血清营养琼脂平板上做纯培养，置37℃的温箱培养24h， 观察三株细菌的形态区别及生长情况。 2.3 染色镜检
2003：108-119. [2] 倪语星，洪秀华.细菌耐药性检测与抗感染治疗[M].北京：人民军
医出版社，2002.
110
猪丹毒（Swine Erysipelas，ES）也叫钻石皮肤病（diamond skin disease）或红热病（red fever），是由红斑毒丝菌 （Erysipelothrix rhusiopathiae）引起的一种急性、热性传染病[1]。 1 材料
2019年3月常熟某养殖场新引进母猪10头和育肥猪50头，饲 养2月左右，有4只猪不表现任何临床症状而突然死亡，送检病猪 1例，该病猪体温升高至41℃，精神萎糜，喜卧地，食欲时好时 坏，被毛无光，贫血下痢，背上还有红斑。剖检后可见全身皮下 脂肪及筋膜严重黄染，腹股沟淋巴结肿大，周边出血，心包积 液，心肌出血，肺充血、水肿，肝肿大，局部郁血，胆囊萎缩， 肾皮质有较多出血点，膀胱点状出血，肠系淋巴结肿大并周边出 血，胃底大面积出血，盲肠出血，疑似猪丹毒病例。分别对病猪 的肝、脾、肾进行了采样，作为实验材料以备使用。 2 方法 2.1 细菌的分离
挑取2.2中纯化的单个菌落加入10μl的16S-free H2O中，煮沸 10min后，离心取上清，按照16SrDNA Bacterial Identification PCR Kit（宝生生物工程（大连）有限公司）方法操作，PCR扩增出 1个产物，经琼脂糖凝胶电泳进行鉴定后，用Agarose Gel DNA Extraction Kit（Roche公司）回收，回收产物由金斯瑞生物科技进 行测序。 2.5 生化试验
猪丹毒的鉴定与防治
猪丹毒的鉴定与防治
猪丹毒是由猪丹毒病毒引起的一种病毒性传染病，对猪类造成严重危害。
本文将介绍猪丹毒的鉴定方法以及防治措施。
一、猪丹毒的鉴定方法：
1. 临床症状观察：猪丹毒的患病猪通常表现出食欲下降、发热、呼吸急促、消瘦、皮肤出现出血点等症状。
2. 病理学观察：猪丹毒的病变表现为全身性血管内凝血和组织淤血，脾脏肿大，肝脏和肾脏出现出血病变。
3. 实验室检验：可以通过猪血清的鉴定和病毒分离鉴定来确定是否感染猪丹毒病毒。
二、猪丹毒的防治措施：
1. 强化养殖管理：保持饲养环境的清洁卫生，加强饲养场的消毒管理，严禁外来猪只的进出，做好疫情监测和防控工作。
2. 疫苗接种：猪丹毒疫苗是预防该病的有效手段，猪场应根据养殖类型和区域性流行情况，选择合适的疫苗进行接种。
3. 健康检疫：引进猪只前必须进行健康检疫，排除携带猪丹毒病毒的猪只，防止病毒传播。
4. 彻底消毒：猪丹毒病毒对一些消毒剂有一定的抵抗力，因此在猪舍清洁消毒时，应选择有效杀灭病毒的消毒剂进行处理。
5. 合理饲喂：猪场要保证猪只的营养充足，特别是饲喂富含维生素C和抗氧化剂的饲料，有助于增强猪只的免疫力，降低感染病毒的风险。
6. 及时治疗：一旦发现猪只出现了疑似症状，应及时进行治疗，避免病情恶化和病毒传播。
猪丹毒的早期鉴定对于病情的控制和治疗非常重要。
通过加强养殖管理、疫苗接种、健康检疫、彻底消毒、合理饲喂以及及时治疗等措施，可以有效防止和控制猪丹毒的发生和传播。
实训13猪丹毒的检疫.
一、实训目的和要求
通过本次实训，使学生掌握猪丹毒的细菌学检查方法 。
二、实训材料ห้องสมุดไป่ตู้
疑似猪丹毒病猪及病料、鸽、豚鼠，鲜血琼脂平板，明胶 培养基，生理盐水，瑞氏染色液，革兰氏染色液，剪刀，镊子 ，一次性注射器，接种环，玻片，研钵，显微镜，恒温箱。
三、实训方法
1.涂片镜检 急性败血型取高热期的耳静脉血涂片，亚急性或慢性型病 例取肝脏、肾脏组织涂片和心内膜赘生物触片，如皮肤有疹块 时可在疹块边缘部挤取血液或渗出液涂片，经瑞氏或革兰氏染 色镜检，可见细小、平直或稍弯曲、多单在或成对或成堆的革 兰氏阳性小杆菌，在心内膜赘生物中多呈长丝状菌体。
三、实训方法
2.细菌分离培养 将病料接种于鲜血琼脂培养上，置37℃培养24h，可见针尖 样菌落，菌落周围可形成狭窄的溶血环。挑取可疑菌落染色镜 检，若为革兰氏阳性小杆菌，再挑取菌落作明胶穿刺37℃培养， 经3～4d后呈试管刷样生长，不液化明胶。
三、实训方法
2.动物接种 将病料研细，用生理盐水按1:5～10制成乳剂，血液或菌液 可直接注射。经胸部肌肉接种鸽子2只，0.5～1.0ml/只；同时 经皮下或腹腔接种豚鼠2只，0.5～1.0ml/只。 若病料中含有猪丹毒杆菌，鸽子于接种后1～4d死亡，豚鼠 不表现任何症状。剖检死亡鸽子，可见脾脏肿大，肺脏和肝脏充 血, 肝有时有坏死小点。死亡鸽内脏涂片镜检，可见有大量猪 丹毒杆菌，也可从内脏中分离出猪丹毒杆菌。
四、实训内容
1. 涂片镜检 2. 细菌分离培养 3. 动物接种
五、实训作业
3～5人分为一组，对疑似猪或实训动物进行涂片镜检、细 菌分离培养和动物接种；根据实训情况，写一份猪丹毒检疫 实训报告。
猪丹毒杆菌的分离鉴定及药物敏感性试验
227摘 要：为确诊导致石林县某养殖户饲养的生猪发生疫病而死亡的原因，本研究通过采集病死猪的肾脏、脾脏、淋巴等组织，经细菌的分离培养、形态观察、生化鉴定、动物试验等方法，确定分离菌株为猪丹毒杆菌，致病性较强，引起养殖户饲养的生猪发病的病因为猪丹毒；通过对分离菌株的药物敏感性试验，确定分离菌株对绝大多数抗生素产生了耐药性，对大部分β-内酰胺类抗生素敏感，青霉素类仍是治疗猪丹毒的首选药物。
近年来，猪丹毒临床病例有增多的趋势，广大养殖场（户）应重视猪丹毒的防治工作，降低经济损失。
关键词：猪丹毒杆菌；分离鉴定；药物敏感试验猪丹毒（Swine erysipelas）是由红斑丹毒丝菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）引起的猪的一种急性热性传染病[1]。
1876年Koch首次从患有败血病小鼠的血液中分离出本菌，1882年Louis Pasteur首次从病猪体内分离到本菌[2]。
目前该病在世界上大多数国家都有分布，呈散发或流行性发生，不同年龄、性别和品种的猪均有易感性，但以3个月以上的生长猪发病率最高，牛、羊、马、犬、家禽及一些鸟类均可发病，也能危害人类健康[3-4]。
临床病例可分为急性型、亚急性型和慢性型，急性型表现为体温急剧升高至42℃以上，病猪突然死亡，在颈部、耳后以及胸腹侧等处的皮肤上出现形状不同的红斑，手指按压会褪色；亚急性型表现为，在颈部、背部、胸侧以及四肢外侧等皮肤上出现不同大小的深红色疹块，扁平凸起，彼此间存在清晰界限；慢性型表现为皮肤坏死，浆液性纤维素性关节炎和疣状心内膜炎[5]。
猪丹毒的实验室诊断主要分为细菌的分离鉴定、血清学诊断和聚合酶链式反应（PCR）[6－7]。
本研究通过对临床疑似猪丹毒发病死亡的生猪进行解剖，采集肾脏、脾脏和淋巴结进行细菌的分离培养，通过形态观察、生化鉴定、动物试验及药物敏感性试验来进行诊断和分析，为猪丹毒的预防和治疗提供指导。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 病料 石林县某养殖户临床疑似猪丹毒发病死亡的生猪，经解剖，无菌采取肾脏、脾脏、淋巴结等组织待用。
猪丹毒杆菌的检验
动物实验
病理解剖和细菌分离 病理解剖，观察小鼠的内脏病理变化；无菌取小鼠的脾脏，触于血清平板， 37℃培养12~18h。记录结果。
1
2
四、操作步骤
结果与报告 综合以上生化试验、PCR鉴定和动物实验的结果，报告样品中检出或未检出猪丹毒杆菌。
实验六 猪丹毒杆菌检验
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猪丹毒(Swine erysipelas)是由猪丹毒杆菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)引起的一种人畜共患传染病，其主要特征为高热、急性败血症、皮肤疹块、慢性疣状心内膜炎及皮肤坏死与多发性非化脓性关节炎。
1
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction ，PCR）
2
（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction ，PCR）
猪丹毒杆菌的检测步骤
反应条件： 95℃，5min 95℃，1min 63℃，1min 40次循环 72℃，1min 72℃，10min
以无菌操作将各菌分别穿刺接种至SIM培养基中，将所有试管置于37℃下培养24-48小时。
自TSA琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺。
生化实验
四、操作步骤
如试管5：本试验可观察乳糖和葡萄糖发酵产酸不产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。
将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于20℃培养7天，逐日观察明胶液化现象。如室温高，培养基自行溶化时，可与冰箱内放置30分钟，然后取出观察结果，不再凝固时为阳性。
猪丹毒的鉴定与防治
猪丹毒的鉴定与防治猪丹毒是一种由病原微生物引起的猪类传染病，主要影响猪的生长和繁殖，严重危害养猪业的健康发展。
猪丹毒是一种常见的猪病，尤其在传染病较为普遍的地区更容易出现。
为了有效地预防和控制猪丹毒，养猪户必须了解猪丹毒的鉴定和防治方法。
本文将就猪丹毒的病因、临床表现、鉴定和防治等方面进行详细介绍。
一、病原微生物猪丹毒的病原微生物是丹毒杆菌，属于革兰氏阳性细菌。
丹毒杆菌是一种潜伏在自然界中的病原微生物，在适宜的温度和湿度条件下能够存活数月甚至数年。
它主要存在于土壤、粪便和烂草中，是导致猪丹毒的主要病原微生物。
二、临床表现猪丹毒的临床表现主要有以下几个方面：1.食欲减退：患病的猪常常出现食欲减退的现象，不愿进食或者食量明显减少。
2.运动不适：患病的猪在行走时出现明显的蹒跚，甚至无法站立，显得非常疲乏。
3.腹泻：患病的猪常常出现腹泻的现象，粪便呈水样便或者稀便，甚至伴有血丝。
4.皮肤黏膜出血：患病的猪的皮肤和黏膜出现出血点和出血斑，严重的还会出现皮下出血。
5.发热：患病的猪出现不同程度的发热表现，体温普遍升高。
三、鉴定方法1.临床症状鉴定：通过观察猪的临床表现来初步鉴定是否患有丹毒。
养猪户可以通过观察猪的食欲、体温、粪便和皮肤黏膜等情况来判断猪是否患病。
2.病原学鉴定：将疑似患病的猪的组织样本（如肝脏、脑组织等）送到专业实验室进行病原学鉴定，通过细菌培养和鉴定来确定是否感染了丹毒杆菌。
3.血清学鉴定：通过血清学试验来检测猪血清中是否存在丹毒杆菌的抗体，以确定猪是否感染了丹毒。
四、防治方法1.疫苗预防：现在有专门的丹毒疫苗可以用于预防猪丹毒，养猪户可以在猪的生长过程中定期注射丹毒疫苗，以提高猪的抗病能力。
2.消毒防治：养猪场的环境和设施要定期进行消毒，保持干净卫生，减少丹毒杆菌的传播和生长。
3.饲养管理：加强猪的饲养管理，饲料和饮水要干净卫生，避免猪的压力过大，保证充足的营养和休息。
4.隔离治疗：一旦发现猪患有丹毒，要及时将其隔离治疗，避免病情蔓延，以免影响到其他猪的健康。
猪丹毒的鉴定与防治
猪丹毒的鉴定与防治猪丹毒是一种由克隆氏菌属引起的急性传染病，主要发生在猪的皮肤和组织上。
本文将介绍猪丹毒的鉴定和防治措施。
1. 病理鉴定：猪丹毒的病理特征为皮肤出现红斑、水疱和坏疽，严重时出现溃疡和溃疡性皮炎。
皮肤切片病理学观察可见真菌孢子团。
2. 细菌学鉴定：从患猪的皮肤或淋巴结中取材，进行细菌学检测。
常用的方法有细菌培养、免疫荧光染色、PCR等。
3. 血清学鉴定：通过检测猪血清中的抗体水平来确定猪是否感染了克隆氏菌。
常用的方法有间接血凝试验、间接荧光抗体试验等。
4. 分子生物学鉴定：应用分子生物学方法，如PCR、DNA测序等，对病原体的基因进行检测和鉴定。
1.环境卫生管理：保持猪舍清洁，定期清理粪便和废弃物，减少克隆氏菌的滋生环境。
2. 营养保健：提供合理的饲料和营养，加强对猪的抵抗力，增强其免疫功能，减少感染克隆氏菌的机会。
3. 疫苗预防：猪丹毒的预防性疫苗可以有效减少感染风险。
定期给予猪接种疫苗，提高猪的免疫力。
4. 隔离防控：对于出现猪丹毒的猪群，要及时进行隔离和治疗，防止疾病的传播和进一步感染。
5. 使用药物治疗：在出现猪丹毒症状时，可以使用抗生素进行治疗。
常用的药物有青霉素、土霉素等。
6. 动物检疫：进口和交易猪只时，应进行严格的动物检疫，确保禽畜产品的质量与安全。
7. 提高养殖管理水平：加强猪的养殖管理，定期进行体检和隔离检疫，及时发现和处理疾病。
总结：猪丹毒是一种严重的动物传染病，对猪的养殖业造成了严重的危害。
为了预防和控制猪丹毒的发生，我们需要加强疫病的鉴定和防治工作，采取合理的措施来提高养殖管理水平，提高猪的免疫力，减少疾病的发生和传播。
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猪丹毒杆菌检验
1 实验目的
了解猪丹毒杆菌的检验方法
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 冰箱:2℃~5℃。
2.2 恒温培养箱:36℃士1℃，42℃士1℃。
2.3 恒温摇床：30-200RPM
2.4 凝胶成像系统仪器
2.5 显微镜
2.6 振荡器。
2.7 电了天平:感量0.1 g。
2.8 无菌锥形瓶:容量500 mL，250 mL（各6个）。
2.9 无菌吸管:1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL刻度)或微
量移液器及吸斗。
2.10 无菌培养皿:直径90 mm（12个）。
2.11 无菌试管:10 m m×75 mm（45个）。
2.12 无菌毛细管。
2.13 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
2.14 接种环、接种针（各6个）。
2.15 载玻片
3 培养基和试剂
3.1 缓冲蛋白胨水（BPW）
3.2 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基
3.3 胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）培养基
3.4 胎牛血清
3.5 三糖铁（TSI）琼脂
3.6 乳糖发酵管
3.7 半固体琼脂
3.8 蛋白胨水，靛基质试剂
3.9 SIM培养基
3.10 硝酸盐培养基
3.11 硝酸盐还原试剂（甲液：氨基苯磺酸；乙液：甲萘胺）3.12 革兰氏染色液（一套）
3.13 甲基红
3.14 1％明胶
3.15 香柏油
4 检验程序
5操作步骤
5.1增菌
以无菌操作取检样25 g( mL)，加在225 mL 营养肉汤中，以均质器打碎1 min 或用乳钵加灭菌砂磨碎，或置于盛有225 mL BPW 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min~2 min 。
若样品为液态，不36℃±1℃
120r/min ，8h 四区划线，挑取单菌落
挑取2~3环于3mL TSB 培养基（加血清）中 革兰氏染色
显微镜检测
MR 实验、V-P 试验、靛基质
试验、硝酸盐还原试验 MR —、V-P —、硫化氢+、靛基质—、硝酸盐还原—、
明胶穿刺—、TSI （产酸，不产气，产硫化氢）
36℃±1℃，24h 共4个试管 硫化氢试验、明胶穿刺
试验、TSI 实验 PCR 检测，凝胶电泳，凝胶成像
报告
36℃±1℃ 24h
检样
TSA 培养基（加血清）
25g （mL ）样品+225mL BPW
需要均质，振荡混匀。
无菌操作将样品转至500 mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃士1℃培养8 h~10h。
5.2 分离和观察
分别用接种环取增菌液1环，四区划线接种于TSA琼脂平板（加入胎牛血清），于36℃士1℃分别培养18 h~24 h，观察菌落形态。
挑取单菌落，进行革兰氏染色，后显微镜观察。
5.3 生化实验
5.3.1 自TSA琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺。
5.3.2 以无菌操作将各菌分别穿刺接种至SIM培养基中，将所有试管置于37℃下培养24-48小时。
5.3.3 将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于20℃培养7天，逐日观察明胶液化现象。
如室温高，培养基自行溶化时，可与冰箱内放置30分钟，然后取出观察结果，不再凝固时为阳性。
5.3.4 MR 实验、V-P试验、靛基质试验、硝酸盐还原试验检验。
5.3.5 PCR检测，凝胶电泳，凝胶成像
6结果与报告
综合以上生化试验和PCR鉴定的结果，报告25 g（mL）样品中检出或未检出猪丹毒杆菌。