猪瘟胶体金快速诊断法的研究进展

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非洲猪瘟病毒诊断方法研究进展

非洲猪瘟病毒诊断方法研究进展

摘要:非洲猪瘟属于我国的一类动物疫病,它是由非洲猪瘟病毒感染引起的导致猪伴发高死亡率的烈性动物传染病之一。

2018年8月,首次在我国的辽宁省沈阳市发现了ASF 疫情。

由于目前无有效疫苗,控制该病必须基于早期预防、检测以及严格的生物安全措施。

本文介绍了目前常用的非洲猪瘟病毒检测方法,为快速和准确诊断非洲猪瘟提供了一定技术参考。

关键词:非洲猪瘟;诊断方法;研究进展非洲猪瘟病毒诊断方法研究进展张小敏(如皋市畜牧兽医站江苏南通226500)doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2023.08.049收稿日期:2022-12-02非洲猪瘟(ASF )是由非洲猪瘟病毒(ASFV )引起的一种死亡率接近100%的烈性动物传染病。

由于高发病率和死亡率以及缺乏有效的疫苗,该病原体对全球养猪业与国民经济构成了严重威胁[1]。

ASF 是全球公认的一旦发现需立即上报世界动物卫生组织的烈性动物传染病,我国将ASF 划分为一类动物疫病。

ASFV 能代表整个病毒家族,且现阶段发现的DNA 虫媒病毒只有ASFV ,它是由基因组、核壳、内层衣壳和外层衣壳共同组成的二十面体病毒[1]。

ASFV 的基因组表观是一个呈线性结构的DNA 双螺旋分子,其长度范围在170~194kbp 之间,该病毒基因组包含150多个开放阅读框。

ASFV 复杂的病毒粒子组成、生命周期和免疫逃避机制给疫苗的开发带来了巨大的困难。

ASF 最早在1921年发生于肯尼亚[1],ASFV 最严重的传播发生在2007年的格鲁吉亚,从东非引进的国际餐饮垃圾中含有ASFV 污染的肉类,导致ASF 在整个欧洲和亚洲蔓延,对全球的养猪业造成了巨大损失。

感染ASFV 的猪及其制品、受污染的饲料、泔水、设施设备及工具等(包括运输车辆、人员装备、器具)均可成为传染源。

2018年,首次在我国的辽宁省沈阳市发现了ASF 疫情[2],随后全国多地陆续发生了多起感染事件。

猪瘟快速诊断金标试纸条的研制及应用

猪瘟快速诊断金标试纸条的研制及应用
光度计 测 定提 纯 抗 体 的浓 度 并 调 整 至 1 / L mg m 。用
双 向琼 脂 扩散 法测 其效 价 , 冷冻 保存 。
1 8
J u n l fAn ma ce c n tr a y Me i ie o r a i lS i n e a d Vee i r d cn o n
Vo . 0 13
No 3 .
2 1 0 1
2 2 胶体 金溶 液 的制备 .
2 3 3 胶 体金 与蛋 白质 的结 合 .. 按上 述 方 法 确定 两 种试 剂 的最适 用 量 比例 后 ,
取 00 . 1% 氯 金 酸水 溶 液 10 mL 0 ,加 热 至 沸 , 搅 动 下准 确加 入 1 柠檬 酸三 钠水溶 液 0 7m , % . L 金 黄色氯 金酸 水溶 液 在 2 m n内变 为 紫 红 色 , 续 煮 i 继 沸 1 i , 却后 以蒸 馏水恢 复 到原体 积 , 5m n 冷 如此制 备 的金溶胶 其 直径在 1 m 左右 。 5n
a i h o d rp rt n o ol i a od,t h o e 1 m oli a od lb l g o b i a t s i e fv rv r sa t o is s e l cd c lr e p e a ai f l d lg l o c o s 5 n c l d g l ei fr b t n i w n e e i n i de ,a s mb y i o c o o l a n a — u b i mmu o h o t ga h c d p t k,w ih wa s d t ee ts s i iu fc a sc ls i e fv rv r s b e tsr .T e r s l h we n c r mao r p i i si c h c su e o d t c u p co s o l si a w n e e i y ts t p u i h eut so d s

猪瘟野毒与疫苗弱毒鉴别方法的研究进展

猪瘟野毒与疫苗弱毒鉴别方法的研究进展

猪瘟野毒与疫苗弱毒鉴别方法的研究进展杭柏林;胡建和;王青;史杰;李杰;朱王飞【摘要】概述了当前鉴别猪瘟强弱毒的几种方法,即免疫学方法(胶体金免疫层析技术、单克隆抗体法和单抗-酶联免疫吸附试验)、核酸检测方法(RT-PCR技术、RT-PCR与其他方法的结合)和动物试验方法.同时提出了鉴别猪瘟强弱毒方法的发展方向.%This paper mainly summarizes differential methods of wild-type and vaccine virus of classical swine fever, which are immunology methods(GICA, McAb and McAb-ELISA), nucleic acid detection methods(RT-PCR and combination approach of RT-PCR with other methods) and animal test method.And the potential development directions of differential methods of wild-type and vaccine virus of classical swine fever are also proposed in this paper.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2011(039)002【总页数】3页(P138-140)【关键词】猪瘟病毒;野毒;弱毒;鉴别诊断【作者】杭柏林;胡建和;王青;史杰;李杰;朱王飞【作者单位】河南科技学院,动物科学学院,河南,新乡,453003;河南科技学院,动物科学学院,河南,新乡,453003;河南科技学院,动物科学学院,河南,新乡,453003;河南省新乡市畜产品质量监测检验中心,河南,新乡;河南省新乡市畜产品质量监测检验中心,河南,新乡;江苏省扬州市出入境检验检疫局,江苏,扬州,225000【正文语种】中文【中图分类】S855.9猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的猪的一种高度接触性传染病,常给养猪业造成严重的经济损失[1]。

胶体金免疫层析技术在猪病毒病检测中的应用

胶体金免疫层析技术在猪病毒病检测中的应用

68猪业科学 SWINE INDUSTRY SCIENCE 2023年40卷第10期猪场兽医VETERINARY1971年Faulk 和Taytor 等首次报道了胶体金免疫标记技术,早期主要应用于人绒毛膜促性腺素检测,后扩展到病原微生物检测领域,包括抗原和抗体检测两种类型。

胶体金免疫层析试纸条用在猪病抗体和抗原检测时很有优势,不需要仪器设备,操作简便,检测速度快,最快10 min 左右即可获得结果,价格便宜,基层兽医人员容易掌握,具有良好的应用前景和巨大的发展潜力。

本文综述了胶体金技术原理及在猪病毒病检测中的应用,一起为猪病毒病的诊断提供参考。

1 技术原理氯金酸在鞣酸、抗坏血酸、白磷等还原剂作用下,形成大小一定的金颗粒,呈稳定的胶体状,带有负电荷,故称为胶体金。

胶体金可以跟带正电荷的抗原或抗体分子稳定结合,而不影响其生物学特性,可与固定于硝酸纤维素膜上的抗原或抗体发生免疫反应,胶体金颗粒电子具有较高的密度,大量聚集时,形成肉眼可见的粉红色条带,因此,胶体金成为理想的免疫反应示踪标记物。

制备快速检测试剂主要操作步骤为,首先在玻璃纤维结合释放垫上加入金标记物,固定,干燥,一端与样品垫相连,另一端与硝酸纤胶体金免疫层析技术在猪病毒病检测中的应用马树芳(山东省滨州市滨城区农业农村综合服务中心,山东 滨州 256600)作者简介:马树芳(1972—),女,山东滨州人,本科,畜牧师,主要从事畜牧兽医相关工作维素膜相连,膜上加入特异性抗体或抗原,固定后作为检测线或质控线,硝酸纤维素膜另一端为吸水纸。

待测样品加入样品垫后,通过毛细管扩散或虹吸作用缓慢向前涌动,通过胶体金标记物位置时,水化标记物,样品中如含有待测物,则与其发生反应,后继续向前泳动,再与检测线上的抗体(或抗原)发生特异性免疫反应,复合物被检测线捕获,出现红色条带,否则检测线位置无条带,无论检测线是否有条带,质控线都会出现红色条带,因结合垫上添加有可与质控线处物质反应的金标记物,假如质控线无红色条带出现,则检测结果无效,反应示意图如图1所示。

胶体金免疫层析试纸条与ELISA检测猪瘟抗体的比对试验

胶体金免疫层析试纸条与ELISA检测猪瘟抗体的比对试验

养殖与饲料2015年第10期古典猪瘟(classical swine fever ,CSF )早称“猪瘟”(hog cholera ,HC ),是一种高度接触性传染病,遍布于全世界,世界动物卫生组织(OIE )将此病列为A 类传染病之一[1]。

为了从根本上解决猪瘟对养猪业的危害,我国开展了猪瘟等动物疫病净化的研究和实践工作,目前,ELISA 、PCR 、荧光法等常规的检测猪瘟抗原(或抗体)方法需要必要的仪器设备和试剂,费时费力,在基层兽医部门由于不具备工作条件和技术力量,很难开展[2]。

胶体金免疫层析试纸条是利用抗原抗体反应,在试纸条硝酸纤维素膜上预先固定好特异性抗原(或抗体)和第二抗体2种捕获剂,分别作为检测线(Test line )和质控线(Control line )[3]。

以猪瘟病毒特异性抗原融合胶体金与膜免疫层析技术,检测猪血清中猪瘟抗体,检测样品顺加样孔上移,血清中的猪瘟抗体与金标抗原结合,形成的抗原-抗体-胶体金复合物被检测线拦截,呈现红色检测线(T ),质控线拦截金标抗原后呈现红色质控线(C );当被检血清中不含猪瘟特异抗体时,检测线不显色,只呈现红色质控线。

现将胶体金免疫层析试纸条与ELISA 法检测猪瘟抗体的比对试验结果报告如下。

1材料与方法1.1血清样本的采集抽样113头,免疫猪瘟疫苗6周后的成年种猪,前腔静脉采血,血液离心,将同1头猪的血清分成2份,1份用于胶体金免疫层析试纸条检测猪瘟抗体,另1份用于ELISA 法检测猪瘟抗体。

1.2胶体金免疫层析试纸条检测猪瘟抗体1)胶体金免疫层析试纸条由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室提供,密封、干燥、4℃保存。

2)将冷藏的试纸条从冰箱中取出,待其恢复至室温再打开密封使用。

3)根据已编号的待检血清样品份数取出稀释杯,每杯加入200μL (约7滴)的稀释液,取1μL 的待检样品加入对应的稀释杯中混匀,1∶200稀释样品,取出试纸卡编号、平放,取稀释好的样品溶液100μL (约4滴)加入相应的试纸卡样品中,静置5~10min 后观察结果。

猪瘟诊断方法研究进展探析

猪瘟诊断方法研究进展探析

猪瘟诊断方法研究进展探析摘要概述了猪瘟诊断方法的研究进展,包括血清学诊断方法和病原学诊断方法,为猪瘟诊断方法的实际应用提供了技术帮助。

关键词猪瘟;诊断方法;血清学;病原学中图分类号 s858.285.3 文献标识码 a 文章编号 1007-5739(2009)05-0215-01猪瘟(classical swine fever,csf)是由猪瘟病毒引起的一种高度传染性的疫病,农业部将其列为一类传染病。

猪瘟临床可分为急性型、亚急性型、慢性型、非典型型猪瘟,以出血性败血症变化为特征。

猪是猪瘟病毒的唯一易感动物,本病流行广,传染快,死亡率高,一年四季均可发生。

本病自 1833 年在美国俄亥俄州发现以来,流行世界各地,给养猪业造成了不同程度的经济损失。

要控制猪瘟的流行和发生,必须强化猪瘟诊断方法的研究,数十年来,各国学者的倾力研究,促进了猪瘟诊断方法的的日趋完善和突破,为猪瘟的控制和消灭提供了良好的技术工具。

1 血清学诊断方法猪瘟elisa试验是世界动物卫生组织推荐的血清抗体检测方法。

clavijo等利用csfv e2基因表达产物制成单克隆抗体,建立了竞争elisa方法,利用此方法对临床健康猪和试验感染猪血清2 000份进行检测。

结果表明其特异性和敏感性分别达到100%和86%,并能在人工感染后21d检测到抗体。

周宗元等[1]应用猪瘟兔化弱毒抗原与hrp-spa建立了hrp-spa-elisa方法检测csfv抗体。

周广森等[2]应用hrp-spa-elisa对某猪场40份母猪血清和240份仔猪血清进行检测,发现母猪中有10%隐性猪瘟感染者,仔猪中有3.7%的隐性猪瘟感染者,证明了隐性猪瘟的母猪是垂直传播和水平传播的传染源。

shannon等[3]报道抗原捕获elisa能够检测2种不同株csfv感染的病猪血液和组织中的抗体。

余兴龙等[4]以在大肠杆菌中高效表达的csfv e2基因主要抗原编码区(me2)基因产物为抗原,以hrp标记的兔抗猪igg为二抗,建立了检测csfv抗体的间接elisa方法,试验证实用重组me2蛋白作为诊断猪瘟的抗原,具有特异性高、易纯化和成本低等优点。

胶体金免疫层析法检测猪瘟(强弱毒区分)抗体研究

胶体金免疫层析法检测猪瘟(强弱毒区分)抗体研究李华玮;郑鸣【摘要】以原核表达的重组猪瘟病毒E2蛋白为弱毒抗原,以猪瘟病毒(HCV)强毒株细胞培养物为强毒抗原,利用胶体金标记技术国内首次建立了HCV抗体检测(强弱毒区分)的免疫层析试纸条(双抗原夹心法).研究结果表明,检测时只需将80 μL待检测猪血清加于加样端20 min后观察结果即可.若观察区上端仅1条红色条带,即为HCV抗体阴性;2~3条条带即为HCV抗体阳性;若出现2条条带的位置为观察区上端和中间部位,即为HCV弱毒抗体阳性;若出现2条条带的位置位于观察区上端和下端部位,则为HCV强毒抗体阳性;若出现3条条带则HCV强弱毒抗体均为阳性.本试纸可很好地避免因试验操作造成的假阳性、假阴性,且操作简单、快速、简便、灵敏度高、特异好、不需特殊设备、价格低廉,20 min即可判断结果,且可区分强弱毒感染,适于基层实验室和现场检测.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2012(039)007【总页数】4页(P130-132,封3)【关键词】猪瘟病毒(HCV);细胞培养;胶体金免疫层析【作者】李华玮;郑鸣【作者单位】郑州牧业高等专科学校生物工程系,河南郑州450011;郑州牧业高等专科学校生物工程系,河南郑州450011【正文语种】中文【中图分类】S852.65+1猪瘟病毒属于黄病毒科瘟病毒属,有囊膜、耐热、不耐碱和脂溶剂,仅一个血清型。

猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种高度接触性传染病,猪是该病毒唯一的自然宿主[1-4]。

当前,猪瘟在我国各地区时有发生,每年因猪瘟而死亡的猪只占病死猪的1/3以上,是养猪业威胁最重的传染病之一,常造成猪场破产[5-7]。

当前猪瘟病毒在体内抗体压力或体外继代影响下,已形成强毒型和弱毒型,首发性病毒毒性较强,常发性病毒毒性较弱[8-9]。

强毒株对任何年龄和品种的猪种均有极高的致病和致死率;弱毒株仅有抵抗力差的猪才会感染,感染后不会死亡但活力不足,表现症状不典型而往往被忽视,但其可长期带毒传播,进而成为最重要的传染源[10]。

基于p54的非洲猪瘟抗体胶体金检测方法建立

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要:为了建立一种能快速检测非洲猪瘟的免疫胶体金方法,本实验根据非洲猪瘟病毒(ASFV )的p54基因的成熟肽序列,设计了有终止子(p54)和无终止子(p54-his )的基因片段,并分别在pET30a 载体中进行表达;将纯化后p54或p54-his 免疫ASFV 抗体阴性猪,制备相应多克隆抗体,4次免疫后用p54-his 或p54检测多克隆抗体效价;根据胶体金免疫层析原理,用金颗粒标记纯化的p54抗原作为金标垫,SPA 为检测线、p54多克隆抗体为质控线,优化条件,制作胶体金免疫层析试纸;最终用p54-his 的多克隆抗体检验试纸条的检测可行性。

结果显示,p54和p54-his 均能在pET30a 表达系统中可溶性表达,免疫猪后可产生特异性抗体,效价达10-6;以0.3 mg/mL p54抗原作金标垫、1 mg/mL SPA 为捕捉抗原、0.5 mg/mL p54多克隆抗体为质控线制作的试纸条能有效检出p54-his 抗体阳性血清。

表明建立的胶体金试纸条能作为非洲猪瘟抗体的快速检测方法进一步推广应用。

关键词:非洲猪瘟;p54;胶体金;原核表达中图分类号:S852.651文献标志码:A文章编号:1674-6422(2021)06-0050-05Development of P54 Based Colloidal Gold Detection Method for Detection ofAfrican Swine Fever Antibodies收稿日期:2021-09-05基金项目:2019“青蓝工程”中青年学术带头人资助项目(00000219011);2019江苏省教育厅重大项目及校级配套支持项目(19KJA520008,NSFZP202103)作者简介:戴建华,男,副教授,主要从事动物传染病与生物制药研究通信作者:基于p54的非洲猪瘟抗体胶体金检测方法建立戴建华,王豪伟,张紫菡(江苏农牧科技职业学院,泰州225300)2021,29(6): 50-54DAI Jianhua, WANG Haowei, ZHANG Zihan(Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College, Taizhou 225300, China)Abstract: In order to develop a colloidal gold method for rapid detection of African swine fever virus (ASFV), peptide fragments with terminator (p54) or without terminator (p54-his) were designed according to the published p54 gene sequence and expressed in pET30a vector in the prokaryotic expression. The purifi ed p54 or p54-his was used to immunize pigs without ASFV antibodies. After 4 times of immunization, p54-his or p54 was used to respectively detect the titers of polyclonal antibodies. According to the principle of colloidal gold immunochromatography, the purifi ed p54 antigen labeled with gold particles was set as the gold standard pad and SPA as the detection line while anti-p54 polyclonal antibodies was set as the quality control line. The conditions were optimized to prepare colloidal gold strips. Finally, serum samples with anti-p54-his polyclonal antibodies were used to check the feasibility of the strips. The results showed that both p54 and p54-his were expressed in pET30a in soluble form and induced specifi c antibodies with titers of 10-6. The optimized reaction conditions included gold strips with 0.3 mg/mL p54 as gold standard pad, 1 mg/mL SPA as capture antigen and 0.5 mg/mL anti-p54 polyclonal antibody as quality control line. The results showed that the colloidal gold test strips could be applied as a rapid detection method for antibody detection of African swine fever.Key words: African swine fever; p54; colloidal gold; prokaryotic expression· 51 ·第29卷第6期戴建华等:基于p54的非洲猪瘟抗体胶体金检测方法建立非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的猪的一种烈性、高度接触性传染病,对全世界养殖业造成了严重威胁[1-2]。

一步法胶体金快速诊断法与ELISA检测猪瘟抗体的比较

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 一步法胶体金快速诊断法与EL ISA 检测猪瘟抗体的比较顾 健1 张 燕2 陆义超1(1江苏常熟市虞山动物防疫站 215500 2江苏常熟市古里动物防疫站 215500) 免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。

胶体金是由氯金酸(HAuCl 4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下,聚合成为特定大小的金颗粒,并由静电作用成为一种稳定的胶体状态,称为胶体金。

胶体金在弱碱环境下带负电荷,可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合,由于这种结合是静电结合,所以不影响蛋白质的生物特性。

根据胶体金的一些物理性状,如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应,加上结合物的免疫和生物学特性,因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。

EL ISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。

结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。

在测定时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。

用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。

再加入酶标记的抗原或抗体,通过反应而结合在固相载体上,此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。

加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度。

我们用一步法胶体金快速诊断法与EL ISA 试剂盒对同一份血清样品进行猪瘟抗体水平检测,现将结果报告如下。

1 材料与方法一步法胶体金快速诊断试纸(上海快灵生物科技有限公司),猪瘟病毒抗体检测试剂盒(北京爱德士元亨生物科技有限公司)。

4种猪瘟病毒抗体检测方法的比较

4种猪瘟病毒抗体检测方法的比较马超英【摘要】为比较4种猪瘟病毒抗体检测方法的优缺点,应用正向间接血凝试验(IHA),间接ELISA、Dot-ELISA、胶体金免疫层析试纸条(GICA)4种方法分别对142份猪血清样品进行检测.结果表明,间接ELISA方法检出阳性样品119份,IHA检出阳性样品117份,Dot-ELISA检出阳性样品115份,GICA检出阳性样品109份.结果提示,在对猪瘟病毒抗体进行检测时,间接ELISA由于其灵敏性高,可作为首选检测方法,但操作时需要避免假阳性的出现;正向间接血凝试验虽然灵敏度稍低,对血清质量要求高,但结果准确,是猪瘟抗体检测必不可少的检测方法,适合个体检测;胶体金试纸条和dot-ELISA检测时间较短、操作简单、无需特殊仪器设配,由于受其敏感性较低所限,适合对畜群进行检测.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2012(033)010【总页数】4页(P128-131)【关键词】猪瘟抗体;检测方法;优缺点【作者】马超英【作者单位】青海省海西州乌兰县铜普兽医站,青海乌兰817000【正文语种】中文【中图分类】S852.651猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起猪的一种高度接触性、致死性的传染病,临床上主要以稽留高热、皮肤和黏膜出现大量出血点为主要特征[1]。

猪瘟具有高度传染性,主要通过呼吸道和消化道传染,传播速度快,发病率和病死率高,给全球养猪业造成了巨大的经济损失,世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物传染病,我国也将其列为一类动物疫病,是严重危害我国养猪业的最重要的疫病之一[2-6]。

近年来,我国猪瘟的流行和发病特点发生了很大变化,转变为隐性感染和亚病毒感染,在临床表现上也更加复杂,既有区域性流行,又有零星散发,既有高病死率的急性症状,又有持续感染的温和性症状趋于复杂化,出现了所谓“非典型猪瘟”、“温和型猪瘟”和“带毒母猪综合征”,在病理剖检上也常常不同于典型猪瘟的病理变化,给兽医临床诊断带来了很大困难[7]。

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