人椎间盘细胞髓核原代培养及细胞计数

人退变椎间盘髓核细胞的分离及培养
1.取髓核摘除手术切除的标本，置入预先准备好的内含少量DMEM／F12培养液的无菌培养瓶并置入冰盒内迅速带回实验室。

2.半小时内在超净台内，于烧杯内剪碎消化培养。

3.将取出的髓核组织用PBS液冲洗3次去除血污，弃去纤维环。

4.将胶冻样或软骨样髓核组织剪碎成1mm3大小的碎块。

5.37℃下以0.25％(m/v)的胰蛋白酶消化20min，每5min，轻轻摇动1次。

800r/min 离心5min，弃去上清液。

6.37℃下用0.2％的Ⅱ型胶原酶静置消化4h，至组织块逐渐消失。

800r/min 离心5min，去除上清液。

7.用DMEM/F12培养液吹匀细胞，再次离心，重复3次。

8.用计数板进行细胞计数，按1*106/ml接种于底面积为25cm2培养瓶中，加入5ml含青霉素100U/ml、链霉素100U/ ml和20％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养液。

37℃、体积分数为5％C02的培养箱中培养。

9.每2～3d换液1次，未较好融合前半量换液，每2d用倒置相差显微镜进行观察、拍照。

10.90％融合后用质量分数为0.25％的胰酶消化后1:2传代。

转染使用第二代的髓核细胞，可培养至第四代。

细胞计数：
实验用品：
0.4%台盼蓝溶液、无水乙醇或95%乙醇溶液、脱脂棉
普通显微镜、试管、吸管、毛细吸管、细胞计数板、绸布。

实验内容与方法：
（一）制备动物细胞悬液
将动物细胞用生物盐水制备成适当浓度的细胞悬液备用。

（二）细胞计数
1. 计数板处理
用无水乙醇或95%乙醇溶液擦拭计数板后，用绸布擦净，另擦净盖玻片一张，把盖片覆在计数板上面。

2. 染色
用滴管吸取0.4%台盼蓝染液，按1∶1比例加入细胞悬液中。

从计数板边缘缓缓滴入，使之充满计数板和盖片之间的空隙中。

注意不要使液体流到旁边的凹槽中或带有气泡，否则要重做。

稍候片刻，将计数板放在低倍镜下（10×10倍）观察计数。

3. 计数方法
按图计算计数板的四角大方格（每个大方格又分16个小方格）内的细胞数。

计数时，只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。

在一个大方格中，如果有细胞位于线上，一般计下线细胞不计上线细胞，计左线细胞不计右线细胞。

二次重复计数误差不应超过±5%（图7-1）。

镜下观察，凡折光性强而不着色者为活细胞，染上蓝色者为死细胞。

4. 计数的换算
计完数后，需换算出每ml悬液中的细胞数。

由于计数板中每一方格的面积为0.01 cm2，高为0.01 cm，这样它的体积为0.0001 cm3，即0.1 mm3。

由于1 ml＝1000 mm3，所以每一大方格内细胞数×10 000＝细胞数/ml，故可按下式计算：
细胞悬液细胞数/ml＝4个大格细胞总数/4×10 000
如计数前已稀释，可再乘稀释倍数。

计数细胞后，计算细胞悬液浓度并求出存活与死亡细胞数的比例。

注意事项：
向计数板中滴细胞悬液时要干净利落，加量要适当，过多易使盖片漂移，或淹过盖片则失败，需重做，过少易出现气泡；不理想时，应重做；
镜下计数时，若方格中细胞分布明显不均，说明细胞悬液混合不均匀，需重新将细胞悬液进行混合，再重新计数。