各种孔板细胞接种量
CCK-8中文说明书
贮藏条件残留。
为使CCK - 8试剂和培养基充分混匀，建议在加 入CCK - 8试剂后轻轻振摇培养板。
为了避免加样时由 于CCK - 8试剂在枪头上的残留所带来的误差，可以在 加样前用培养基稀释CCK - 8试剂并混匀后加样。
- 8甲臜，如果实验中有还原剂，请检查背景的O.D值， 即在不含细胞的培养基中加入药物，然后加入CCK - 8试剂在一定时间内检测，和不加药物的培养基进行比 较 (只加CCK - 8试剂)，如果O.D值明显偏高，则说明 有反应。
变化，建议更换新鲜的培养基后再加CCK - 8试剂。
含 有酚红的培养基不影响本试剂盒做细胞活性的测定。
600 nm以上) 作为参比波长，扣除参比波长的O.D值即可。
的实验，例如中性红法或结晶紫法 ，也可在CCK - 8法 检测完后继续进行。
线 ( 具体方法参见P.3页的“制作标准曲线”)。
量和加入CCK - 8试剂后的培养时间。
来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接种几个孔 就混匀一下。
培养板周围一圈孔培养基容易挥发，为 了减少误差，建议培养板的四边每孔只加培养基，而 不作为指标检测孔。
少而异。
一般情况下，白细胞较难显色，因此需要较长 的CCK - 8反应时间或增加细胞数量 (～105个细胞/孔)。
悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色。
对于悬浮细胞， 在加入CCK - 8培养1- 4小时后，可先从培养箱中取出， 目测染色程度或用酶标仪测定决定。
若显色困难，可 将培养板放回培养箱，继续培养数小时后再确定。
对 于贴壁细胞，CCK - 8的培养时间一般为1- 4小时，但 在培养30分钟左右即可取出肉眼观察显色程度 (根据 细胞种类而定，需要摸索一下条件)。
注意：CCK - 8 的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准。
行孔间的差异。
加 CCK - 8试剂时，建议斜贴着培养 板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡， 会干扰O.D值读数。
1 234567810注意事项：- 100 孔: 1 ml x 1 管试剂内含所需设备和材料：概述参考资料操作说明参考资料Q&A:。
各种孔板细胞接种量
各种孔板细胞接种量（总结下各种孔板细胞接种量仅供参考）：A6
l:
培养板细胞接种量生长面积容量细胞数（大约）-i（ q/ S 96孔板4~5X 10 435mm 培养皿1X 10 6' 48 孔板 1.3X 10 560mm 培养皿 2.6X 10 6
24孔板 2.5X 10 5100mm 培养皿7X 10 6
12孔板5X 10 5150mm 培养皿 1.8 X 10 7
6 孔板 1.2X 10 6
{" s; ?$ q8 l# |1 l
细胞瓶面积容量工作体积细胞数@(O0 0, n 12.5cm225ml 2ml 5X 10 5
25 cm250ml 5ml 1X10 68 VF8 }1 35 cm275ml 10ml 2X 10 6, A.
75 cm2250ml 15ml 4X 10 68 o9 _8 150 cm2700ml 40ml 1.1 X 107
6孔板底面积9.6cm2，加培养液的量2.5ml;
12孔板底面积4.5cm2，加培养液的量2ml ；
24孔板底面积2cm2，加培养液的量1ml ；
96孔板底面积0.32cm2，加培养液的量0.1ml。
补充：不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在2~3mm 范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量（参考下表）。
若加液量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。
具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。
注：各种单层生长的细胞在培养皿中长满的细胞数，主要取决于器皿底表面积和细胞体积的大小。
上表以Hela细胞为例给出的可获细胞量仅作参考。
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告细胞增殖实验是研究肿瘤细胞增殖和药物筛选的重要手段。
目前常见的肿瘤细胞增殖实验包括MTT法、SRB法、CCK-8法和细胞计数法。
本综述将介绍常用的MTT法和SRB法。
一、MTT法MTT法是一种常用的检测细胞增殖和细胞存活率的方法。
其原理是MTT剂通过被细胞还原，形成紫色沉淀，而细胞活性越强，则代谢产物越多，MTT的还原能力也越强，所以其颜色越深。
MTT法的步骤如下：1. 细胞接种：将待检测的细胞分离并接种到96孔板中，对照组和实验组各重复3次，每孔加入100 μl的细胞悬液。
2. 细胞培养：将孔板置于37℃、5% CO2培养箱中，培养24h，待细胞贴附后进入下一步。
3. 加入MTT：将MTT溶液加入孔板中，加入的量为100 μl/孔，最终浓度为0.5mg/ml。
4. 离心：孔板离心5min，去除上清，加入150 μl的DMSO，进行溶解。
5. 检测：将各孔450 nm波长下吸光度值读取，数据处理和结果分析。
MTT法适用于多种肿瘤细胞，操作简便，可用于初筛药物的活性。
然而，MTT法也存在局限性，如MTT还原能力受到某些实验条件影响，如细胞密度、孵育时间、细胞凋亡等，需要注意标准化操作。
二、SRB法SRB法是酸性快速比色法的缩写，它通过酸性溶液中蛋白质的沉淀和染色，反映了细胞的增殖情况。
该方法操作简单，速度快，结果信度较高。
步骤如下：3. 加入SRB：将SRB溶液加入各孔中，保持10 min。
4. 洗涤：将各孔反复洗涤至清晰。
6. 检测：将各孔570 nm波长下吸光度值读取，数据处理和结果分析。
SRB法比较适用于肿瘤细胞形态大而扁平的情况。
此外，SRB法还能够评价细胞的耐药性，并可用于筛选化合物对细胞增殖的抑制率，是一种较为全面的细胞增殖试验方法。
三、结论以上两种实验方法在检测肿瘤细胞增殖及药物筛选中具有重要的应用价值。
在操作上，需要严格地控制实验条件，确保数据的准确性和可靠性。
lipo2000转染protocal6孔板中文
转染6孔板
1、转染前一天，接种到6孔培养板上。
（4*105/ml.）
转染时，细胞要达到90~95%的融合。
细胞铺板在2ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
2、溶液A：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积250 ul）（温育5min）如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。
3、溶液B：246 ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well（总体积250 ul）（此为推荐剂量）
｛摸5个梯度分别是4 ug 质粒：4ul lipo，
4ug 质粒：6ul lipo
4 ug 质粒：8ul lipo
4ug 质粒：10ul lipo
4ug 质粒：12ul lipo
4、将溶液A与溶液B混合，室温下置20min。
5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。
6、将溶液A与溶液B的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
在37℃，5％的CO2中保温5~6小时。
7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO2中48~72h 检测转染水平。
8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例（根据细胞的生长情况）接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。
细胞毒性试验总结
（一）实验前应明确的问题1. 选择适当的细胞接种浓度.一般情况下,96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞.但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。
这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。
否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
2。
药物浓度的设定.一定要多看文献,参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。
根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。
切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
3. 时间点的设定。
在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）.4. 培养时间.200ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话,细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止,影响结果,我们是在48h换液的。
5。
MTT法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞绝对数。
做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
6。
理论未必都是对的。
要根据自己的实际情况调整。
7。
实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。
调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。
对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
8。
避免血清干扰。
用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值.由于试验本底增加，会试验敏感性。
因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。
在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液.(二）实验步骤贴壁细胞：1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至1000—10000孔,（边缘孔用无菌PBS填充）。
Matrigel体外侵袭实验,划痕实验,MTT试验的详细步骤及试剂
五、Matrigel体外侵袭实验所需：1、Transwell 小室2、上层培养液：含10g/L BSA的无血清培养液3、细胞：实验细胞4、基质胶：Matrigel基质胶为了方便运输和保存，一般是在-20℃（至少保存3个月），呈固体状态。
使用前要将Matrigel提前放入4℃冰箱冰上过夜（12h），Matrigel即融化为液体状态备用，避免反复冻融。
在冰冻和解冻过程中可能会发生颜色变化属正常现象，一旦解冻，晃动瓶子使其分散均匀。
Matrigel冰上维持液态，22～35℃可迅速凝结成胶，使用前接触Matrigel的试管、移液吸头等均须4℃预冷。
5、下层培养液：含FBS或趋化因子的培养液6、细胞培养板：12孔板，24孔板等十二、Matrigel 体外侵袭实验1.实验前的准备(1)使用前要将Matrigel提前放入4℃冰箱过夜，溶胶。
(2)接触Matrigel的试管、移液吸头等均须4℃预冷。
2．包被基底膜（冰上进行）(1)冻融后，用预冷的移液枪头混匀Matrigel基质成匀浆状。
(2)根据使用需要，用无血清的冷细胞培养基稀释Matrigel胶（稀释比例根据不同细胞系，比例约为1：6～1：3）。
(3)将稀释胶包被于所需的Transwell上室中，包被量至少覆盖整个生长表面，例120μl稀释胶加到12孔transwell上室中。
(4)37℃孵育1小时。
(5)去除未结合的Matrigel，用无血清培养基轻轻冲洗。
3.水化基底膜吸出培养板中残余液体，每孔加入50μl含10g/L BSA的无血清培养液，37℃，30min。
4.制备细胞悬液(1) 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12～24h，进一步去除血清的影响。
(2)常规消化细胞，终止消化后离心收集细胞沉淀，PBS洗1～2遍，用含10g/L BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至1～10×105个/ml（一般不超过5×105个/ml）。
5.接种细胞(1)取细胞悬液加入transwell小室。
细胞培养孔板相关知识。
细胞培养孔板相关知识。
细胞培养孔板是一种用于细胞培养的实验器具，具有多个孔洞，每个孔洞都可以进行单独的细胞培养实验。
下面将为您介绍细胞培养孔板的相关知识。
细胞培养孔板的主要特点是其多孔性，每个孔洞都是一个独立的单元，可以分别进行不同的细胞培养实验。
这种设计使得实验过程更加灵活，方便进行各种不同的细胞培养实验，例如药物筛选、细胞毒性测试等。
细胞培养孔板的材质一般选用高品质的塑料或玻璃，具有优良的耐腐蚀性和热稳定性。
其表面经过特殊处理，能够促进细胞的贴附和生长。
此外，孔板的底部通常带有透气性良好的微孔，以保持细胞的氧气供应。
使用细胞培养孔板时，需要先将细胞接种到孔洞中，然后加入适量的培养基和其它必要的试剂。
细胞在适宜的环境下生长，经过一段时间的培养后，可以进行后续的实验操作，例如药物处理、荧光染色等。
细胞培养孔板的应用范围非常广泛，包括生物学、医学、药物研发等多个领域。
例如，在肿瘤学研究中，可以使用细胞培养孔板进行抗癌药物的筛选和测试；在神经学研究中，可以用来模拟神经元的生长和行为。
总之，细胞培养孔板是一种非常有用的实验器具，能够方便地进行各种细胞培养实验，并且具有广泛的应用前景。
随着科技的不断发展，相信未来还会有更多新型的细胞培养孔板问世，为科学研究提供更多的便利和可能性。
细胞培养标准流程
细胞间基本规定每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外(30 min).显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。
超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。
带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾.细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。
基培需写上开启时间。
细胞培养标准流程1、细胞换液、传代(以圆盘培养为例）Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20—30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。
所有物品（包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。
步骤：1。
观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌2.弃旧：细胞生长融合达90％时，吸出培养基3。
漂洗：PBS（2mL）漂洗1—2次4。
消化：加入1ml0.25%胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO2 放置40s-1min,，轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞脱壁。
5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10%FBS的完全培养基终止消化。
6。
吹悬:轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁，呈卵圆形),吹打成单细胞悬液后按1:2 或1:3 比例传代接种于新培养皿。
再加入10ml全培.（大盘10ml全培，小盘6ml全培）（细胞生长快留30％，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA）7.培养:每天或每两天更换一次培养基，直至细胞生长至融合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。
PS:六孔板一般加培养基2300μL/孔。
2、细胞转染TurboFect 转染试剂转染（用于质粒的转染，说明书附后）细胞接板24 h 后转染。
转染时细胞密度需达到70-90％。
以6 孔板为例，转染前细胞先换液,加4ml全培。
取1.5 ml 离心管，加入400 μL 无血清无双抗DMEM 培养液，加入质粒2 μg，混匀后静置5 min，再转染试剂4 μL，混匀(转染试剂是质粒的2倍）,室温静置15－20 min.（转染试剂需加在培养液中部,切忌勿贴壁;静置时间不可超过20 min)无血清无双抗DMEM量＝全培体积的10%。
HighGene plus Transfection reagent 说明书
HighGene plus Transfection reagent说明书货号：RM09014P规格：1mL，10mL◆产品描述HighGene plus Transfection reagent细胞转染试剂是一种新型的混合型高分子聚合物转染试剂。
它可以与核酸（包括质粒、siRNA、寡聚核苷酸）相互作用形成一种复合物将核酸转运到真核细胞内，适用于大部分真核细胞的细胞转染。
◆产品特点1、适用于多种细胞类型和培养板。
2、高转染效率、批次稳定重复性好、操作简单。
3、转染过程不受血清和抗生素的影响。
◆保存条件-20℃保存，24个月有效。
◆操作说明1、贴壁细胞转染（以293T细胞为例）（1）第一天，将293T细胞接种到6孔板中，细胞密度控制在70%-90%为宜；注：根据实验需求，可以选择不同的细胞培养装置，细胞接种数量和所需培养液体积详见附表1（2）第二天，先取4μg质粒加入到200μL无血清DMEM基础培养基离心管中，吹打混合均匀，然后加入8μL HighGene plus转染试剂，吹打混合；注：MEM、1640、F12等基础培养基均可用于HighGene plus转染试剂的溶剂，不同的细胞培养装置所需质粒的量和HighGene plus转染试剂剂量详见附表2（3）将200μL质粒/HighGene plus转染试剂复合物均匀滴加到6孔细胞培养板孔中，轻轻晃动细胞培养板使其均匀分布；注：6孔板中为完全培养基，轻轻晃动细胞培养板即可，切勿剧烈摇动细胞培养板，以免细胞脱落漂浮！（4）细胞转染4-6h后，半量更换新鲜完全培养基；注：半量换液时，吸弃一半原有完全培养基，补加一半新鲜完全培养基（5）细胞转染24-48h后，即可使用适当方式进行检测，如RT-PCR、Western、ELISA、报告基因等，或加入相应筛选药物（G418或Puromycin）可获得稳定细胞株。
2、悬浮细胞转染（以HEK293F细胞为例）（1）第一天，在125mL摇瓶中接种30mL密度为1×106个/mL HEK293F悬浮细胞；（2）第二天，先取30μg质粒加入到3mL无血清DMEM基础培养基离心管中，吹打混合均匀，然后加入60μL HighGene plus转染试剂，吹打混合均匀；（3）将3mL质粒/HighGene plus转染试剂复合物均匀滴加到30mL体积HEK293F悬浮细胞的125mL摇瓶中，轻轻摇动摇瓶使其混合均匀；（4）细胞转染3-5天后，根据蛋白表达的情况（胞内表达或分泌表达），收集细胞或细胞培养上清，进行后续蛋白纯化操作。
各种孔板细胞接种量
各种孔板细胞接种量总结下各种孔板细胞接种量仅供参考^6l: B2 V6 k1 z5 q' i细胞培养瓶（板）接种量生长面积容量细胞数（大约）0 D-U% i( q/ S96孔板4~5×10 435mm培养皿1×10 6'n' C4 v7 z- N' n) w48孔板1.3×10 560mm培养皿2.6×10 624孔板2.5×10 5100mm培养皿7×10 612孔板5×10 5150mm培养皿1.8×10 76孔板1.2×10 6{" s; ?$ q8 l# |1 l细胞瓶面积容量工作体积细胞数目6@3K*u-@( O0 O, n12.5cm225ml2ml5×10 525cm250ml5ml1×10 68 V& E- \!{6 l' F8 }1 r* e35cm275ml10ml2×106,^.J7_1^8 v1 e- k& `6 e0 ]' O8 Y75cm2250ml15ml4×1068o9_8×7 O2 Q% g/ A- r150cm2700ml40ml1.1×107补充：不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在2~3mm范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量（参考下表）。
若加液量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。
具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。
注：各种单层生长的细胞在培养皿中长满的细胞数，主要取决于器皿底表面积和细胞体积的大小。
上表以Hela细胞为例给出的可获细胞量仅作参考。
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各种孔板细胞接种量（总结下各种孔板细胞接种量仅供参考）：
培养板细胞接种量生长面积容量细胞数（大约）
96孔板4~5×10 435mm培养皿1×10 6
48 孔板 1.3×10 5 60mm培养皿 2.6×10 6
24孔板 2.5×10 5100mm培养皿7×10 6
12孔板5× 10 5150mm培养皿 1.8×10 7
6孔板 1.2×10 6
细胞瓶面积容量工作体积细胞数
12.5cm225ml 2ml 5×10 5
25 cm250ml 5ml 1×10 6
35 cm275ml 10ml 2×10 6
75 cm2250ml 15ml 4×10 6
150 cm2700ml 40ml 1.1×107
6孔板底面积9.6cm2，加培养液的量2.5ml；
12孔板底面积4.5cm2，加培养液的量2ml；
24孔板底面积2cm2，加培养液的量1ml；
96孔板底面积0.32cm2，加培养液的量0.1ml。
补充：不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在2~3mm范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量（参考下表）。
若加液量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。
具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。
注：各种单层生长的细胞在培养皿中长满的细胞数，主要取决于器皿底表面积和细胞体积的大小。
上表以Hela细胞为例给出的可获细胞量仅作参考。