脊髓损伤后细胞凋亡基因调控研究进展

Ｄ【ｍ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－７０８３．２０１０．０３．０２０
２０世纪初以来．脊髓损伤的死亡率由５０％逐年下降 至目前的６％。尽管在降低死亡率的同时临床治疗水平 不断提高，但在减轻病人神经损害程度上仍收效甚微【１］。 脊髓损伤以神经损害为主要表现．脊髓神经细胞死亡并 非源于脊髓直接损伤。而是脊髓损伤后细胞凋亡所致【２］。 细胞凋亡是一种基因控制的细胞自杀过程，它通过 清除死亡细胞和代谢产物来维持人体各系统组织的稳 定，而这种清除过程不伴有局部炎症是其最大的特点。 １３ａｒｄｅｅｓｙ等［３一研究证实，脊髓损伤后广泛存在细胞凋亡现 象。多项研究［｝６３证实，不管是人类还是动物。脊髓损伤 后出现的神经元和神经胶质细胞死亡均继发于细胞凋 亡。脊髓损伤后神经细胞发生凋亡的机制十分复杂，各 种刺激信号可通过多种途径诱导凋亡发生，同时涉及多 种病理生理过程，其机制总体上并不完全明了。随着分 子生物学的发展，对基因的深入了解，发现细胞凋亡与基 因调控密切相关。脊髓损伤后细胞凋亡是多基因参与的 调控过程，这些基因包括半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白 酶（ｃａｓｐａｓｅ）基因家族、凋亡相关蛋白Ｆａｓ及其配体ＦａｓＬ 系统、ｐ５３基因、凋亡相关基因Ｂｃｌ－２家族和即刻早基因 （ＩＥＧ）等。
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ｐ６３基因
ｐ５３基因控制细胞周期和ＤＮＡ修复，介导细胞凋 亡，野生型ｐ５３（ｗｔ－ｐ５３）诱导细胞发生凋亡，突变型ｐ５３ （ｍｒ－ｐ５３）抑制凋亡。Ｓａｉｔｏ等瞳１］在大鼠脊髓横断模型中 发现损伤３０ ｍｉｎ后横断脊髓邻近细胞有ｐ５３表达，２ ｄ内 表达ｐ５３的细胞数量先增加后下降，主要表达于细胞核 内，表达的细胞类型有少突胶质细胞、小胶质细胞、星形 胶质细胞，神经元不表达，而ｐ５３表达的细胞经ＴＵＮＥＬ 检测呈阳性反应，可见ｐ５３参与了脊髓损伤后的凋亡调 节。并在其中发挥重要作用。其作用机制可能包括以下 主要环节：①神经细胞ＤＮＡ轻微损伤，诱导ｐ５３于转录 和翻译水平大量表达。②调节相关基因表达，例如使 ＆卜２、胰岛素样生长因子一Ｉ受体（ＩＧＦ－ＩＲ）、癌基因ｃ－ｍｙｃ 等表达减少，而使Ｂａｘ、ｐ２１、Ｆａｓ等表达增加。③与其他 蛋白形成复合物，参与ＤＮＡ合成、复制及修复。总之， ｐ５３可能具有双向调控作用，即先参与损伤ＤＮＡ修复，
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依赖途径，其过程是凋亡因子促使线粒体释放细胞色素 Ｃ，细胞色素Ｃ经由三磷酸腺苷（ＡＴＰ）使凋亡蛋白酶活化 因子一ｌ（Ａｐａｆ－１）发生构象改变而活化，从而促使ｃａｓｐａｓｅ－９ 前体活化，活化的ｃａｓｐａｓｅ－９激活下游效应酶ｃａｓｐａｓｅ－３，切 割特定的凋亡底物。二为凋亡死亡受体途径，其过程由 死亡受体ＣＤ９５、肿瘤坏死因子受体（ＴＮＦＲ）一１、ＤｔＬ３、ＤＲ４ 或ＤＲ５等接头蛋白（有死亡效应结构区）介导，活化起始 酶ｃａｓｐａｓｅ－１等，进而活化ｃａｓｐａｓｅ－３等。诱发凋亡反应。 Ｌｉｕ等¨ｏ研究表明，与正常大鼠和假手术大鼠相比，脊髓 牵拉伤大鼠ｃａｓｐａｓｅ－３被激活，原位末端标记法（Ｈ ｎ姬Ｉ。） 阳性反应在伤后３ ｄ达高峰，ｃａｓｐａｓｅ－３免疫阳性反应在伤
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的半胱氨酸蛋白酶（ＣＰＰ－３２）或ａｐｏｐａｉｎ蛋白，在介导细胞 凋亡过程起重要作用。ｃａｓｐａｓｅ－３既参与凋亡启动，又参 与凋亡程序执行。尤其在凋亡执行阶段，负责对全部或部 分关键蛋白进行酶切（激活或灭活）。通过对蛋白激酶、 核酸酶及细胞骨架的裂解，ｃａｓｐａｓｅ－３可激活特定信号系 统，产生核皱缩、ＤＮＡ片段形成等凋亡现象，最终控制凋 亡的发生和发展。主要经由两种途径，一为凋亡线粒体
后７ ｄ达峰ｅ－３表达较弱，牵张性脊髓损伤后神经元ｃａｓｐａｓｅ－３ 表达明显升高，７ ｄ时达最高值，随后下降；凋亡细胞检测 显示凋亡细胞数量变化与ｃａｓｐａｓｅ－３蛋白表达趋势大致相 同。在经典的重物下落致大鼠和小鼠脊髓损伤模型研究 中，ｃａｓｐａｓｅ－３、ｃａｓｐａｓｅ－３ ｍＲＮＡ表达明显增加，且ｃａｓｐａｓｅ－３ 免疫阳性产物在神经元和神经胶质细胞中均有分布［１引。 脊髓损伤不仅影响脊髓本身。也许经轴浆输送或远离受 损脊髓区之上级中枢退行性变的大脑皮质、脑干内 ｃａｓｐａｓｅ－３表达也增加，ｃａｓｐａｓｅ－３介导的神经元和神经胶 质细胞凋亡可解释脊髓损伤区继续扩大和远离脊髓损伤 区幸存轴突长期延迟性脱髓鞘变化，表明凋亡在脊髓损 伤，尤其是继发性损伤中发挥着鼋要作用［１“。脊髓损伤 后凋亡不仅见于大鼠、兔和猴等哺乳动物，而且见于人 类。Ｅｍｅｒｙ等Ｌ１２３在对脊髓损伤后死亡病人尸检中发现有 细胞凋亡及ｃａｓｐａｓｅ－３激活。有实验研究［１ ３］证明，脊髓损 伤后ｃａｓｐａｓｅ－３活性升高时间早于凋亡，ｃａｓｐａｓｅ－３活化是 细胞凋亡早期生化指标。有研究【１４０报道，分别在损伤前 和损伤后给予脊髓损伤动物模型ｃａｓｐａｓｅ－３抑制剂，可显 著减少脊髓损伤后细胞凋亡，并能改善神经功能。因此， 深入研究ｃａｓｐａｓｅ－３抑制剂如何降低脊髓损伤后细胞凋 亡，寻找高选择性ｃａｓｐａｓｅ－３阻滞剂，可能是进一步推动的 研究重点。 ２ Ｆａｓ和ＦａｓＬ系统 Ｆａｓ（ＣＤ９５、Ａｐｏ－１）属于ＴＮＦＲ家族成员，为Ｉ型跨膜
万方数据
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Ｂｅｌ－２基因家族
Ｂｃｌ－２基因家族包括凋亡抑制基因Ｂｄ一２、＆卜ＸＬ、 Ｍｃｌ－１等，凋亡促进基因Ｂａｘ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｂｃ卜ＸＳ等。Ｂｃｌ一２ 和Ｂａｘ基因相互拮抗，在细胞凋亡调控中起着重要作用。 Ｂｃｌ一２可抑制多种途径的凋亡，Ｂａｘ通过编码相应功能蛋 白促进细胞凋亡Ｌ２３］。Ｂｃｌ－２是一种分子量为２６ ０００的蛋 白分子，羧基端是由１９个氨基酸组成的疏水段，与此相 接的是２个带电荷的氨基酸残基，疏水结构使蛋白可能 锚定在膜上，这是其阻断细胞凋亡的结构基础。Ｂｃｌ－２家 族成员均有Ｂｃｌ－２同源体（ＢＨ）结构，包括ＢＨｌ、ＢＨ２、ＢＨ３ 和ＢＨ４等４个区域。Ｂｃｌ－２基因均包含这４个区域，其中 ＢＨｌ、ＢＩ－ｔ２和ＢＨ４是抗凋亡所必须的。ＢＨＩ、ＢＨ２和 ＢＨ４可构成一疏水结构，可与促凋亡蛋白ＢＨ３相结合形 成复合体，从而抑制Ｂａｘ活性。同时Ｂｃｌ－２蛋白主要分布 于线粒体膜内外侧，核膜、内质网膜也有分布，它对维持 这些细胞器稳定起着重要作用［２４］。Ｂａｘ蛋白也有ＢＨｌ、 ＢＨ２和ＢＨ３，ＢＨ３是其发挥促凋亡作用所必须的。Ｂａｘ 存在于胞浆，当接受凋亡信息后被激活，并可经末端疏水 结构域锚固在线粒体膜上，使线粒体通透性发生改变，细 胞色素Ｃ、凋亡诱导因子（ＡＩＦ）和Ａｐａｆ－１释放，激活 ｃａｓｐａｓｅ系统，进而促使细胞发生凋亡；当Ｂａｘ经ＢＨ３与 Ｂｃｌ－２形成复合体后，则失去改变线粒体膜通透性的作用 而不能诱发细胞凋亡喳盔］。因此，Ｂａ】【与Ｂｃ卜２在组织内所 占比例直接影响细胞凋亡的发展。Ｚａｉｄｉ等‘冽研究发现， Ｂａｘ与Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘｌ蛋白构成比对细胞生存起决定作用， Ｂａｘ比例大时细胞对凋亡的敏感性增加，Ｂｃ卜２与１３ｃｌ－ｘｌ占 主导地位时细胞对凋亡因素耐受，不易死亡。马利杰 等【２乩研究发现。大鼠急性脊髓损伤后Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ均经历一 先增高后下降过程，损伤后４ ｈ即有表达，１ ｄ时达到高 峰，随后逐渐下降，１４ ｄ时Ｂｃｌ－２仍有表达，而Ｂａｘ则偶见 表达；Ｂｃｌ－２与Ｂａｘ比值在损伤后８ ｈ时最小，８ ｈ后逐渐 增大，１４ ｄ时最大；Ｂｃｌ－２与Ｂａｘ比值越小，细胞凋亡越多。 Ｒｅｅｄ【驯研究证实，Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ基因启动后表现何种作用， 主要取决于Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ相对表达量。综上所述，如何抑制 Ｂａｘ在脊髓损伤中的过表达，从而抑制凋亡，保护脊髓组 织，已成为需要进一步研究的课题。
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与诱导细胞凋亡功能密切相关的结构域，即死亡信号激 活域（ＥｘＥ）、死亡结构域（ＤＤ）和调控域（ＲＲ）。ＤＤ是Ｆａｓ 胞浆区一段含８０个氨基酸的序列，与细胞凋亡信号传递 密切相关。ＦａｓＬ是Ｆａｓ抗原的天然配体，可与Ｆａｓ形成 同源三聚体，具有诱导凋亡的能力，因此又称作死亡分 子。Ｆａｓ加ＦａｓＬ形成的同源三聚体，导致Ｆａｓ多聚化或 构型改变。多聚化Ｆａｓ上的ＤＤ经自身结构域间的相互 作用，招募Ｃ端也含ＤＤ的接头蛋白Ｆａｓ分子相关死亡 结构域（ＦＡＤＤ）。ＦＡＤＤ的Ｎ端含死亡效应结构域 （ⅨＤ），可经自身结构域间的相互作用，与ｃａｓｐａｓｅ－８酶原 结合，从而形成Ｆａｓ－ＦａｓＬ－ＦＡＤＤ－ｃａｓｐａｓｅ－８死亡诱导信号 复合体（ＤＩＳＣ）［１ ５‘。ＤＩＳＣ形成后，ｃａｓｐａｓｅ－８前体分子中２ 个线性亚单位相互靠近，并进行自身水解而形成具有水 解活性的蛋白酶ｃａｓｐａｓｅ－８，然后依次水解其下游的同源 酶如ｃａｓｐａｓｅ－３前体、ｃａｓｐａｓ｝６前体、ｃａｓｐａｓｅ－７前体等，而 ｃａｓｐａｓｅ－３是ｃａｓｐａｓｅ级联反应中最关键的效应酶，可激活 ＤＮＡ降解酶，将ＤＮＡ降解为特异性片段，导致细胞凋亡 的发生¨６３；同时一些ｃａｓｐａｓｅ酶原也能聚集和自我活化， 这种ｃａｓｐａｓｅ活化其他ｃａｓｐａｓｅ的级联反应放大了凋亡信 号，进而导致细胞快速凋亡［１ ７｜。Ｆａｓ和ＦａｓＬ系统在脊髓 损伤中的促细胞凋亡作用主要表现在空间和时间分布 上。“等［１胡在大鼠脊髓压迫模型实验中发现，除了在正 常皮质脊髓外，Ｆａｓ和ＦａｓＬ在白质轴索和髓鞘低表达，在 其他部位不表达；中重度脊髓压迫损伤后在损伤部位表 达下降或完全消失，在邻近部位表达则上升，推测Ｆａｓ和 ＦａｓＬ与继发性脊髓损伤少突胶质细胞凋亡有关。Ｙｕ 等［１９］研究认为，死亡受体Ｆａｓ和ｐ７５可介导少突胶质细 胞凋亡，从而导致轴突变性，两者表达一致。杨晓华等［２０１ 研究认为。损伤越严重，Ｆａｓ和ＦａｓＬ表达高峰时间的出现 就越早或持续越久，Ｆａｓ和ＦａｓＬ表达增加也许在病理生 理学上意味着脊髓损伤后继发性损伤的发展状况。
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脊髓损伤后细胞凋亡基因调控研究进展
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摘要脊髓损伤后神经细胞发生凋亡与基因调控密切相关，调控过程有多基因参与，包括半胱氨酸 天冬氨酸特异性蛋白酶（ｃａｓｐａｓｅ）家族、血清凋亡相关蛋白Ｆａｓ及其配体ＦａｓＬ系统、ｐ５３基因、细胞凋亡相 关基因Ｂｃｌ－２家族和即刻早基因等，其中ｃａｓｐａｓｅ家族参与凋亡各个时期，是细胞凋亡途径的核心成分。 该文就这些基因在脊髓损伤后神经细胞凋亡调控机制中的作用近期研究进展作一综述。 关键词脊髓损伤；细胞凋亡；基因调控