成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养
原代小鼠心肌成纤维细胞提取
原代小鼠心肌成纤维细胞提取方法1.提前配置0.8%胰酶 3mL、0.1%胶原酶II 10mL（均用DMEM配置），放入37℃水浴锅中预热15min；准备1个50mL的离心管，提前加入10mL含10%FBS的完全培养基，冰浴备用；2.取5-10只7天出生内的C57乳鼠，用灭菌或消毒的组织剪剪开胸腔，迅速取出心脏，置于含2%双抗的预冷的DMEM培养基中；3.将心脏组织转移至超净台，用DMEM反复清洗，取出血液、大血管组织，将组织放入1个1.5mL的EP管中，充分剪碎（小于1mm3）;4.用巴氏管向组织块中加入1mL预热的胰酶，反复吹打、吸入至含胰酶的离心管中，37℃水浴加热3min，适当振荡；[循环1]5.吸取上清液丢弃，余下的组织块中加入2mL胶原酶，37℃水浴加热5min，期间每分钟振荡1次，吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环2]6.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次）后水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环3]7.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀2min后（约30次），此时肉眼可见组织块逐渐变小，呈透明粘液状，随后再次水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环4、5]8.向组织块中再次加入1mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次），此时肉眼可见组织块逐渐消失，消化液变得浑浊，再次水浴消化3min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环6、7]；9.将50mL离心管中的液体分装入2个15mL离心管中，1000rpm离心6min，小心吸去上清液，组织/细胞沉淀加入1mL完全培养基吹打混匀后转移至50mL的培养瓶中，加3mL完全培养基（含4%双抗），2h后可见细胞贴壁，12h内换液；2-3d后常规传代（1:2），P1-2用于实验。
一种小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法
一种小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法真皮成纤维细胞是一种重要的细胞类型，其在生物医学研究、组织工程和再生医学等领域具有广泛的应用前景。
以下是一种常用的小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法：1. 实验前准备：- 小鼠或大鼠- 麻醉剂，如异氟醚等- 消毒剂- 必需的培养基和培养液2. 小鼠/大鼠的取材：- 麻醉小鼠或大鼠，确保其在实验过程中不会感到疼痛或不适。
- 消毒动物的表面，以减少细菌或其他微生物的污染。
- 取下小鼠/大鼠的皮肤。
使用消毒剪刀和镊子将皮肤切割成小块，以便后续的分离过程。
3. 细胞的分离和培养：- 将皮肤块转移到含有酶解消化液（如胰蛋白酶）的培养皿中，并在37°C的恒温搅拌器上进行酶解（通常为1-2小时）。
- 将酶解后的皮肤块过滤，移至新的培养皿中，加入培养基和培养液，如DMEM/F12或RPMI-1640，并添加10%胎牛血清。
- 将培养皿放在37°C的细胞培养箱中，保持适当的温度、湿度和CO2浓度。
- 培养皿中的细胞会开始生长和扩增。
定期更换培养基，并进行细胞的孵育以保持其正常生长。
4. 细胞的传代：- 当细胞密度达到80-90%时，使用胰蛋白酶或胰蛋白酶-EDTA溶液将培养皿中的细胞与培养皿底部松散的连接断开。
- 将细胞计数，并根据需要的细胞数量进行传代。
一般情况下，将细胞按照1:3或1:4的比例重新分装到新的培养皿中。
- 重复上述步骤，直到获得足够数量且健康的细胞。
这种方法能够有效地分离和培养小鼠或大鼠真皮成纤维细胞，为相关研究提供了重要的细胞资源。
通过优化培养条件和细胞的传代方法，可以获得高质量和稳定的细胞群体，以支持各种实验或应用的需要。
小鼠心脏成纤维细胞说明书
小鼠心脏成纤维细胞说明书
1、组织来源：小鼠乳鼠
2、产品规格：25cm2培养瓶
3、细胞简介：
小鼠心脏成纤维细胞分离自正常大鼠心脏组织，细胞呈梭型、多边形等不规则形状。
体外培养的小鼠心脏成纤维细胞对于研究其生理功能、药物作用以及各种致病因素作用下的病理生理改变具重要意义。
本公司生产的小鼠心脏成纤维细胞采用酶解法制备而来，细胞总量约为1×106个/瓶，细胞纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
二、使用方法
客户收到细胞后，请按照以下方法进行操作。
1、取出25cm2培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态；
2、待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养；
3、细胞传代
（1）吸出25cm2培养瓶中的培养基,用PBS清洗细胞一次；
（2）添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，37℃温浴1-2min左右；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，再加入完全培养液终止消化；
（3）用吸管轻轻吹打混匀，按1:2或1:3等适当的比例进行接种传代，然后补充新鲜的完全培养基至5ml，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；
（4）待细胞完全贴壁后，培养观察。
之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。
（备注：由于实验所用试剂与操作环境的不同，以上方法供各实验室参考。
）
三、注意事项
1、培养基于4℃条件下可保存3-6个月；
2、在细胞培养过程中，请注意保持无菌操作；
3、传代培养过程中，胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞贴壁及其生长状态；
4、该细胞只可用于科研。
成年小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定
成年小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定王丽娟;贾大林;齐国先【期刊名称】《中国实验动物学报》【年(卷),期】2007(015)003【摘要】目的探讨成年小鼠心肌细胞分离培养的方法,评价心肌细胞的存活状况.方法应用改良Langendorff方法进行成年小鼠心脏灌流,分离并培养心肌细胞, 评价杆状心肌细胞的比例变化.台盼蓝染色判定心肌细胞活力,应用毒胡萝卜素(thapsigargin) 治疗心肌细胞24 h后,WST方法测定细胞生存率.结果在每个成年小鼠心脏分离了40～60万的心肌细胞,台盼蓝染色结果68%为存活心肌细胞.心肌细胞培养1 h、24 h及48 h后,杆状心肌细胞的比例分别为70%、50%及30%.心肌细胞生存率随着毒胡萝卜素浓度的增加逐渐减低,其中1、5及10 μmol/L毒胡萝卜素的生存率明显低于对照组 (P＜0.05,P＜0.01).结论应用改良Langendorff 方法及严格控制心脏灌流培养的条件,可以成功地分离培养成年小鼠心肌细胞,有助于进行细胞分子水平的研究.【总页数】4页(P175-178)【作者】王丽娟;贾大林;齐国先【作者单位】中国医科大学第一临床学院循环内科,辽宁,沈阳,110001;中国医科大学第一临床学院循环内科,辽宁,沈阳,110001;中国医科大学第一临床学院循环内科,辽宁,沈阳,110001【正文语种】中文【中图分类】R332【相关文献】1.原代乳小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定 [J], 程阔菊;黄河;杜智勇;李洪;杨天德2.乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定 [J], 辛毅;许秀芳;黄益民;张颖;李温斌3.成年C57BL/6小鼠空肠Cajal间质细胞的分离、培养及鉴定 [J], 刘登群;龙爽;王军平;史春梦;冉新泽;粟永萍4.C57胎鼠、乳鼠及成年小鼠心室肌细胞分离、培养及鉴定 [J], 张玲;段明军;魏琴;陈华;时利;侯月梅5.新生小鼠心肌细胞分离培养的改良及其鉴定 [J], 夏机良;朱泽安;张湘涛;王跃群;吴秀山因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
细胞生物学：小鼠心肌细胞原代培养
㈠、概述 整体动物⼼肌细胞的增殖能⼒在出⽣后仅能维持⼀个短时期，⼩⿏在出⽣3周后DNA合成所需的酶的活性及⼼肌细胞的增殖能⼒就明显降低⾄成年⿏⽔平。
⼩⿏⼼肌细胞的原代培养，⼀般选⽤⽣后1-10d的乳⿏⼼脏，尤以出⽣1-4d的较好，此时⼼肌细胞已分化充分，适于作各种研究，⽽出⽣4d以后的乳⿏⼼脏中分离出来的⼼肌细胞较慢发育成为有⾃律性搏动的⼼肌细胞。
㈡、[试剂] 1、培养液：1：1 混合的DMEM / F12 培养液，添加终浓度为10%⼩⽜⾎清（FCS）、100IU/ml 青霉素、100µg/ml 链霉素。
2、消化液：胰酶（效价为1：250） 0.08%、胶原酶II（活⼒为150U/mg） 0.05% ，⽤pH 7.2-7.8 的D-Hanks溶液配制，-20 ℃保存。
3、 D-Hanks溶液（pH 7.2-7.8）：KCl 0.4 g ， KH2PO4 0.06 g ， NaCl 8.00g ， NaHCO3 0.35 g ， Na 2HPO4？7H2O 0.09 g ，酚红 0.01 g 1L ㈢、[实验步骤] 1、取⽣后1-4d的乳⿏，⽤75%⼄醇消毒⽪肤，再⽤⼤头针固定乳⿏的头及四肢，剪开胸部⽪肤，⽤75%⼄醇消毒⽪下组织，更换镊⼦及剪⼑，开胸取出⼼脏，将⼼脏放⼊盛有D-Hanks溶液的平⽫（或青霉素瓶）中，剪去⼼房，剪开⼼室，⽤D-Hanks溶液冲洗三次，去除残留积⾎后，将⼼脏剪成1mm3 ⼤⼩的碎⽚，再将⼼脏碎⽚转移⾄离⼼管中，加5ml左右消化液，37℃消化5 min，⾃然沉淀，弃上清，再加5ml左右消化液，37℃消化20min（每隔2min振摇⼏下），⽤吸管吹打1min 后，将未消化完全的⼼脏碎⽚吸出⾄另⼀离⼼管中，加⼊2ml冷的培养液终⽌消化，1000 rpm 5min ，弃上清，沉淀中加⼊D-Hanks溶液2ml， 1500 rpm 10min ，弃上清，沉淀中加⼊培养液2ml，⽤吸管吹打制成细胞悬液。
细胞工程实验三：乳鼠心肌细胞的原代培养-治
将细胞混悬液1 000 r/min离心10 min
去上层，收获细胞
实战程序 第四大步骤：清洗细胞，培养细胞
细胞沉淀用PBS溶液和DMEM清洗3次 弃上清液 加4ml含20%小牛血清的DMEM培养液制 成细胞悬液，置于培养瓶中 培养24 h后即可见细胞贴壁和细胞收缩
【注意事项】
组织块必须漂洗 2~3 次以除去组织的钙离 子、镁离子和血清对胰蛋白酶和 EDTA的抑 制作用。 胰蛋白酶浓度不宜过高，作用时间不能太长， 以避免毒性作用。 消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免 毒性产生，而且动作要轻，以避免蓬松的细 胞随漂洗而失去。
【实验结果与分析】
记录心肌细胞的培养及动态观察。
实验三 动物细胞的原代培养
【实验目的】
掌握实体组织材料的原代细胞培养的 基本思路。 掌握动物组织中细胞的分离和原代培 养的方法。
【实验原理】（参考教材P128）
原代细胞培养是从供体取得组织细胞在体外
进行的首次培养
是一项基本技术
是建立细胞系的第一步
【实验原理】
原代细胞的分离和制作常采用的方法
用镊子小心剥离心包膜
剪去心房（心脏上半部分）及主动脉
PBS溶液清洗心室组织3次（至没有血时）
将心室组织剪成1~3 mm3碎块后，转移至
离心管
用PBS清洗3遍
实战程序 第三大步骤：消化组织，获得细胞
加0.125%胰蛋白酶（2ml）
37℃水浴中旋摇消化10 min 吸上层（细胞在悬液中，未消化好的组织块在底层） 细胞悬液转至小烧杯 加等体积无血清培养基终止反应，反复3-5次
【实验材料与器材】
本实验用品
每组1个：乳鼠、解剖器械、小烧杯、细胞 培养瓶、移液枪（1ml）及枪头 每组2个：离心管、培养皿
心脏成纤维细胞原代细胞培养
乳鼠心肌成纤维细胞分离与培养一、实验动物1~3日龄C57小鼠乳鼠10只。
二、试剂及配制高糖DMEM( gibco)、Ⅰ型胶原酶（MP）、0.25%胰蛋白酶(solarbo公司), 胎牛血清（gibco 160000-044）、青霉素-链霉素混合液（solarbo）。
培养液: DMEM培养基：FBS：双抗 100：10：1（45ml：5ml：0.5ml）酶消化液:将胰蛋白酶用PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)稀释, 配成0.1%胰蛋白酶消化液;将Ⅰ型胶原酶溶于PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)中, 配成0.1%的胶原酶消化液。
0.1%胰蛋白酶及01% Ⅰ型胶原酶以2∶1混合, 现配现用。
三、实验仪器超净工作台、CO2培养箱、光学倒置显微镜、离心机……四、组织消化和分离细胞1、将乳鼠于75%乙醇缸中浸泡5ｓ, 转移至超净台。
用大头针将其固定在无菌的泡沫板上, 用聚维酮碘消毒胸、腹部皮肤。
2、取2把弯镊子撕开皮肤, 充分撕拉开, 再用乙醇棉签消毒。
用眼科虹膜剪在剑突处正中线稍偏左向上开胸后用剪子压住胸骨右缘, 使心脏自然跳出, 用弯镊子勾住心脏根部, 取出心脏, 置于盛预冷PBS液的培养皿中。
3、将鼠心脏全部取出后, 剪去心房、剔除心脏上结缔组织、脂肪及血管, 预冷ＰＢＳ液清洗3次, 去除血污。
4、将心脏剪成约1mm ×1mm×1mm的组织块, 刮入加有搅拌子的锥形瓶中, 酶消化液冲洗剪刀及培养皿, 转移至锥形瓶中。
5、加入孵育过的酶消化液为心肌组织的5倍, 37 ℃水浴, 打开磁力搅拌器, 60r/min搅拌10min, 吸管轻轻吹打组织块1min分散细胞, 自然沉降2min后遗弃上清液。
6、再次加入消化酶液8～15ml消化8min。
五、培养细胞1、吸取上清液入离心管, 加入预冷培养液2ml, 吹打均匀后, 1 200r/min离心4min, 弃上清, 细胞沉淀加预冷的培养液吹打后成细胞悬液用封口膜封口放于冰中备用。
小鼠原代成肌细胞分离、纯化及培养
小鼠原代成肌细胞分离、纯化及培养熊雷;何衍佶;戴威;赵圆;高彦飞;邓忠良;聂茂【期刊名称】《现代医药卫生》【年(卷),期】2017(33)3【摘要】Objective To establish the methods of isolation,purification and culture of primary mouse myoblast,then to induce its myogenic differentiation and to detect the expression of microRNA-1(miRNA-1) and miRNA-155 during this process. Methods The primary mouse myoblast was isolated and purified from the hind leg of neonatal mouse with collagenase digestion , and difference of cell adherence. Its myogenic differentiation was induced by the differentiation culture medium containing horse serum. The myogenic ability of primary myoblast was identified by myosin heavy chain antibody (MF20) immunofluorescence staining. The expression of miRNA-1 and miRNA-155 during the myogenic differentiation was detected by Taqman real time PCR. Result The primary mouse myoblast was successfully isolated and purified;the myogenic differentiation of primary myoblast was successfully induced and MF20 immunofluorescence staining was positive. The miRNA-1 expression was dramatically up-regulated, while the miRNA-155 expression was down-regulated during the myogenic differentiation of primary mouse myoblast ,the difference was statistically significant(P<0.05). Conculsion The isolation and purification method of primary mouse myoblast issuccessfully constructed by this study ,which provides a model in vitro for investigating the miRNA gene regulation during myo-genic differentiation process.%目的建立小鼠原代成肌细胞分离、纯化及培养方法，并诱导其成肌分化，检测成肌分化过程中微小RNA-1（miRNA-1）和miRNA-155表达情况。
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成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养
物品准备：
6-8周成年小鼠、眼科剪、眼科镊、75%酒精、PBS缓冲液、细胞培养皿、细胞培养瓶、15ml细胞离心管、恒温水平摇床、低速水平离心机、倒置显微镜、DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胶原酶II、胰蛋白酶等。
操作步骤：
（1）取出2只成年小鼠心脏，并将它们置于含有冰冷的PBS的培养皿中。
（2）将心脏置于无菌细胞培养皿中，并在无菌条件下进行操作。
使用剪刀将心脏切成10块，使用解剖刀将它们缩小至1mm的尺寸。
（3）将组织小块移到盛有PBS的无菌细胞培养皿中，清洗后弃去PBS。
（4）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织5分钟。
注意：摇床速度应调整至80r，以使所有组织片流动并且不会坐在底部，但不应太强以至不能破坏细胞。
消化酶（胶原酶II: 1mg/ml，胰酶: 0.75mg/ml）
（5）将混合物放置1分钟，使组织沉淀并丢弃含有碎片和血细胞的上清液。
（6）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织30分钟。
（7）将混合物放置１分钟使组织沉淀到底部，并用移液管收集上清液。
不要收集倾向于漂浮的组织碎片。
（8）将上清放入含有2ml成纤维细胞培养基的15ml细胞离心管中。
（9）800r，离心5min。
（10）将细胞重悬于3-4ml培养基中。
（11）重复步骤6-10，直到所有组织溶解（通常7-10次）。
（12）将细胞悬液平铺到细胞培养皿瓶中，并在37℃下在具有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养２小时。
（13）２ｈ后显微镜下观察细胞汇合。
此时成纤维细胞类似于小圆点。
（14）收集并丢弃上清液。
用2.5ml温热的PBS洗涤３次，并用10ml 新鲜的成纤维细胞培养基补充。
在37℃和5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。