茚三酮显色原理
氨基酸含量测定和标准曲线制作(茚三酮法)
茚三酮比色法测定游离氨基酸含量原理：茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡磷酸缓冲液（pH.8.04）：称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。
称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。
取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。
储成于棕色瓶中，避光保存。
0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。
茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。
亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。
茚三酮标准曲线制作溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml亮氨酸超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸 终浓度μg/ml 405060708090100110120130140150使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示3004005006007008000.00.10.20.30.40.50.60.7吸光度波长（nm ）403 nm565 nm选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值 茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 500.62155 0.692 60 0.754 65 0.834 700.968使用origin 8.5 绘制散点图并进行线性拟合，结果如下图所示0.00.20.40.60.81.0O D 565氨基酸浓度（μg/mL ）注意事项：1. 茚三酮比色受测定环境中的pH 影响很大，故每次测定前需要将样品溶液的pH 值调整到中性（pH7左右），2. 茚三酮不光可以与氨基酸反应，与蛋白质同样可以反应，因此需要在测定前去除溶液中的蛋白质，因此正确做法是：向样品溶液中加入等体积等0.6 mol/L 三氯乙酸，斡旋震荡，静置10 min 后，3000 rpm 离心10 min，取上清调整pH 值至中性pH7左右，再进行测定，3. 稀释倍数的确定：因为标准曲线的测定范围为20-70 μg/mL，即20-70 mg/L，所以在不清楚你所要检测样品中氨基酸的浓度时，最好取部分样品稀释10倍和100倍，分别检测原液、十倍稀释液和100倍稀释液的OD565，发现哪个水平下OD565落在标准曲线的范围内，从而判断需要对样品稀释多少倍4. 标准曲线测定时最好选择密封性较好的试管（螺旋盖硅胶内垫），同时需要检查气密性，防止水浴蒸发导致计量误差或者使用10 mL 具塞比色管，以方便在水浴之后可以准确补水。
氨基酸含量测定和标准曲线制作(茚三酮法)
茚三酮比色法测定游离氨基酸含量原理：茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡磷酸缓冲液（pH.8.04）：称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。
称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。
取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。
储成于棕色瓶中，避光保存。
0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。
茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。
亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。
茚三酮标准曲线制作溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml亮氨酸超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸 终浓度μg/ml 405060708090100110120130140150使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示3004005006007008000.00.10.20.30.40.50.60.7吸光度波长（nm ）403 nm565 nm选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值 茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 500.62155 0.692 60 0.754 65 0.834 700.968使用origin 8.5 绘制散点图并进行线性拟合，结果如下图所示0.00.20.40.60.81.0O D 565氨基酸浓度（μg/mL ）注意事项：1. 茚三酮比色受测定环境中的pH 影响很大，故每次测定前需要将样品溶液的pH 值调整到中性（pH7左右），2. 茚三酮不光可以与氨基酸反应，与蛋白质同样可以反应，因此需要在测定前去除溶液中的蛋白质，因此正确做法是：向样品溶液中加入等体积等0.6 mol/L 三氯乙酸，斡旋震荡，静置10 min 后，3000 rpm 离心10 min，取上清调整pH 值至中性pH7左右，再进行测定，3. 稀释倍数的确定：因为标准曲线的测定范围为20-70 μg/mL，即20-70 mg/L，所以在不清楚你所要检测样品中氨基酸的浓度时，最好取部分样品稀释10倍和100倍，分别检测原液、十倍稀释液和100倍稀释液的OD565，发现哪个水平下OD565落在标准曲线的范围内，从而判断需要对样品稀释多少倍4. 标准曲线测定时最好选择密封性较好的试管（螺旋盖硅胶内垫），同时需要检查气密性，防止水浴蒸发导致计量误差或者使用10 mL 具塞比色管，以方便在水浴之后可以准确补水。
茚三酮法测氨基酸
茚三酮法测氨基酸 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT茚三酮显色法测定氨基酸的含量一．原理：凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。
第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。
二．仪器：721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥容量瓶移液枪烧杯试管架试管水浴锅。
三．药品：（1）标准氨基酸溶液：配制成L 溶液（2），2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L 乙酸混合而成。
用pH 检查校正。
（3）茚三酮显色液：称取170mg 茚三酮和30mg 还原茚三酮，用20mL 乙二醇甲醚溶解（4）60％乙醇。
（5）样品液：每毫升含～50μg 氨基酸。
茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入活性炭，轻轻搅拌。
加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。
次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。
还原型茚三酮按下法制备：称取茚三酮，用沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。
将维生素C 用25mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。
滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。
乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。
四、操作步骤1．标准曲线的制作分别取L 的标准氨基酸溶液0，，，，，于试管中，用水补足至1mL。
茚三酮显色
氨基酸的氨基被一个甲基，甲基化后茚三酮还能否显色？有没有更适合这种情况的显色剂！
• 【讨论】到现在还没有着落或没签约的来这里报个到吧,统计一下
zpl7
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03
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2007-04-27 15:09
茚三酮为一种选择性氧化剂，可引起α-氨基酸氧化脱羧，生成CO2、NH3、和一分
子比原来的氨基酸少一个碳原子的醛。
还原的茚三酮与释放的氨反应生成罗曼紫，后者是一种最大吸光波长为570nm 的复合物。
仲胺、脯氨酸和4-羟脯氨酸，因其α-氨基被取代，经另一种不同的反应途径，生成
最大吸光波长为440nm 的一种特殊的黄色衍生物。
• 同济博士复试分数线，比较可靠的小道消息。
haie
r008
2007-04-28 08:58
应该就不显色了。
我做过这样的。
用稀碘化铋钾：三氯化铁的乙醇溶液（1%）=10：1 我做的时候，是个黄色的斑点/
• 【病例讨论】麻醉后持续低血压临床死亡病例原因分析
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mjvi
p
天道
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2007-04-28 09:40
显色，颜色不是很一致。
多肽合成茚三酮显色反应原理
多肽合成茚三酮显色反应原理1.引言1.1 概述多肽是由多个氨基酸残基通过肽键连接而成的生物大分子。
多肽合成是一种重要的实验室技术，通过人为合成特定的氨基酸序列，可以获得具有特定功能和生物活性的多肽分子。
茚三酮显色反应是一种常用的多肽组装方法，通过茚三酮与氨基酸中的氨基反应，可以使合成的多肽产生可观察的色素变化。
茚三酮显色反应原理是基于茚三酮与氨基酸中的氨基之间的亲核加成反应。
茚三酮分子中的碳原子带有局部部分正电荷，而氨基酸中的氨基带有局部部分负电荷。
当茚三酮与氨基接近时，氨基的性质使其能够攻击茚三酮分子的部分正电荷，形成一个中间的的化合物。
在这个过程中，氨基酸的氨基与茚三酮发生反应，并且形成一个新的酮基。
这个酮基的存在使得茚三酮变成了有色化合物，从而使合成的多肽分子产生明显的颜色变化。
茚三酮显色反应原理的发现为多肽合成提供了一种简单、高效和直观的组装策略。
通过对茚三酮显色反应原理的深入理解，研究人员可以更好地控制反应条件，调节反应速率和产物结构，从而实现对多肽合成的精密控制和合成效果的优化。
本文的目的是系统地介绍多肽合成茚三酮显色反应原理的基本原理和机制。
通过了解茚三酮显色反应的发展历程、原理和应用，读者可以深入了解多肽合成领域中的重要技术和方法。
本文的结构如下：首先，我们将在引言部分对多肽合成和茚三酮显色反应进行简要介绍；接着，在正文部分，我们将详细介绍多肽合成和茚三酮显色反应的原理和机制，并介绍相关的实验方法和条件；最后，在结论部分，我们将对本文所述内容进行总结，并展望多肽合成茚三酮显色反应在未来的研究方向和应用前景。
通过阅读本文，读者将对多肽合成茚三酮显色反应原理有一个全面的认识，为进一步研究和应用提供指导和参考。
1.2文章结构文章结构的设计对于一篇长文的逻辑性和条理性非常重要。
在本文中，文章结构被分为引言、正文和结论三个部分。
在引言部分，我们已经包括了概述、文章结构和目的。
在本篇长文中，正文部分被细分为多肽合成和茚三酮显色反应原理两个小节。
（精选）茚三酮显色剂
茚三酮中文名称：苯并戊三酮，茚三酮英文名称：Ninhydrin分子量：160.13CAS RN：485-47-2熔点：251℃密度: 0.86性状：本试剂近似为白色结晶,或浅黄色结晶粉末,微溶于乙醚及三氯甲烷,100℃以上变为红色。
特性反应：跟酶类或者多肽在加热状况下发生显紫色反应。
作用茚三酮是一个有机化合物，被广泛用于检测氨、一级和二级胺，尤其是氨基酸。
氨基酸与茚三酮水合物在弱酸条件下共加热时，氨基酸被氧化脱氨、脱羧，而茚三酮水合物被还原，其还原物可与氨基酸加热分解产生的氨结合，再与另一分子茚三酮缩合成为蓝紫色化合物，称为罗曼紫（Ruhemann's purple）。
此化合物最大吸收峰在570nm波长处。
由于此吸收峰的大小与氨基酸释放的氨量成正比，因此可作为氨基酸的定量分析方法法医学上这个反应被用于鉴定指纹。
茚三酮反应（Kaiser鉴定）也可用来在固相接肽时检验脱保护基是否已经完成，鉴定和比色法分离氨基酸以及鉴定铵离子（呈紫色）。
茚三酮与氨基酸反应生成蓝紫色化合物，但pro，羟-pro反应时呈黄色。
茚三酮用于脯氨酸含量的测定当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸的含量的高低。
在520nm 的波长下比色，从标准曲线（用脯氨酸标准溶液制得）上查出(或用回归方程计算)脯氨酸的含量。
①茚三酮检出物：氨基酸、胺与氨基糖类。
溶液：本品O.2g溶于乙醇l00ml中。
方法：喷后于110oC加热。
结果：呈红紫色斑点。
茚三酮对一级二级的胺显色肯定没问题的，三级胺有些可以，酰胺应该也没问题的，配制：1.5g 茚三酮 + 100mL of 正丁醇+ 3.0mL 醋酸；显色的时候板子浸湿，用纸擦一下多余液滴，再用电热枪（电吹风太弱了）吹出斑点，显色因为氨基酸的不同而显示不同的紫色黄色等等，你想检测伯胺的话，肯定没有问题的！配制方法：1.5g 茚三酮+ 100mL of 正丁醇+ 3.0mL 醋酸茚三酮不是太好溶解，需要多搅拌才行。
氨基酸分离鉴定中显色剂为什么不能用茚三酮水溶液
氨基酸分离鉴定中显色剂为什么不能用茚三酮水溶液茚三酮根很多种氨基酸都显示紫色没办法分离鉴定呀茚三酮使氨基酸显色原理α氨基酸与茚三酮在弱酸性溶液中共热，反应后经失水脱羧生成氨基茚三酮，再与水合茚三酮反应生成紫红色，最终为蓝色物质。
脯氨酸等仲胺氨基酸与茚三酮反应生成黄色物质。
该反应可广泛用于各种氨基酸的定性或定量测定。
阿尔法氨基酸与水合茚三酮一起加热，经氧化脱氨变成相应的阿尔法酮酸，酮酸进一步脱羧变成醛，水合茚三酮被还原成还原成还原型茚三酮。
在弱酸性溶液中，氨、还原型茚三酮，和另一分子水合茚三酮反应，缩合成蓝紫色物质。
注意事项（1）被分离物质在该溶剂系统中Rf在0.05～0.8之间，各组分之Rf值相差最好能大于0.05，以免斑点重叠。
（2）溶剂系统中任一组分与被分离物之间不能起化学反应。
（3）被分离物质在溶剂系统中的分配较恒定，不随温度而变化，且易迅速达到平衡，这样所得斑点较圆整。
本实验采用八种混合氨基酸为样品，用酸性和碱性两种溶剂进行双向层析，以茚三酮为显色剂，可获得分离清晰的层析图谱，如图3.2所示。
注意事项（1）烘箱加热温度不可过高，且不可有氨的干扰，否则图谱背景会泛红。
（2）第一相溶剂最好在使用前再按比例混合，否则会引起酯化，影响层析效果。
（3）整个实验操作应戴手套进行。
思考题1．酸性与碱性溶剂系统对氨基酸极性基团的解离各有何影响？2．为什么展层时要用两种溶剂系统？性质：又称比移值。
是色谱法中表示组分移动位置的一种方法的参数。
定义为溶质迁移距离与流动相迁移距离之比。
在一定的色谱条件下，特定化合物的R f值是一个常数，因此有可能根据化合物的R f值鉴定化合物请问薄层层析时，Rf值在什么范围时，分离效果比较准我帮你查了相关书籍结合我的实验经验，薄层层析采用硅胶G-CMC板，通用展开系统：无水乙醇-苯（1：4）；苯-氯仿（1：3）；丙酮-甲醇（1：1）。
先用无水乙醇-苯（1：4）展开，Rf值如果>0.8，改用苯-氯仿（1：3），若Rf值如薄层层析时为甚麼Rf值要在0.2~0.8之间Rf值的大小与样品的结构、性质、溶剂系统等有关薄层层析时Rf值要在0.2~0.8之间主演是考虑的经济性，在效果比较好的情况下保持展开剂的用量少蛋白质的性质实验From： Update：2006-12-01【目的和要求】1. 学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。
茚三酮反应
反应原理：参考资料•中文名称：苯硑戊三酮，茚三酮英文名称：NinhydrinNinhydrin (DE)1,2,3-Trioxohydrinden Hydrat (DE)1,2,3-Indantrione1,2,3-Triketohydrindene1H-Indene-1,2,3-trione2,2-Dihydroxy-1H-indene-1,3(2H)-dione分子式：C9H6O4分子量：178.14CAS RN：485-47-2熔点：251℃密度: 0.86特性反应：跟酶类或者多肽在加热状况下发生显紫色反应。
•含量不少于95.0% 净重5g•白色或淡黄色结晶或结晶性粉末•~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~•由于热敏纸（一种对热敏感的纸，如传真纸是其中一种，译者注）在信用卡收据上广泛使用，在热敏纸上显现潜指纹成为警方需解决的突出问题。
众所周知，茚三酮能与指纹汗液中的氨基酸反应，是在多孔表面显现潜指纹的最早方法。
然而，一些热敏纸在使用常规的茚三酮溶液处理时出现对热敏感的正面背景颜色变黑的现象，结果使得收据上的指纹信息受到损毁。
•目前，在热敏纸上显现潜指纹可采用的方法有：１、使用茚三酮衍生物替代茚三酮；２、茚三酮夹心法（用两张含干茚三酮的吸墨纸将热敏纸夹在中间，加压并保持数日）；３、二甲氨基苯甲醛烟熏法；４、通过电子探测微量分析仪测绘潜指纹法；５、对新鲜潜指纹使用碘熏法。
•本文介绍的方法是通过降低气压使茚三酮升华，无需溶剂显现热敏纸上的潜指纹。
茚三酮的分子量为１７８．１４，理论上可以从固相直接转化为气相。
已有文献尚没有关于茚三酮的升华和气体分压试验的报道，除了个别文献提及茚三酮在分解时熔点为２４１℃，有人在常压下曾使用茚三酮烟熏法。
••一、试验设备及方案•整个试验在一个边长为５０ｃｍ的立体真空箱进行。
真空箱设一个玻璃前门，内部有一个可控温的热源，直径为５ｃｍ，位于距真空箱底部上方１０ｃｍ处。
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茚三酮显色原理
茚三酮（Indaneone）显色原理是通过茚三酮与亚硝酸钠（NaNO2）和一定条件下的氢酸反应，生成显色的偶氮染料。
该反应的显色原理主要如下：
首先，在盛有茚三酮的试管中，加入适量的亚硝酸钠溶液。
亚硝酸钠是一种常用的弱氧化剂，可以与茚三酮发生氧化反应。
随后，在试管内加入稀盐酸（HCl）溶液，调节反应环境酸性。
氢酸的加入可以加速反应的进行，并且使得反应中间体更容易形成和稳定。
在适宜的温度和反应时间下，亚硝酸钠与茚三酮反应，产生一个中间体。
这个中间体是不稳定的，可能通过裂解或另外的反应进一步分解。
然而，在酸性条件下，这个中间体可能会与另一个茚三酮分子发生偶氮偶合反应，形成一个稳定的偶氮染料。
该偶氮染料通常呈红色或橙色，可以通过目视或分光光度计等方式进行检测。
这个颜色的出现是茚三酮与亚硝酸钠反应得到的标志，可以用于检测亚硝酸盐的含量。
亚硝酸盐常见于食品中，其含量过高可能对人体造成危害，因此茚三酮显色原理在食品安全领域有着广泛的应用。