芜菁花叶病毒研究进展

芜菁花叶病毒研究进展摘要概述了芜菁花叶病毒的研究进展，主要包括其地理分布与危害、寄主与传播途径、基因组结构及其功能、基因组的变异、检测、鉴定及抗性基因等内容，以期减少芜菁花叶病毒的危害。

关键词芜菁花叶病毒；生物学特性；基因组1芜菁花叶病毒的地理分布与危害芜菁花叶病毒（Turnip Mosaic Virus，TuMV）为+ssRNA病毒，马铃薯Y病毒属，是一个全球性重要病害，主要分布在温带和热带地区，五大洲均有报道。

在亚洲、北美洲和欧洲部分地区对芸薹属作物和蔬菜危害最为严重。

TuMV也是我国十字花科蔬菜重要的病原病毒，以TuMV为主要病原的病毒病在大白菜上通常发病率为10%~30%，严重的达80%~90%。

TuMV引起的油菜病毒在长江中下游地区，一般减产20%~30%，大流行年份达50%。

2TuMV的寄主与传播途径TuMV是仅有的侵染芸薹属植物的马铃薯Y病毒属的病毒，与该属其他病毒相比，TuMV具有广泛的寄主范围。

在人工接种条件下，TuMV至少可以侵染43科156属318种植物，而且新报道的寄主植物还呈不断增加的趋势。

TuMV的热钝化温度为55～62℃，稀释限点为10-4～10-3。

可以用病株汁液摩擦接种传染，但在自然界主要是由蚜虫传播的。

TuMV可通过至少89个种的蚜虫以非持续性的方式进行传播，主要传播媒介是桃蚜、甘蓝蚜、萝卜蚜等。

这种病毒属于非持久性的口针带毒型，蚜虫获毒和传毒时间很短，都在1min内，但传毒效率很高，萝卜蚜的传毒效率高达82%。

有翅蚜迁飞的数量和时间对病毒的传播影响较大。

但也有报道发现不能通过蚜虫传播的TuMV株系。

TuMV侵染植株后，病毒粒子存在于寄主细胞的细胞质中，并可在其中复制。

3基因组结构及其功能TuMV分子生物学方面的研究始于20世纪70年代末。

1978年，Choi等人改进了提纯方法，用聚丙烯酞胺凝胶电泳测定了TuMV核酸的分子量，确认了TuMV核酸为RNA。

目前已知TuMV病毒粒子线形，长宽为720nm×（15~20）nm，螺旋对称，螺距3.4nm；整个粒子由95%的外壳蛋白和5%的RNA构成，沉降系数为150S，在氯化铯中浮力密度为1.31g，分子量为3.0×106～3.5×106；其外壳蛋白为单一组分，有约188个氨基酸残基组成，单一多肽的蛋白亚基分子量为3.2×107～3.4×107。

TuMV的紫外吸收特性具有典型的核蛋白紫外吸收曲线，其吸收峰的谷与顶分别在245nm和260nm，A260/A280=1.2左右，这说明该病毒具有较低的核酸含量。

自1992年Nicolas首次发表TuMV核酸全序列以来，截至目前世界各地共有38个株系全序列发表。

Genesbank上已登录TuMV各分离物的核酸部分序列达到652条。

TuMV基因组由单组分正单链RNA分子组成，长约9 798~9 844核苷酸，5’端是帽状的单个双价相连的病毒编码VPg蛋白质分子，3’端由1个可变的PolyA构成，有1个单个开放式阅读框架（ORF），两翼是2个非转译区（UTR），在5’UTR中有1个内在的核糖体进入位点。

单一开放框可表达产生1个多肽前体，在3种编码病毒蛋白酶的作用下，共翻译和转录成10种成熟蛋白。

这些蛋白的功能是目前研究的热点。

开放式阅读框的第1个蛋白P1（40KD）蛋白是一种丝氨酸蛋白酶，高度变异。

P1蛋白具有与核酸结合的特性，可能是在RNA翻译中起某种作用，通过改变胞间连丝允许通过物质的最大极限来调节细胞间核苷酸的转运。

同时，还能从初生蛋白多聚体的C′端开始，酶切保守的核苷酸酶切位点。

开放阅读框的第2个蛋白HC-Pro（52KD）是按它的双重作用命名的，蚜虫传播的帮助组分和它的蛋白酶活性。

在这个蛋白中已经鉴定出和蚜虫可传播性有关的氨基酸。

这个蛋白被认为是担当多聚体的作用来帮助病毒外壳蛋白粘到蚜虫的口针上。

HC-Pro蛋白可以排除限制而增加胞间连丝的长度，调整病毒RNA在细胞间的运动。

第3个蛋白P3（40KD）蛋白还没有明确它的功能，和其他蛋白不同，其序列高度可变，被认为可能与致病性及症状的决定有关。

第4个蛋白6K1蛋白（6KD）的作用也没有明确，可能和P3 蛋白活性的调节有关。

第5个蛋白圆柱状内含体蛋白CI（72KD），是根据TuMV在被感染的植物细胞内形成了圆柱状内含体结构来命名的。

病毒分离物序列上的差异会导致柱状内含体蛋白结构形态上的差异。

CI最先在胞间连丝内形成，可能在病毒细胞间的转运过程中起着重要的作用。

此外，还含有属于螺旋酶总科2特征性的DEXH 保守区，从3′到5′螺旋酶活性解开dsRNA，对于病毒的复制是不可缺少的。

第6个蛋白6K2（6KD）蛋白能与胞膜结合，它与病毒长距离移动以及病症表现有关。

第7个蛋白VPg蛋白可通过磷酸二酯键的酪氨酸残基以共价结合的方式重新进入复制复合体，在正链和负链中均可出现。

VPg蛋白可以激活NIb 多聚酶，进而参与相应链的合成。

说明VPg在病毒RNA翻译中的重要地位。

第8个蛋白核内含体蛋白NIa（27KD）是与TuMV多聚蛋白体切割相关的1个半胱氨酸蛋白酶，它以水解的方式剪切多聚蛋白上9个连接位点中的7个。

NIa结构的稳定性及蛋白酶的活性易受温度和盐离子浓度的影响。

第9个蛋白核内含体蛋白NIb（60KD）是病毒的依赖RNA的RNA聚合酶（RdRp），含有3个高度保守区域。

针对这3个保守区域已开发了单克隆抗体。

Nlbs蛋白利用3′UTR（甚至可以是异源的）产生互补的RNA。

最后一个蛋白外壳蛋白CP（33KD）包被病毒RNA。

CP的N′端区域和P1、P3蛋白是TuMV最易变异的3个区域。

蚜传和非蚜传的TuMV两株系CP的N′端有6个氨基酸的差异。

CP的N′端第8位点上的氨基酸残基在单抗与CP的N′端特异性的结合中起关键作用，后来发现这个氨基酸残基是个保守的氨基酸基序（DAG），DAG可以用血清学方法辨别的。

DAG通过与HC-Pro互作参与和蚜虫口针的结合，因此CP与蚜虫的传毒密切相关。

CP也参与病毒在植物胞间长距离的移动，并调控病毒RNA复制。

4TuMV基因组的变异TuMV基因组的变异可能由点突变和重组引起。

RNA聚合酶缺乏3′~5′核酸外切酶的阅读校正活性，这样单链基因组上就不能进行错配修复，导致存在相对较高的错参率，一般每个复制循环每10kb分子就有0.1～10.0个发生突变。

另一个可能是TuMV基因组的5′端区域内发生了复制滑动。

TuMV能较快地发生变异可能就是它能侵染很多寄主的原因，TuMV变异类型是通过复制错误和寄主基因型选择压力的平衡来维持的。

Tomimura等对来自世界各地的38个TuMV分离物基因组全序列的变异进行研究，结果表明，至少1/5的序列是重组的。

没有明显重组的序列形成一组，这些组与致病力差异以及起源相关。

6个来自欧亚非芸薹属的B致病型的分离物可能是TuMV种群的祖先，而新近出现的种群分支是只在东亚发现的BR致病型分离物。

8个均来自东亚的分离物很明显表现出重组，可能是新近重组的结果，然而同样有8个来自世界各地的分离物明显是先前重组。

38个分离物基因组全序列的比较表明TuMV起源于欧亚大陆，并且新近在东亚出现新进化。

Ohshima等研究了76个来自世界各地的芸薹属、萝卜属以及其他作物上的TuMV分离物的P1和CP基因变异情况，寄主鉴定把它们分为2组致病型：芸薹组（B）和芸薹萝卜组（BR）。

1/10的分离物基因组被发现是重组，许多分离物P1蛋白的5′端300个核苷酸出现变异，但CP基因3′端380个核苷酸几乎是保守的。

在系统关系树上，这些分离物可分为4个组。

第1组：basal-B组是由8个B致病型分离物构成，它们都易变异，不是单起源的，并且都来自欧亚大陆的西南和中部的芸薹或非芸薹属作物。

第2组：basal-BR组与这一组最近，也是易变异的，是由8个BR致病型的欧亚分离物组成。

第3组：Asia-BR组也是最少变异的组，共有22个BR致病型分离物，其中大多数来自东亚特别是日本，寄主大多数是萝卜。

第4组：World-B组，有36个分离物，来自各大陆，几乎是来自芸薹属的B致病型。

Ohshima认为世界各地的TuMV的变异进化可能就像它的芸薹属寄主一样，先出现在欧洲，然后传播到世界各地，而近来BR型致病型也开始在东亚进化。

TuMV分子的起源进化可能是寄主适应、基因重组和地理分布等综合因素作用的结果。

5TuMV的检测、鉴定早期TuMV病毒检测、鉴定是以TuMV的寄主病症和寄主范围为主要依据，结合病毒的传播进行试验的。

但受年份、环境和品种等因素的影响，这些标准存在局限性。

后来人们利用电镜负染技术进行TuMV的检测和鉴定，其优点是快速、简单和直接，从加样到结果只需5min。

但电镜比较昂贵，操作需要一定技能，而且工作比较集中，所以样本数量大则不易处理。

近10多年来，在TuMV病原检测与鉴定上最广泛使用的是血清学方法。

国内胡吉成等在1962年就制备了TuMV抗血清，并将该抗血清用于检测田间白菜感病情况。

蔡岳松、赵荣乐等分别在TuMV侵染引起的四川榨菜病毒病、芝麻黄花型病害的病原检测和鉴定中采用血清学方法。

近年来，分子生物学技术开始用于TuMV病原的检测，邓晓东等证明用地高锌标记的DNA探针比用间接ELISA检测TuMV的灵敏度高6倍。

Jansen1990年将免疫学方法和分子生物学检测技术有机结合起来，建立了IC-RT-PCR检测方法，与血清学检测相比，可以直接从病汁液中捕获病毒粒子，起到了浓缩和纯化病毒的作用，又利用PCR技术放大了检测的灵敏度。

施曼玲用IC-RT-PCR方法鉴定出浙江榨菜病毒病的病原是TuMV。

6TuMV抗性基因在广泛筛选对TuMV抗性的寄主的研究基础上，人们又开始从分子生物学角度对抗性遗传机制进行深入探索。

目前有关TuMV寄主抗性基因的研究在拟南芥和芸薹属作物上取得较大进展。

Martin等在拟南芥各生态型对TuMV的抗性研究中，发现有4种生态型表现出对TuMV的抗性，分别是Bay-0、Di-0、Er-0和Or-0。

其中Di-0、Er-0和Or-0具有基因型的抗性，在TuMV侵染过程中发挥不同程度的作用；而生态型Bay-0的好几个品种明显表现出对TuMV在胞间移动的干扰。

许多抗性鉴定试验证实芸薹属中广泛存在对TuMV的抗性，目前所发现的TuMV抗性基因主要在甘蓝型和其他类型油菜上可以分离到，已经有5个抗性基因被图谱定位。

最近发现大白菜中也存在广谱的隐性抗性。

曹必好等在结球甘蓝高抗TuMV自交不亲合系84075品种上克隆到与TuMV抗性相关的基因TuR。

除了寄主本身自然抗性以外，国内外也开展了TuMV自身基因介导转基因抗性研究。