马铃薯种薯病毒检测方法2016-6-27

马铃薯种薯病毒检测现已发现，造成马铃薯退化的病毒有30余种，严重为害马铃薯的病毒有七种：马铃薯卷叶病毒（PLRV）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯A病毒（PV A）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯S病毒（PVS）及马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）。

在马铃薯栽培过程中，出现叶片皱缩卷曲，叶色浓淡不均，茎秆矮小细弱，块茎变形龟裂，产量逐年下降等现象，就表明马铃薯已经发生“退化”。

种薯“退化”是病毒的侵染及其在薯块内积累造成的，也是引起产量降低和商品性状变差的主要原因。

采用现代生物技术将种薯内的病毒去掉，恢复马铃薯品种本身的生理功能和生产特性，才能防止马铃薯的“退化”，使之达到育种家培育品种本身的商品性状和产量。

这就是种薯需要脱毒和采用脱毒种薯能够大幅度提高产量的重要原因。

1.种薯分类复合国家标准（GB18133-2012 表1）规定的相应质量要求的种薯为原原种、原种、一级种薯和二级种薯。

表1 各级别种薯田间检查植株质量要求1.1原原种（G1）用脱毒组培苗或试管薯在防虫网、温室等隔离条件下生产，经过质量检测达到国家标准（表1）要求的，用于原种生产的种薯。

1.2原种（G2）用原原种作种薯，在良好隔离环境条件下生产的，经过质量检测达到国家标准（表1）要求的，用于生产一级种的种薯。

1.3一级种薯（G3）在良好隔离环境中，用原种作种薯生产的，经过质量检测达到国家标准（表1）要求的，用于生产二级种的种薯。

1.4二级种薯（G4）在相对隔离环境中，用一级种作种薯生产，经过质量检测后达到国家标准（表1）要求的，用于生产商品薯的种薯。

1.5种薯批来源相同、同一块地、同一品种、同一级别以及同一时期收获、质量基本一致的马铃薯植株或块茎作为一批。

2.主要检测病毒2.1马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）2.2马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）2.3马铃薯A病毒（Potato virus A,PV A）2.4马铃薯M病毒（Potato virus M,PVM）2.5马铃薯卷叶病毒（Potato leafroll virus,PLRV）2.6马铃薯S病毒（Potato virus S,PVS）2.7马铃薯纺锤块茎类病毒（Potato spindle tuber viroid,PSTVd）3.检测方法3.1病毒检测采用酶联免疫（ELISA）或反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法。

3.2类病毒采用往返电泳（R-PAGE）、RT-PCR、或核酸斑点杂交（NASH）方法。

4.种薯质量要求4.1脱毒苗基础苗经检测，不含有上述7种重要病毒（PVX、PVY、PV A、PVM、PLRV、PVS、PSTVd），否则淘汰，在瓶苗大量扩繁前需要对基础苗提前检测，来确定基础苗是否合格。

4.2原原种检测4.2.1温室或网棚中，组培苗定植结束或试管薯出苗后30天~40天，同一生产环境条件下，对于非正常植株或器官应马上采集样本进行实验室检验。

原原种收获后检测，原原种每个品种每100万粒检测200粒（每增加100万粒检测样品增加40粒，不足100万粒的按100万粒计算）。

4.3原种、一级种和二级种田间检测采用目测检查，种薯每批次至少随机抽检5点~10点，每点100株（见表2），目测不能确诊的非正常植株或器官应马上采集样品进行实验室检验。

表2 每种薯批抽检点数检测面积检测点数/个检查总株/株≤1 5 500＞1，≤40 6~10（每增加10hm2增加1个检测点）600~1000 ＞40 10（每增加40hm2增加2个监测点）＞1000备注：（1）对于原种而言，采样500个左右，进行混样，每25个叶片混在一起作为一个检测样品，可以降低检测成本，然后把有病毒的混样分开检测，来确定最终的带病毒机率。

图1 分解检测（2）对于一级种和二级种，根据（GB18133-2012 表1）采样个数可以减少至100个，可以每10个叶片混样检测，根据图1分解检测，来确定最终的带病毒机率。

（3）整个田间检测过程要求于40天内完成。

第一次检测在现蕾至盛花期，第二次检查在收获前30天左右进行。

（4）当第一次检查指标中任何一项超过允许率的5倍，停止检测，该地块马铃薯不能作为种薯销售，或者原种降级销售，或者作为商品薯销售。

（5）第一次检测任何一项指标超过允许率在5倍以内，可以通过通过种植者拔除病株和混杂株降低比率，第二次检测为最终田间检测结果。

4.4原种、一级种和二级种收获后检测种薯收获和入库期，根据种薯检测面积在收获田间随机取样，或者在库房随机抽取一定数量的块茎用于实验室检测。

4.4.1大田每批种薯根据生产面积确定检测样品数量（表3）。

表3收获时实验室检测样品数量4.4.2种薯出库前应进行库房检测。

大田各级种薯根据每批次总产量确定扦样点数（表4）。

表4大田各级种薯块茎扦样量5.判定规则5.1定级种薯级别以种薯繁殖的代数，并同时满足田间检查和收获后检测达到质量要求为定级标准。

5.2降级检测参数任何一项达不到拟生产级别种薯质量要求时，降到与检测结果的质量指标的种薯级别，达不到最低一级种薯质量指标的不能用作种薯，作为商品薯。

第二次田间检测超过最低级别种薯允许率的，该地块马铃薯不能作为种薯。

5.3出库标准任何级别的种薯出库前应达到库房检查块茎质量要求，重新挑选或降到与库房检测结果相对应的质量指标的种薯级别，达不到最低一级种薯质量指标的，应该重新挑选至合格后方可发货。

附录1 酶联免疫吸附试验法(ELISA)1 原理酶联免疫测定是一种用血清学技术检测植物病毒的方法。

其原理：双抗体夹心ELISA（DAS-ELISA）试验的原理是利用结合在酶联板表面的抗体（IgG）捕获待检样品中的目标抗原（A），再用特异性的酶标抗体结合物（E）检测被结合的抗原，通过比色底物（S）反应检测酶（图例中是碱性磷酸酶）。

双抗体夹心酶联免疫吸附测定的主要方法与实验步骤如下：2 仪器和设备①酶联板一般用96孔酶联板。

②微量移液器需2~10 μl、10~50 μl和10~200 μl三种规格，并附相应规格的塑料头。

③冰箱。

④温箱：温度设置为37℃。

⑤用于采样、研磨的小塑料袋。

⑥酶联检测仪（Bio-Rad 550型）碱性磷酸酶（Alkaine Phosphatase. AKP）标记的酶标抗体用405nm波长检测。

3 应用的化学试剂为分析纯级规格，用水为蒸馏水。

①抗体免疫球蛋白（r-globulin）和酶标记抗体（Conjugate）从某一马铃薯病毒抗血清提取的免疫球蛋白，将其浓度调为1 mg/ml，作为包被微量滴定板的抗体。

用碱性磷酸酶标记的某一病毒的免疫球蛋白的酶标抗体，一般使用浓度常在1:1000以上，贮藏于4 ℃条件下备用。

目前多用马铃薯特定病毒抗血清提取的免疫球蛋白包被好的酶联板，只需加检测样品和酶标抗体即可，这样可大大简化检测步骤，节省检测时间。

②碳酸盐包被缓冲液1.59 gNaCO3（碳酸钠），2.93 gNaHCO3（碳酸氢钠）加水至1L。

pH9.6。

③ PBS-Tween-20缓冲液8 gNaCl（氯化钠），0.2 gKH2PO4（磷酸二氢钾），2.2gNa2HPO4·7H2O（磷酸氢二钠）或2.9 gNa2HPO4·12H2O，0.2 gKCl（氯化钾）加水至1L，然后加0.5 ml Tween-20，洗涤微量滴定板用。

pH7.4。

④样品缓冲液取PBS-Tween-20缓冲液100 ml，加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）2 g。

⑤底物缓冲液取0.2mol/L Na2HPO4·12H2O溶液25.7ml，加0.1mol/L柠檬酸溶液24.3 ml，加水50 ml，pH调至5.0（现用现配）。

临用前加磷苯二胺40 mg，30％过氧化氢（H2O2）0.15 ml混匀，避光放置，应为白色或微黄色溶液。

⑥终止液为0.2mol/L硫酸溶液，用1体积浓硫酸加9份水。

4 操作步骤4.1 包被酶联板把免疫球蛋白用包被缓冲液按1:1000稀释，用微量进样器向微量滴定板的每一样品孔内加入稀释的免疫球蛋白200μL。

在37℃条件孵育1h。

（或在4 ℃条件下过夜）。

4.2 洗涤包被的酶联板甩掉酶联板中多余的免疫球蛋白稀释液，在吸水纸上敲打微量滴定板，除尽残留溶液。

向微量滴定板的样品孔中加满洗涤缓冲液，停留3min，甩掉洗涤缓冲液，共洗涤3~4次，以除尽未吸附的免疫球蛋白。

4.3 加被检测的样品4.3.1 取样在无菌条件下，从瓶苗上剪下长2 cm茎段，放入小塑料袋内，把取样的试管苗放回原瓶内，封好瓶口，样品编号，按检测结果决定取舍。

4.3.2加样品缓冲液加入的液量依每个样品上样的孔数而定，例如每个样品准备上一个样品孔时，可加入0.4 ml样品缓冲液，研磨后可得200 μl清液，够一个样品孔用。

4.3.3 加入检测样品洗涤完的微量滴定板的样品孔内，按样品编号逐个加入提取的样品液200μl，每一块微量滴定板上，可设两个孔的阳性对照。

两个孔的阴性对照和两个孔的空白对照。

4.3.4 孵育把加完样品的微量滴定板在37 ℃条件下孵育4-6 h，或在4℃条件下过液，然后按4.2洗涤微量滴定板。

4.3.5 加酶标记抗体把酶标记抗体用样品缓冲液按1:1000稀释，每个样品孔中加入200 μl稀释的酶标记抗体。

4.3.6 洗涤微量滴定板按4.2方法洗涤微量滴定板，以除掉未结合的酶标记抗体。

4.3.7 加底物加入200μl底物。

当观察到阴性对照孔与阳性对照孔显现的颜色可以明确区分时（辣根过氧化物酶标记的酶标记抗体显现桔红色，碱性磷酸酶标记的抗体显现鲜黄色）；或未设对照样品孔的微量滴定板的一些样品孔之间显现的颜色可以（碱性磷酸酶标记的抗体一般可不加终止液）。

明确区分时，每孔加入50μl终止液。

5 结果判定5.1 目测观察显现颜色的深浅与病毒浓度呈正比。

无色为阴性反应，记录为“—”；显现淡黄色为阳性反应，记录为“＋”，依颜色的逐渐加深记录为“＋＋”和“＋＋＋”。

5.2 用酶联检测仪测定光密度值样品孔的光密度值大于阴性对照孔光密度值的2倍即判定为阳性反应，（阴性对照孔的光密度值应≤0.1）。

附录2 快速检测马铃薯病毒方法（Spot Check ）1 应用：非常适合应用在田间检测，实验室也可以使用它来提高效率。

2试剂盒所含物品2.1每一组设备包括一个提取瓶（1），里面含有提取缓冲液和可使植物组织软化的滚珠。

转移吸管（2），用来吸取提取液到横向流动检测设备。

2.2 横向流动检测设备，密封在金属箔袋中。

3 图解说明 3.1 进行检测步骤1-样品的制备（图）• 取下疑似感病叶片或叶片的一块（约3cm x 4cm ）。

从感病植物的不同部位或者几株感染相同病原菌的植物选取小块叶片构成混合样品会得到较好的结果。