dna连接反应的影响因素提高平端连接效率的方法
提高平末端连接效率的研究
提高平末端连接效率的研究张伟,艾秀莲,王玮,王志方,崔春生,李晨华,谢玉清(新疆农科院微生物所,新疆乌鲁木齐830000)摘 要:在平末端连接反应中,为了提高连接效率,研究载体与片段的分子量比、载体与片段的摩尔比、连接反应体积、连接反应的温度、连接反应时间长短等条件对连接效率的影响,发现这些因素都会直接影响连接效率。
因此在做不同的平末端连接反应时,应该把上述因素协同起来考虑。
此外,反应时间长短也应根据不同情况区别对待。
关键词:平末端连接;连接效率;普适性中图分类号:Q523 文献标识码: 文章编号:1001-4330(2002)05-0300-02The Study to Improve the fficiency of Ligation of B lunt -ended DNAZH ANG Wei ,AI X iu -lian ,W ANG Wei ,W ANG ZHi -fang ,C UI CHun -sheng ,LI CHeng -hua ,XIE Y u -qing(Institute o f Microorganism ,Xinjiang Academy o f Agricultural Sciences ,Urumqi 830000)Abstract :It is important to improve the efficiency of ligation reaction ,especially for joining of blunt -ended DNA which is univer 2sal applicated ,however ,with lower efficiency.In our study ,We draw a conclusion that the m ol -ratio of vector and insert 、the v olume of ligation reaction 、the temperature and time of ligation reaction etc.All can in fluence the efficiency of ligation ,s o we should think of these factors together.K ey w ords :Ligation of blunt -ended DNA ;E fficiency of ligation在分子生物学的研究中,DNA 末端的连接是一极为常用的基本操作,可分为粘末端和平末端连接,粘末端连接效率相对较高,平末端的连接效率一般非常低,但平末端连接具有普适性,被广泛地用于将外源DNA 片段的相互连接当中。
基因工程简答题
(1)修复反应，制备平末端
可用Klenow酶修复限制性内切核酸酶或其他方法产生的5'或3'突出末端，制备平末端，这样可以使原来具有不相容的黏性末端的DNA片段通过平末端重组。如在反应系统中加入放射性同位素标记的脱氧核苷酸，用这种末端填补的方法可以制备3'末端标记的探针。
答：
基因型是lac-．原因是在该密码子中插入了两个碱基，造成了移码突变，所以Lac的基因是缺陷的
27．在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA
而不用基因组DNA?为什么要在cDNA前加上细菌的启动子?
答：
这是因为细菌没有内含子剪接系统，并且不能识别真核生物的启动子之故。
10． 列举质粒载体必须具备的4个基本特性。
．答：
(1)独立复制； (2)有选择标记； (3)有独特的酶切位点； (4)能转化但不扩散。
11． 什么叫穿梭载体？
答：
含有细菌质粒和克隆的真核生物DNA片段的杂种质粒，有两个复制起点和既能在细菌又能在真核细胞中进行选择的选择标记，所以，很容易从一宿主转到另一个宿主(来回穿梭)。
条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星
活性。
概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量(>5％, v／v)；(2)限制性
内切核酸酶用量过高(>100U／ugDNA)；(3)低离子强度(<25 mmol／L)；(4)高pH(8．0
如果你的杂交探针是双链的，可能因为在加人杂交混合物之前忘记将探针变性而得到空白的放射自显影结果。
23．切口移位(nick translation)标记探针的主要步骤有哪些?
—连接酶和激酶
连接酶与激酶DNA连接酶DNA连接酶，旧称“合成酶”，最初是在大肠杆菌细胞中发现的。
它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-磷酸与另一DNA链的3'-羟基生成磷酸二酯键。
但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。
DNA连接酶在DNA复制、修复以及体内外重组过程中起重要作用。
一、常用的DNA连接酶目前用于试管中连接DNA片段的DNA连接酶主要有E.coli DNA连接酶、T4DNA 连接酶、热稳定DNA连接酶等 [1]。
T4DNA连接酶是以ATP为能源的，而E.coli DNA连接酶则是以NAD为能源的。
先介绍下两个概念：对于双链DNA分子，在一条链上推动了一个磷酸二酯键称为切口，失去一段单链称为缺口。
连接酶的连接作用发生在双链DNA切口处，而不能连接两条单链DNA或者双链DNA中缺失了核苷酸的缺口[2]。
因此，无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。
如下图：（一）E.coli DNA连接酶E.coli DNA连接酶是由分子量75kD的多肽链构成，可被胰蛋白酶水解。
E.coli DNA连接酶能催化双链DNA片段互补黏性末端之间的连接，但是不能催化双链DNA片段平末端之间的连接，其在催化连接反应时需要NAD+与酶形成酶—ATP复合物，同时释放NMN[3]。
（二）T4 DNA连接酶T4 DNA 连接酶由T4 噬菌体基因编码，分子量为60kD。
目前商品化的T4 DNA 连接酶均由E.coli 基因工程菌生产，这种工程菌染色体DNA中整合了一个含有噬菌体DNA连接酶基因的λ-DNA片段。
当温度上升至42度处于溶源状态的重组大肠杆菌大量T4 DNA 连接酶，从而大大简化纯化过程。
T4 DNA 连接酶催化双链DNA 相邻核苷酸的5´-磷酸和3´-羟基之间的连接，平端和粘端都可被连接。
基因工程简答题综述.doc
基因工程简答题综述基因工程原理回顾，思考问题5，简要描述同型尾酶和同型裂解酶的区别。
同尾酶:不同来源的鉴定序列是不同的，但是它们可以切掉相同的粘性末端，并且在连接后不能被相关酶同时切掉。
分解酶:识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。
部分异构酶和不完全异构酶(PS:完全均裂酶:识别位置和切点完全相同。
不完全异构酶:识别位置是相同的，但切割点不同。
)6.连接酶的主要类型有哪些？有什么相同点和不同点？影响连接酶连接效果的主要因素是什么？类型:脱氧核糖核酸连接酶和核糖核酸连接酶的异同；同样的一点:脱氧核糖核酸可以用作模板，进行从5’到3’的核苷酸或脱氧核苷酸聚合。
差异:DNA聚合酶识别脱氧核苷酸，并在DNA复制中发挥作用。
核糖核酸聚合酶聚合核糖核苷酸，并在转录中发挥作用。
7.试着分析提高平端连接效率的可能方法。
(在线答案图例)1.低温下的长期连接效率优于室温下的短期连接。
2.向系统中加入少量载体切割酶，只要连接后原始酶切割位点消失。
这样，可以避免载体的自连接，并且平端连接的效率应该大大提高。
3.足够的向量和插入是最重要的。
4.平端的连接对离子浓度非常敏感。
5.尽可能减少连接反应的体积6.建议把它放在四度冰箱里连接两天。
效率高于14度。
8.基因工程中常用的主要DNA聚合酶是什么？1)大肠杆菌脱氧核糖核酸聚合酶2)克氏片段3)T7脱氧核糖核酸聚合酶4)T4脱氧核糖核酸聚合酶5)修饰的T7脱氧核糖核酸聚合酶6)逆转录酶7)Taq脱氧核糖核酸聚合酶第4章基因克隆载体系统1、作为基因工程的载体，它应该具备哪些条件？对受体细胞具有亲和力或亲和力(可转移性)；！有适当的筛选标志；！具有较高的外源DNA负载量；！具有多个克隆位点；！它具有适合特定受体细胞的复制位点或整合位点。
3.承运人的主要类型是什么？如何在基因工程操作中选择载体？基因工程中常用的载体主要包括质粒、噬菌体和病毒。
这些载体需要人工构建以去除致病基因并赋予一些新的功能，例如用于筛选的标记基因和单限制性内切酶。
基因工程09生物技术参考
---------------精品文档---------------答案仅供参考一、名词解释：1、DNA 变性： DNA 份子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。
变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。
2、DNA 复性：变性DNA 在适当条件下,二条互补链全部或者部份恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。
3、退火：指模板双链 DNA 经热变性，螺旋解开成单链后，通过缓慢冷却到55℃摆布，使引物(即具有互补碱基的 RNA 片段)与该模板 DNA 单链重新配对，形成新的双链份子的过程。
4、DNA 芯片：是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。
由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为 DNA 芯片。
仅供参考学习第 1 页---------------精品文档--------------- 5、基因诊断：又称 DNA 诊断或者份子诊断，通过份子生物学和份子遗传学的技术，直接检测出分子结构水平和表达水平是否异常，从而对疾病做出判断。
6、酶活性单位： 1 单位限制性内切酶(1 U)通常定义：在建议使用的 Buffer 及温度下，在 20ml (50ml)反应体系中反应 1 小时，使 1g 入DNA 彻底消化所需的酶量。
7、星活性：在非最适的反应条件下，酶的识别特异性降低，产生非特异性带，这种酶切特异性降低的现象，称为星活性。
8、平台效应：反应初期，靶序列 DNA 片段的增加呈指数形式，随着PCR 产物的逐渐积累，被扩增的 DNA 片段再也不呈指数增加，而进入线性增长期或者静止期，这种现象称为平台效应。
二、简答题1、影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？1)连接所用的目的片段的状态：¹效率：粘性末端>平端(100 倍)；¹ 5，突出>3，突出；¹平端： HaeIII>AluI>HinCII>SmaI2)连接温度仅供参考学习第 2 页¹连接效果最好在37 ℃，但形成的互补不稳定;¹最佳连接温度： 12-16 ℃，较好的连接效果，互补又较稳定;3)反应液中的成份：¹ ATP：反复冻熔， ATP 活性降低， ATP 溶解度不高，连接缓冲液宜分装；¹单价离子： 150-200mM NaCl，提高连接效果；¹ PEG：5%以下可以提高连接效率4)插入片段与载体的浓度比例¹载体 DNA 与外源 DNA 的份子摩尔比通常为 1 ﹕ 3 摆布，甚至 1 ﹕ 10 或者更高。
dna连接反应的影响因素提高平端连接效率的方法
dna连接反应的影响因素提高平端连接效率的方法1、连接缓冲液的阻碍：大体上缓冲液含有以下组分：20-100mmol/L 的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的范畴在7.4-7.8，较多用7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应；1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是坚持还原性环境，稳固酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。
与限制酶缓冲液不同的是连接酶缓冲液还含有0.5-4mmol/L的ATP，现多用1mmol/L，是酶反应所必需的。
2、 pH的阻碍：一样将缓冲液的pH调剂到7.4-7.8，较多用7.8。
有实验说明，若把pH为7.5-8.0时的酶活力定为100%，那么体系偏碱（pH为8.3）时仅为全部活力的65%；当体系偏酸（PH为6.9）时仅为全部活力的40%。
3、 ATP浓度的阻碍：连接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间，较多用1mmol/L。
研究发觉，ATP的最适浓度为0.5-1mmol /L，过浓会抑制反应。
例如，5mmol/L的ATP会完全抑制平末端连接，黏端的连接也有10%被抑制；还有报道，当ATP的浓度为0.1mmol/L 时，去磷酸载体的自环比例最大。
由于ATP极易分解，因此当连接反应失败时，除了DNA与酶的问题外，还应考虑ATP的因素。
含有ATP的缓冲液应于 -20℃储存，溶化取用后赶忙放回。
连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存，防止反复冻融引起ATP分解。
与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接缓冲液长期放置后往往失效，因此也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期储存），临用时加入新配制的ATP母液。
4、连接温度与时刻的阻碍：因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，因此温度过高会使氢键不稳固，但连接酶的最适温度又恰为37℃。
为了解决这一矛盾，在经过综合考虑后，传统上将连接温度定为16℃，时刻为4-16h。
基因与载体连接方法
基因与载体连接方法及其原理基因与载体连接方法是分子生物学实验中常用的技术，它可以将目的基因或序列插入到合适的载体中，从而实现基因的克隆、表达或功能分析。
基因与载体连接方法主要依赖于DNA连接酶和限制性核酸内切酶的作用，以及DNA片段末端的互补配对。
根据DNA片段末端的性质不同，可以有以下几种基本的连接方法：一、粘性末端连接法粘性末端连接法是最常用的基因与载体连接方法，它利用限制性核酸内切酶在特定的序列上切割DNA，产生带有单链突出端的双链DNA片段，这些突出端称为粘性末端。
粘性末端可以与相同或相似的粘性末端互补配对，形成稳定的双链结构。
然后，DNA连接酶可以在这些配对的粘性末端上催化磷酸二酯键的形成，从而实现DNA片段的连接。
粘性末端连接法的优点是具有较高的特异性和效率，因为只有相同或相似的粘性末端才能配对，而且配对后的结构较为稳定，不易被水解。
粘性末端连接法的缺点是需要选择合适的限制性核酸内切酶来切割目的基因和载体，而且不同的限制性核酸内切酶可能有不同的反应条件和缓冲液，需要进行优化和调节。
粘性末端连接法的具体步骤如下：1. 选择合适的限制性核酸内切酶来切割目的基因和载体。
一般来说，选择能在目的基因两端和载体多克隆位点上切割出相同或相似粘性末端的限制性核酸内切酶。
如果没有这样的限制性核酸内切酶，可以通过引物设计来在目的基因两端添加所需的限制性核酸内切酶位点，然后通过PCR扩增来获取带有粘性末端的目的基因。
2. 配制酶切反应体系，并在适当的温度和时间下进行反应。
一般来说，每个限制性核酸内切酶都有其特定的反应条件和缓冲液，需要按照说明书或厂家推荐进行操作。
如果使用两种或以上的限制性核酸内切酶进行双酶切或多酶切，需要选择能够同时满足所有限制性核酸内切酶反应条件和缓冲液要求的组合，或者进行分步反应，并在每次反应后纯化DNA。
3. 通过琼脂糖凝胶电泳来分离和回收目的基因和载体片段。
一般来说，使用1%~2% 的琼脂糖凝胶电泳可以有效地分离不同大小的DNA片段，并通过紫外光照射来观察DNA条带。
两DNA的连接
相同粘性末端的连接
用同一种限制性内切 酶或者用能够产生相 同粘性末端的两种限 制性内切酶分别消化 外源DNA分子和载体， 所形成的DNA末端彼 此互补，用DNA连接 酶共价连接起来，形 成重组体DNA分子。
Ⅰ.相同粘性末端的连接
同尾酶的DNA酶解片断连接而成的重组DNA，称为 异源二聚体。有一对同尾酶分别产生的粘性末端共 价结合形成的位点，称之为杂种位点。这类杂种位 点的序列，一般是不能再被原来任何一种同尾酶所 识别的，即被“焊死”。这有利于得到大量的重组 DNA分子，在基因工程实验中是非常有用的！
• 在DNA片段上某一酶切口处换成另一种酶切口
• – BamHI酶切片段用Klenow补平，或用S1酶切平；连 接一段linker或Adaptor，使之产生EcoRI粘性末端。 这样BamHI切口就换成了EcoRI切口 。
• – 由AluI更换EcoRI： AluI切开，T4-DNA pol切平， 另一段DNA EcoRI切开，Klenow补平，连接，原来含 有AluI的片段变成含有EcoRI
• 获得目的基因后，要做的就是目的基因和载体DNA分 子的连接，这是通过连接酶完成的，例如感染噬菌 体T4后的大肠杆菌所产生的DNA连接酶。
• 末端的DNA片段在DNA连接酶的作用下很容易共价连 接，因此被广泛地应用于重组DNA操作中。具有相同 平齐末端的DNA片段也可以连接，但不易于重新环化， 相对粘性末端而言，平整末端的连接效率较低，只 有粘性末端连接效率的1％。
GA－5′
平整末端的连接
• 还有来自副流感嗜血杆菌（Hemophilus parainflue nzae）的限制酶Hpal作用于识别顺序
• …GTT↓AAC… • …CAA↑TTG… • 而产生末端为…GTT …GAA的DNA片段。
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DNA连接反应的影响因素&提高平端连接效率的方法&外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应&平端ＤＮＡ连接接反应1、连接缓冲液的影响：大体上缓冲液含有以下组分：20-100mmol/L 的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，较多用7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应；1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是维持还原性环境，稳定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。
与限制酶缓冲液不同的是连接酶缓冲液还含有0.5-4mmol/L的ATP，现多用1mmol/L，是酶反应所必需的。
2、 pH的影响：一般将缓冲液的pH调节到7.4-7.8，较多用7.8。
有实验表明，若把pH为7.5-8.0时的酶活力定为100%，那么体系偏碱（pH为8.3）时仅为全部活力的65%；当体系偏酸（PH为6.9）时仅为全部活力的40%。
3、 ATP浓度的影响：连接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间，较多用1mmol/L。
研究发现，ATP的最适浓度为0.5-1mmol /L，过浓会抑制反应。
例如，5mmol/L的ATP会完全抑制平末端连接，黏端的连接也有10%被抑制；还有报道，当ATP的浓度为0.1mmol/L 时，去磷酸载体的自环比例最大。
由于ATP极易分解，所以当连接反应失败时，除了DNA与酶的问题外，还应考虑ATP的因素。
含有ATP的缓冲液应于 -20℃保存，溶化取用后立即放回。
连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存，防止反复冻融引起ATP分解。
与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接缓冲液长期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期保存），临用时加入新配制的ATP母液。
4、连接温度与时间的影响：因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，但连接酶的最适温度又恰为37℃。
为了解决这一矛盾，在经过综合考虑后，传统上将连接温度定为16℃，时间为4-16h。
现经实验发现，对于一般的黏性末端来说，20℃30min就足以取得相当好的连接效果，当然如果时间充裕的话，20℃60min能使连接反应进行得更完全一些。
对于平末端是不用考虑氢键问题的，可使用较高的温度，使酶活力得到更好的发挥。
5、酶浓度的影响：日常使用的DNA浓度比酶单位定义状态低10-20倍，连接平末端时酶用量要比连接黏端大10-100倍。
进行黏末端连接时需先行稀释，稀释液的成分与酶保存缓冲液相同或类似，稀释液中的酶能在长时间保持活力，也便于随时取用。
6、 DNA浓度的影响：要求得到环化的有效连接产物， DNA浓度不可过高，一般不会超过20nmol/L。
要求线性化的连接产物， DNA的浓度可以高些，至少是接近推荐的浓度。
在用大质粒载体进行大片段克隆时，以及在双酶切片段的连接反应中，DNA浓度还应降低，甚至是DNA的总浓度低至几个nmol/L。
另据研究，T4 DNA连接酶对DNA末端的表观Km值为1.5nmol/L，所以，连接时DNA浓度不应低于1nmol/L。
即应具有2nmol/L的末端浓度。
提高平端连接效率的方法：1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好，平端连接需要过夜反应。
2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。
这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。
足够多的载体和插入片段是最重要的。
要看片段具体情况而言，有时载体和片段浓度过高，容易产生线性化产物，不利于环化的。
插入的DNA片段的摩尔数是载体摩尔数的5-10倍，这个很关键。
载体通常50ng 就够了，若载体在10k左右，可用50－100ng。
3、平端的连接对于离子浓度很敏感，回收的时候多洗洗，加PEG和扩大酶量，22度2小时后4C过夜。
4、尽可能缩小连接反应的体积，最好不超过10微升，在5、6微升左右最佳。
5、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好。
（一）外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价链。
如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。
但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。
在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入后可被修复。
相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌ＤＮＡ连接酶和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶。
实际上在有用途中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶都是首选的用酶。
这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。
ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。
不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。
现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。
在瓜作用的底物。
如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对的两个末端同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。
这倦，在ＤＮＡ浓度低时，质粒ＤＮＡ重新环化将卓有成效。
如果连接反应中ＤＮＡ浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个ＤＮＡ分子的末端碰到另一ＤＮＡ分子末端的可能性也有所增大。
因此在ＤＮＡ浓度高时，连接反的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。
Dugaiczyk等(1975;同时参见Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第２、３期合刊）从理论上探讨了ＤＮＡ浓度对连接产物性质的影响。
简而言之，环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数：j和i。
j是ＤＮＡ分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度，j的数值是根据如下一种假设作出的：沉吟液中的ＤＮＡ呈随机卷曲。
这样，j与ＤＮＡ分子的长度成反比（因为ＤＮＡ越长，某一给定分子的两末端的越不可能相互作用），因此j对给定长度的ＤＮＡ分子来说是一个常数，与ＤＮＡ深度无关。
j＝[3/(3πlb0)]3/2其中l是ＤＮＡ长度，以cm计，b 是随机卷曲的ＤＮＡ区段的长度。
b的值以缓冲液的离子强度为转移，而后者可影响ＤＮＡ的刚度。
i是溶液中所有互补末端的深度的测量值，对于具有自身互补粘端的双链dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml这里Ｎo是阿佛伽德罗常数，Ｍ是ＤＮＡ的摩尔浓度（单位：mol/L)。
理论上，当j=i时，给定ＤＮＡ分子的一个末端与同一分子的另一末端，以及与不同分子的末端相接触的可能性相等。
因而在这样的条件下，在反应的初始阶段中，环状分子与多联体分子的生成速率相等。
而当j>i时，有利于重新环化；当i>j，则有利于产生多联体。
图 1.9显示了ＤＮＡ区段的大小与连接反应混合物中j:i之比分别为0.5、1、2和5时所需ＤＮＡ浓度之间关系（Ｄugaiczyk等，1985）。
现在考虑如下的连接反应混合物：其中除线状质粒之外，还含有带匹配末端的外源ＤＮＡ片段。
对于一个给定的连接混合物而言，产生单体环状重组的效率不仅受反应中末端的绝对浓度影响，而且还受质粒和外源ＤＮＡ末端的相对浓度的影响。
当i是j的２－３倍（即末端的绝对浓度足以满足分子间连接的要求，而又不致引起大量寡聚体分子的形成时）外源ＤＮＡ末端浓度的２倍时，有效重组体的产量可达到最大。
这些条什下，连接反应终产物的大约40％都是由单体质粒与外源ＤＮＡ所形成的嵌合体。
当连接混合物中线瘃质粒的量恒定（j:i=3）而带匹配末端的外源ＤＮＡ的量递增时，这种嵌合体在连接反应之末的理论产量。
涉及带粘端的线状磷酸化质粒ＤＮＡ的连接反应应包含：１）足量的载体ＤＮＡ，以满足j:i>1和j:i<3。
对一个职pUC18一般大小的质粒，这意味着连接反应中应含有载体ＤＮＡ为20-60μg/ml。
２）未端浓度等于或稍高于载体ＤＮＡ的外源ＤＮＡ，如外源ＤＮＡ浓度比载体低得多，在效连接产物的数量会很低，这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。
这种情况下，可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。
如用磷酸酶处理线状质粒ＤＮＡ或发迹策略以便通过定向的方法构建重组质粒。
(二）粘端连接１）用适当的限制酶消化质粒和外源ＤＮＡ。
如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒ＤＮＡ。
通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化ＤＮＡ，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。
２）按如下所述设立连接反应混合物：a．将0.1μl载体ＤＮＡ转移到无菌微量中，加等摩尔量的外源ＤＮＡ。
b．加水至7.5μl，于45℃加温５分钟以使重新退炎的粘端解链，将混合物冷却到０℃。
c．加入：10xT4噬菌体ＤＮＡ连接酶缓冲液１μlＴ４噬菌体ＮＤＡ连接酶 0.1Weiss单位５mmol/L ATP 1μl于16℃温育１－４小时10xT4噬菌体ＤＮＡ连接酶缓冲液200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)50mmol/K MgCl250mmol/L二硫苏糖醇500μg/ml牛血清白蛋白（组分Ｖ.Sigma产品）（可用可不用）该缓训液应分装成小份，贮存于－20℃。
另外，再设立两个对照反应，其中含有（１）只有质粒载体；（２）只有外源ＤＮＡ片段。
如果外源ＤＮＡ量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒ＤＮＡ，并尽可能多加外源ＤＮＡ，同时保持连接反应体积不超过10μl。
可用至少３种不同方法来测定Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶的活性。
大多数制造厂商（除 New England Biolabs公司外）现在都用Weiss等，１1968)对该酶进行标化。
１个Weiss单位是指在37℃下20分钏内催化１mmol32P从焦磷酸根置换到[γ,β-32P]ATP所需酶时，１个Weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位（Modrich和 Lehman,1970)或者60个粘端单位（如Ｎew England Biolabs公司所定义）。
因此，0.015Ｗeiss单位。