GUS荧光定量分析方法
GUS报告基因
报告基因●定义报告基因 (reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。
把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。
特征作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。
●应用在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因有以下几种：胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基因(ocs)、新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、庆大霉素转移酶基因、葡萄糖苷酶基因、荧光酶基因等。
nos、ocs这两个基因是致瘤土壤农杆菌(Agrobacterium tumfaciens)的Ti质粒特有的，对Ti质粒进行改造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光即可。
nptⅡ、cat及庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因，相关的酶可以对底物进行修饰(磷酸化、乙酰化等)，从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。
目前常用的一种报告基因是β-D-葡萄糖苷酶基因，该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测。
荧光酶基因(luc)是1985年从北美荧火虫和叩头虫cDNA 文库中克隆出来的，该酶在有ATP、Mg2＋、O2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用转基因植物整株或部分直接用X-光片或专门仪器进行检测。
GUS活性检测实际操作步骤
2.6 GUS瞬时表达2.6.1GUS组织化学染色底物X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indoly glucuronide)在GUS活性作用下水解产生无色的吲哚衍生物，此无色衍生物发生氧化二聚作用形成一种蓝色的不溶性的5,5’-二溴-4,4’-二氯靛蓝染料，使表达GUS的细胞被染成蓝色。
通过肉眼或者显微镜可明显观察到染色情况，并由此检测GUS的表达情况。
将除菌后的材料转移至微量离心管中，加适量的X-Gluc工作液，置于37 ℃黑暗条件下12 h，观察蓝色斑点的形成情况。
于显微镜下观察染色情况并拍照。
2.6.2实验统计和分析均匀取少量待检测的材料于200 μL的离心管中，每次取10 管，以每管中的蓝色比率进行计算，根据观察可分为四个计数基数分别为0、1/3、2/3、1，求平均值。
2.7 荧光分光光度法测定GUS活性原理：以4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide）简写为（4-MUG）为底物，Gus催化其水解为4-甲基伞形酮（4-MU）（4-methylumbelliferone）及β-D葡萄糖醛酸。
4-MU分子中的羟基解离后被365nm的光激发，产生455nm的荧光，可用荧光分光光度计定量。
2.7.1药品试剂：（1）GUS提取缓冲液（100mL）：50mmol/L 磷酸钠缓冲液（pH 7.0）：96 mL10mmol/L β-巯基乙醇：100 uL0.5mol/L EDTA（pH 8.0）： 2 mL0.1%（V/V）Triton X-100：100 uL10% Sarcosyl (十二烷基肌氨酸钠) ：0.1g（溶于上述溶液中）ddH2O up to 100mL①50mmol/L 磷酸钠缓冲液(PBS)（pH 7.0）：(定容至500 mL)NaH2PO4·2H2O ：1.5215 gNa2HPO4·12H2O ：5.462 g②0.5mol/L EDTA（pH 8.0）：在800 mL水中加入186.1 g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2·2H2O）,在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶解至pH值至约8.0（约需20 g NaOH颗粒），然后定容到1 L。
GUS酶活检测方法
荧光光度计定量分析转化植株GUS基因稳定表达活性试剂准备：1.GUS提取缓冲液：50mmol 磷酸钠(PH7.0)10mmol EDTAO.1% Triton X-1000.1% Sarcosyl10mmol/l β-巯基乙醇2.1mmol/1 4-MU(4-甲基伞形酮)：称取19．82mg4-MU钠盐，用1ml乙醇溶解，dH2O定容至100ml。
4℃暗处可以贮存一个月。
贮存中有可能发生结晶。
3.反应缓冲液：GUS提取缓冲液中加入1mmol/l MUG（100ml 加入35.23mg），4℃可以保存2周。
4.考马新亮旒G250溶液：lOOmg考马斯亮蓝G250溶于50m1 95％乙醇中，加lOOml磷酸，dH2O定容至1L过滤后于4℃贮存。
操作步骤：新鲜的植物组织6US蛋白的提取：1．取0.1g叶片样品，用液氮研磨成粉。
2．加入3倍体积的提取缓冲液，研成匀浆。
3．4000rpm离心lOmin，收集上清液，于-20℃冰箱中保存备用。
GUS蛋白提取液蛋白含量测定：1.制作标准曲线：BSA母液（ml）H2O（ml）BSA浓度（ug/ml）0.25 4.75 1.250.5 4.5 2.51.0 4.0 5.01.5 3.5 7.52.03.0 10.02.5 2.5 12.55.0 0.0 25.0配制25ug／ml BSA母液：称取2.5mgBSA，加入0.5ml提取缓冲液，用H2O定容至lOOml。
按上表制作BSA梯度液。
从中取4ml加入lml考马斯亮蓝G-250溶液，混匀，室温下放置2min，测定595nm 的吸收值。
吸收值对蛋白浓度作图绘制标准曲线。
取植物材料GUS蛋白提取液20ul，加H2O至4ml，加入lml考马斯亮蓝，混匀，室温下放置2min。
测定595nm光吸收值根据标准曲线计算蛋白质含量。
GUS酶活反应：1. 将反应缓冲液于37℃预热。
2．取6支1.5ml离心管，各加入900ul反应终止液，编号。
实验五、GUS染色检测基因瞬时表达
问题解决能力
实验态度转变
在实验过程中遇到问题时，我学会了独立 思考和团队协作，积极寻找解决方案。
通过认真对待每一个细节，ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ培养了严谨 的实验态度和科学精神。
gus染色检测基因瞬时表达的未来发展方向
应用拓展
除了基础研究，gus染色检测基因瞬时表 达在医学诊断和治疗等领域也有广阔的应
用前景。
A 技术优化
01
02
03
研究基因功能
通过瞬时表达技术可以快 速检测特定基因的功能， 了解其在细胞中的作用。
药物筛选
利用瞬时表达技术筛选对 特定基因有调控作用的候 选药物。
基因治疗
瞬时表达技术可用于基因 治疗的研究，为疾病治疗 提供新思路。
02 实验原理
gus染色检测基因瞬时表达的生物学基础
基因瞬时表达
基因瞬时表达是指通过转录和翻译在 短时间内产生大量蛋白质的过程。在 植物和某些微生物中，瞬时表达常用 于研究基因的功能和表达调控。
学习gus染色检测基因瞬时表达的方法
准备实验材料
X-Gluc、缓冲液、DNA转染试 剂、细胞培养板等。
GUS染色
将转染后的细胞用X-Gluc染色 ，观察蓝色产物。
转染DNA
将目的DNA与转染试剂混合， 加入细胞培养板中，使DNA瞬 时表达。
结果分析
根据蓝色产物的多少判断GUS 基因的瞬时表达量。
掌握gus染色检测基因瞬时表达的应用
显色反应
在适宜的温度和pH条件下，GUS酶 催化底物水解，产生蓝色产物。
结果观察
通过观察蓝色产物的生成情况，判断 目的基因是否成功瞬时表达。
03 实验步骤
准备实验材料和试剂
准备所需的gus基因瞬时表 达载体。
烟草转基因及gus染色的方法
转基因烟草的方法 1.接种单菌落于加有KAN,RIF和STR的3ML液体YEB培养基中，28度培养2天，转接与20ML YEB液体培养基中，28度继续培养至OD600=0.6-0.8。
2.菌液经4000RPM离心10分钟，倒掉上清液，用MS液体培养基重悬菌体，调OD600=0.6-0.8 3.取无菌烟草叶片，去除边缘，主叶脉，剪成大小约1CM*1CM的小块，浸泡在菌体悬浮液中，2-3分钟，期间不断轻轻摇晃。
4.取出叶片，用灭菌滤纸吸取表面菌液，将叶片至于共培养培养基上（MS+6-BA 1MG/L,NAA 0.1MG/L）28度黑暗共培养2-3天。
5.将共培养后的叶片在无菌水和加入羧苄青霉素的无菌水中清洗一遍，灭菌滤纸吸取多余水分，然后转到分化选择培养基上（MS+6-BA 1MG/L,NAA 0.1MG/L，潮霉素10-60MG/L,CARB 500MG/L）25度光照培养，每两周更换一次培养基，直至分化出愈伤组织，进而分化出不定芽。
6.将长至2CM以上的不定芽切下并转移到生根培养基上（1/2MS+NAA 0.1MG/L，潮霉素20-100MG/L,CARB 500MG/L）诱导生根。
7.将一次生根的再生苗切取根尖，接种到新的生根培养基上，诱导生根，不能生根的芽丢掉。
叶盘法转基因烟草技术一．实验目的：学习并了解叶盘法转基因烟草的技术流程。
二. 实验原理：土壤中的农杆菌是一种革兰氏阴性菌，能够感染植物的受伤部位。
农杆菌中有一种环形的Ti质粒，Ti质粒最重要的两个区域为T-DNA区和毒性区，T-DNA是Ti质粒上唯一能够整合到植物染色体上的序列，而毒性区上一系列则帮助T-DNA区整合到植物的染色体上。
土壤农杆菌转化植物的常用方法是叶盘法。
这种转基因方法十分简单，一般是将植物的叶片切成小圆片，用农杆菌感染后共培养2-4天，而后转移到加有选择压的分化培养基上分化出芽，在MS培养基上生根后，再生出完整的植株。
实验转基因生物的GUS检测
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gus基因简介
• gus基因是目前常用的一种报告基因，是β－D－ 葡 萄糖苷酸酶(gus)基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶
(GUS)能催化裂解一系列的β－葡萄糖苷酸 ，它可以 将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X－Gluc） 分解为蓝色的物质,也可以将4-甲基-伞形花酮-β-D葡萄糖苷酯(4-MUG)分解为蓝色物质。 其检测方法简 单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。
• gus基因的最大优点是它能测定外源基因表达的具体
细胞和组织部位，这是其它报告基因所不能及的。
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药品配方
• 1）X－Gluc母液：X-Gluc，用N-N-二甲基酰胺 (DMF)配成20mM的贮存液，分装成每管100µL，保 存于-20℃。
• 2）X－Gluc基液（50mM PBS， pH7.0）。 • 配制方法：50mM NaH2PO4·0.78g/100ml；50mM
• 37℃培养箱中温育1小时至过夜； • 将浸染过的试材转入70%或95%乙醇中脱
色2-3次（除去叶绿素），至阴性对照材料 呈白色为止。 • 观察结果。
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材料： 转化的植物组织、器官、原生质体、 种子的胚及萌发的幼苗等。 非转化的相同材料（阴性对照）。
试剂： 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯 （X－Gluc） ；N-N-二甲基甲酰胺(DMF) ； NaH2PO4； Na2HPO4 ； Na2EDTA ；Triton100； K3 [Fe(CN) 6] （铁氰化钾）；K4 [Fe(CN) 6] （亚铁氰化钾）
protein)等.
GUS活性的定量检测
GUS活性的定量检测目的：定量检测转基因植株中报告基因GUS的表达水平用途：比较某个启动子在不同组织中的表达强度，比较不同启动子在同一组织中的表达强度。
试剂：①磷酸缓冲液母液：0.2M Na2HPO4：71.64g/L Na2HPO4·12H2O0.2M NaH2PO4：31.21g/L NaH2PO4·2H2O②GUS抽提液（1L）：PH=7.00.2M Na2HPO4152.5mL0.2M NaH2PO497.5mL14.3M β-ME 700uLNa2-EDTA·2H2O 3.72gTriton-X 100 1mL③10mM 4-MUG（10×）：105.6mg 4-MUG溶于30mL GUS抽提液中，4℃避光保存。
（注意：存放时间越久本底信号越强，尽量现配现用）。
④0.2M Na2CO3反应终止液（1L）：21.2g Na2CO3溶于1000mL ddH2O。
⑤BSA母液（4ug/ul）：40mgBSA溶于10mL ddH2O⑥4-MU母液（10mM）：17.6mg 4-MU溶于10mL 0.2M Na2CO3中，4℃避光保存。
⑦Protein Assay Buffer（5×，Bio-Rad cat.no.500-0006）：使用前要用ddH2O稀释成1×工作液仪器及用品：酶标仪TECAN Infinite M200酶标板（Nunclon 96 Flat Transparent和Greiner 96 Flat Black）操作步骤与注意事项：1.材料于液氮中研磨成粉末，取适量粉末加入3倍体积的GUS抽提液，充分混匀，置冰上。
（注意，尽量保证每个样品所取的粉末量都比较一致，这样抽提出来的总蛋白浓度比较接近，方便后续操作。
）2.10000g 4℃离心10min，上清液转移到新的1.5mL离心管，则得到总蛋白粗提液（可于4度短期保存或于-70℃长期保存；但不要存于-20℃，该温度下GUS不稳定）。
荧光光度计定量分析转化植株GUS基因稳定表达活性
荧光光度计定量分析转化植株GUS基因稳定表达活性一、试剂准备：1.GUS提取缓冲液：●50mmol 磷酸钠(PH7.0)●10mmol EDTA●0.1% Triton X-100●0.1% Sarcosyl●10mmol/l β-巯基乙醇2.1mmol/L 4-MU(4-甲基伞形酮)：称取19．82mg4-MU钠盐，用1ml乙醇溶解，dH2O定容至100ml。
4℃暗处可以贮存一个月。
贮存中有可能发生结晶。
3.反应缓冲液：GUS提取缓冲液中加入1mmol/l MUG（100ml 加入35.23mg），4℃可以保存2周。
4.考马新亮旒G250溶液：lOOmg考马斯亮蓝G250溶于50m1 95％乙醇中，加lOOml磷酸，dH2O定容至1L过滤后于4℃贮存。
二、操作步骤：新鲜的植物组织6US蛋白的提取：A.取0.1g叶片样品，用液氮研磨成粉。
B.2．加入3倍体积的提取缓冲液，研成匀浆。
C.3．4000rpm离心lOmin，收集上清液，于-20℃冰箱中保存备用。
GUS蛋白提取液蛋白含量测定：1.制作标准曲线：BSA母液（ml）H2O（ml）BSA浓度（ug/ml）0.25 4.75 1.250.5 4.5 2.51.0 4.0 5.01.5 3.5 7.52.03.0 10.02.5 2.5 12.55.0 0.0 25.0配制25ug／ml BSA母液：称取2.5mgBSA，加入0.5ml提取缓冲液，用H2O定容至lOOml。
按上表制作BSA梯度液。
从中取4ml加入lml考马斯亮蓝G-250溶液，混匀，室温下放置2min，测定595nm 的吸收值。
吸收值对蛋白浓度作图绘制标准曲线。
取植物材料GUS蛋白提取液20ul，加H2O至4ml，加入lml考马斯亮蓝，混匀，室温下放置2min。
测定595nm光吸收值根据标准曲线计算蛋白质含量。
GUS酶活反应：1. 将反应缓冲液于37℃预热。
2．取6支1.5ml离心管，各加入900ul反应终止液，编号。
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GUS荧光定量分析方法
一、GUS 粗蛋白的提取
1、取拟南芥组织100mg，用液氮研磨成粉。
2、加入1ml的GUS提取液（pmsf<蛋白抑制剂>），剧烈震荡。
3、12000rpm离心10分钟，收集上清液，得到GUS粗酶提取液。
二、考马斯亮蓝法测定总蛋白含量
按上表加入不同量的BSA标准蛋白溶液，测定OD595的吸光值，并得出曲线方程。
2、样品总蛋白的测定
自定合适的比例的稀释GUS蛋白溶液，要求稀释后的待测样品颜色介于1中的0到6之间。
例如：稀释40倍，5ul样品+195ulGus提取液，取40ul +200ulG-250混匀，室温放置2分钟，测定OD595光吸收值，根据标准曲线计算蛋白含量。
三、GUS活性的测定
用终止液将MU储备液B按上表稀释成0-250nM,用荧光计在激发波长为350nm,发射波长455nm下测定他们的荧光强度做出一条标准曲线，并得出曲线方程。
2荧光定量
1）取两支Ep离心管，各加入1.8mL反应终止液，并编号.
2）在Ep管中加入200提取液，加入50uLGUS粗酶提取液，再加入250ul预热的反应液，混匀。
立即取出200ul加入到1号管中，此反应为0时的样品，荧光测定时以此为空白，并开始计时。
3）将反应管放入37摄氏度温箱中进行酶反应，60分钟后，取200ul反应液，加入到2号管中混匀，为反应60分钟时的样品，测定荧光值。
主要溶液的配制：
1、GUS提取缓冲液：
1)0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0）50mL:
0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0）：557mL0.1mol/LNa2HPO4+42.3mL1mol/L NaH2PO4定容到1000mL
(35.814gNaHPO4.12H2O(358.14)定容到1000mL;15.6g NaH2PO4.2H2O（156.01）定容到100Ml)
2) 0.5M Na2EDTA (pH8.0) 2.00mL:
9.31gEDTA加水剧烈搅拌，加入约1g NaOH, 定容到50 mL.
3) 30% 十二烷基肌氨酸钠0.33 mL：1.5g加水定容到50
4）10% Triton X-100 1 mL:
1 mL Triton X-100 加9 mL水混匀
5）β-巯基乙醇0.07-0.10 mL（马琳论文里面有）
6）甲醇 20ml（网上有的文献里有）
蒸馏水定容至100mL。
2、考马斯亮蓝溶液G-250的配制：
100mg考马斯亮蓝溶液G-250 溶于50 mL95%中，加100 mL85%磷酸，定容到1 mL，过滤后保存于4°C，最终试剂0.01%考马斯亮蓝溶液G-250,4.7%（w/v）乙醇,8.5%（w/v）磷酸.
3、标准蛋白溶液：
50mg牛血清白蛋白（BSA），溶于50 mL0.15M的氯化钠中。
配制成1 mg/mL的标准蛋白溶液。
4、0.15M的氯化钠溶液
0.876g氯化钠定容到100 mL
5、4-MU储备液A（4-MU 1 mM）：19.8mg4-MU溶于避光保存
4-MU储备液B（4-MU 1 μM）：10μL4-MU储备液A定容到10 mL
6、终止缓冲液（0.2M Na2CO3）
10.6g Na2CO3 溶于500 mL水。
7、GUS反应缓冲液：
25mg4-MUG溶于25 mL提取缓冲液中
1) 1mol/L Na2HPO4溶液：35.814g Na2HPO4溶于100ml水。
2) 1mol/L NaH2PO4 溶液：15.601g NaH2PO4 溶于100ml水。
3) 0.1M 磷酸缓冲液(PH7.0)：1mol/L Na2HPO4取5.77ml，1mol/L NaH2PO4取4.23ml，定容至100ml。
4) 10％SDS溶液：将90ml水稍微加热，加10g SDS，搅拌溶解，加入几滴浓盐酸调节PH至7.2，然后加水定容至100ml。
5) 0.5 M EDTA (PH8.0)：在80ml水中加入18.61g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调PH至8.0（约需2g左右的固体NaOH），溶解后定容至100ml。
6) GUS酶提取液：0.1M 磷酸缓冲液（PH7.0）取50ml；10% SDS取1ml；0.5M EDTA(PH8.0)取2ml；Triton X-100取100ul；β-巯基乙醇100ul；用水定容至100ml。
7) MUG底物：称8.8mg MUG，溶于10ml GUS酶提取液中，配制成2mmol/L的工作浓度。
8) 反应终止液（0.2 mol/L Na2CO3 ）：称2.12Na2CO3 ，用水定容到100ml。
9) 考马斯亮蓝G250溶液：考马斯亮蓝G250 10mg, 95%乙醇5m1, H3PO4 10ml，定容至l00ml，过滤后4℃保存。
10) １mg/ml BSA：20mg BSA，用GUS提取缓冲液定容至20ml。