【定量数据分析】荧光定量PCR_完整版
荧光定量PCR实验报告
荧光定量PCR实验报告摘要：荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种通过扩增和定量DNA的方法。
本实验的目的是利用荧光定量PCR技术，对给定的DNA样品进行定量检测，并比较不同浓度的模板DNA的扩增情况。
实验结果表明，荧光定量PCR是一种快速、准确、高灵敏度的定量PCR方法。
引言：荧光定量PCR技术是PCR技术的一种发展，并且在分子生物学中得到广泛应用。
它可以实时监测PCR扩增反应中DNA的扩增情况，因此被广泛用于基因表达检测、基因拷贝数检测、病原体检测等领域。
在这个实验中，我们将利用荧光定量PCR技术检测给定DNA样品的浓度并比较不同浓度的模板DNA的扩增情况。
材料与方法：1.实验材料：（1）实验电脑：配备实时荧光定量PCR软件的计算机。
（2）实验试剂：-PCR反应混合液：包含DNA模板、引物、荧光染料、酶等。
- 模板DNA：浓度为10 ng/μL的DNA样品。
-引物：用于扩增目标DNA的引物。
-荧光染料：用于实时检测PCR扩增过程中的DNA量。
（3）实验仪器：实时荧光定量PCR仪。
2.实验步骤：（1）制备PCR反应混合液，包括DNA模板、引物、荧光染料和酶。
（2）将PCR反应混合液分装到PCR试管中。
（3）将不同浓度的模板DNA分别加入PCR试管中。
（4）使用实时荧光定量PCR仪将PCR试管放入仪器中，进行PCR扩增反应。
（5）实时监测PCR扩增过程中的荧光信号，并记录荧光信号的变化。
结果与讨论：本实验中，我们选取了不同浓度的模板DNA样品并进行PCR扩增反应。
实时荧光定量PCR仪可以实时监测PCR反应中的荧光信号，并根据荧光信号的强度来定量PCR扩增产物的量。
实验结果显示，荧光信号随着PCR反应的进行逐渐增强，并且荧光信号的强度与模板DNA的浓度呈正相关关系。
通过测量荧光信号的强度，我们可以计算出不同浓度的模板DNA的扩增产物的量，进一步定量DNA样本的浓度。
荧光定量PCR实验原理及数据分析
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SYBR Green I 染料法－－优缺点 优 点
使用方便，不必设计 复杂探针 具有价格优势
缺 点
无模板特异性 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量 灵敏度相对较低
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Taqman 探针法－－原理
• • • •
17
SYBR Green I 染料法－－问题点与关键点
• 问题点：
– SYBR Green I 与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应 体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测， 从而可能导致检测结果不准确。
• 关键点：
– 设计合适引物，防止非特异性扩增！
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
22
Taqman 探针法－－工作机理
•
拷贝数的计算：
– 待测样本浓度（ng/ul）=OD260×40×稀释倍数 – 样本分子量=碱基数×324 – 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014
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绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量
• • 方法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测 标准品：质粒标准品浓度为106、105 、104 、 103；2个重复；设阴性 空白对照 • 实验步骤：提取HBV DNA；
病原体检测，疾病耐药基因研究, 药物疗效考核 遗传疾病的诊断 特定基因分析 SNP分析
分子信标
高特异性 荧光 背景低
荧光定量pcr结果分析
如果有标准曲线，按照标准曲线计算。
一般都是相对量。
则用delta delta CT方法来计算。
举例如下：
对照组基因A的CT值为20，内参（比如βactin)CT值15。
实验组基因A CT值18，内参CT值14。
首先算加样量：delta CT=15-14=1。
2的1次方是2。
也就是说实验组的加样量是对照组的2倍。
基因A: delta CT=20-18=2。
2的2次方是4。
也就是说基因A的量在实验组是对照组的4倍。
但是由于加样量是2倍，所以4处以2=2，最后的相对量是2倍。
几点注意：
1。
必须确定扩增的特异性
2。
只有相同目标的CT值才能相减（扩增效率有可能不同）
3。
2的某次方只是理论值，实际扩增效率低于2。
4。
最好不用Syber Green
由Ct值用2^-△△Ct法计算计算表达量差异的原理，可以看下面的图片：
附件的Excel文件是计算用的，感兴趣也可以看看由Ct值是如何一步一步算出2^-△△Ct的。
(完整版)荧光定量PCR简介
1.3 数学原理
Real time Q-PCR动力学曲线可以分成四个阶段：基线阶段 , 指 数增长期、线性增长期和平台期。
定量PCR的几个重要的参数：
基线→阈值→CT值→ [DNA]0 基线就是扩增曲线的水平部分。
1化.4.1学染原料理法化—学—原理染料法
SYBR Green I 是一种结合于DNA双链小沟的染料。游离时不 发光，与DNA结合时发光。每形成一个DNA双链，就有一定 数量的染料结合上去。所以荧光信号强度与DNA分子总数目成 正比。
1化.4.2学探原针法理化—学—原理探针法
TaqMan探针是一种寡核苷酸探针。每产生一条 DNA链，就切断一条探针，然后产生一个单位信 号，信号强度与结合探针的DNA分子数成正比。
• 3、其它。例如SNP检测，性别鉴定等。
5曲、Q线PC成R定弯量曲的的常见原问因题
5.1 扩增曲线弯曲
➢原因：样品浓度跨度太大，有的样品浓度太高，在同一基线 设置情况下，会导致Ct值太小（小于基线右侧）的样品的曲线 在右侧下跌。 ➢解决方案：对于能检测出Ct的样品，读出数据；浓度太高的 样品，需稀释后另做实验。
VS
StepOnePlus™ System
Life Tech-ViiA7
4.1 S两tep种On仪e P器lus及比V较iiA7对比
4.荧2 荧光光定定量量的的应用应用
• 1、DNA或RNA的定量分析。包括病原微生 物或病毒含量的检测，转基因动植物转基 因拷贝数的检测等。
• 2、基因表达差异分析。例如比较经过不同 处理样本之间特定基因的表达差异（如药 物处理、物理处理、化学处理等），特定 基因在不同时期的表达差异以及cDNA芯片 的确认。
qRT-PCR荧光定量数据分析（2-ΔΔCt法）
3.用公式2-ΔΔCt计算出实验组每个样品相对对照组的表达量。然后再求实验组的平均值。
4.在GraphpadPrism软件中作柱状图统计比较。Байду номын сангаас
计算对照组中ct的均值再用处理组的每一个ct减去刚刚计算的对照组的ct均值得到ct实验组相对对照的表达量
qRT-PCR荧光定量数据分析（2-ΔΔCt法）
1.基本概念
ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因
ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组
2.具体操作步骤
1.计算出每个样品目的基因相对内参基因的表达量ΔCt
荧光定量PCR实验报告
荧光定量PCR实验报告一、实验目的1、掌握荧光定量PCR技术2、学习如何制备PCR反应体系3、了解实时荧光PCR数据分析4、检测DNA含量二、实验原理荧光定量PCR技术是一种基于PCR扩增原理的DNA分析方法，可定量检测DNA的含量，广泛应用于生物学、医学等领域。
该技术主要依靠荧光标记物，结合荧光信号强度进行定量分析。
PCR反应过程中，引物与模板DNA结合后在酶的催化下形成新的DNA链，每个PCR循环会翻倍模板量。
PCR扩增的温度曲线显示，PCR反应初期呈指数上升阶段，后期呈平台期，最后呈线性上升期。
荧光定量PCR技术基于PCR反应的初期、指数上升阶段的振幅与CT值（Crossing Threshold，荧光信号的阈值值点）之间的关系，对样品中靶序列的含量进行定量分析。
三、实验步骤以10μL体积计算，将荧光定量PCR反应体系制备如下表：试剂名称一次浓度最终浓度10μL体积SYBR Green 1x 1x 1μLdNTPs 10mM 0.2mM 0.2μLMgCl2 25mM 3mM 0.3μLTaq DNA Polymerase 5u/μL 0.04u/μL 0.04μLForward Primer - 0.2μM 0.2μLReverse Primer - 0.2μM 0.2μLTemplate DNA - 1ng-100ng 1μLddH2O - - 7.24μL2、装载PCR板将PCR反应体系均匀装到PCR板中，按照如下步骤进行：① 每组实验会使用96孔PCR板；② 取出PCR板后，先用蒸馏水清洗；③ 按照实验设计，合理地将合适的试剂组合均匀装出到每个孔中；④ 采用专用移液器，能够准确的移液。
3、进行PCR扩增反应在PCR扩增反应期间，我们将执行以下操作：② 进行荧光定量PCR反应；③ 在PCR反应过程中，分别记录下样品的CT值和所测基因的拷贝数；4、数据分析① 利用荧光定量PCR仪进行CT值分析，记录下每个样品的CT值；② 利用以下公式，将CT值成功转化成所测基因的拷贝数：DNA含量（ng）=拷贝数 X DNA分子量/ 6.02 X 10^23;③ 分别计算出每个样品的DNA含量；④ 利用所得数据，绘制出荧光定量PCR的结果图，并进行结果的解释。
实时荧光定量PCR检测的数据处理及结果报告
定量测定测定的是量的“多”或“少”；定性测定则 是测定某种物质的“有”或“无”，用于未知病人的 确认诊断。 定量测定结果报告：根据所使用的测定方法的测定范 围报告结果，如样本测定结果高出此范围，则可报告 >多少，也可对样本稀释后再检测；如低于此范围， 则报告<多少，如<103拷贝数/ml，而不能报告为0拷 贝数/ml或阴性。 定性测定结果报告:报告“阳性”或“阴性”, “检出” 或“未检出”, “反应”或“未反应”
为什么要做定量测定？
定性和定量测定结果报告上的混淆。
为什么要做定量测定？
用于已知病毒感染患者抗病毒治疗效果 的动态观察及抗病毒药物的临床研究； 用于基因表达方面的研究，如特定的 mRNA的定量测定。
为什么要做定性测定？
用于未知患者的确认 用于血液筛检 突变检测
定量和定性测定的结果报告
纵坐标为Ct值横坐标为起始拷贝 数时的数学模型
此种计算模式下，斜率 A必≤-3.32。 截距B则为原始模板趋 向于0亦阴性标本检测的 Ct 值，因此，一个实时 荧光PCR，如果设定的 扩增循环数为40，则其 截距B即应≥40。
日常扩增的实时荧光曲线所蕴含 的信息
定量和定性PCR测定的临床应用及 应注意的问题
基本概念
扩增效率E（amplification efficiency） 扩增 效率指的是一个循环后的产物增加量与这个循 环的模板量的比值，其值位于0到1之间。在 PCR的前20或30个循环中，E值比较恒定，为 指数扩增期，随后E值逐步降低，直至0，此时 PCR达到平台期，不再扩增。扩增效率的计算 可以采用系列稀释法，将稀释后浓度的对数值 与所得Ct值做图，在一定范围内应该是得到一 条直线，利用公式（1）：E=10-1/K-1（K为该 直线斜率）即可计算出E值。
荧光定量PCR技术原理方法数据分析详述.ppt
RNA提取常用方法---裂解方式
异硫氰酸胍/苯酚法 ➢在变性剂异硫氰酸胍的作用下，细胞被裂解，同时核蛋白 体上的蛋白变性，核酸释放； ➢释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而 分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离； ➢有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。
胍盐 /β-巯基乙醇 ➢盐酸胍裂解样本 ，抑制 RNase 的活性 ； ➢β-巯基乙醇变性蛋白
土壤/粪便微生物基因组DNA提取
其他品牌试剂盒存在缺点： ➢采用玻璃珠或钢珠破碎，导致基因组断裂严重； ➢必须购买破碎专用设备，增加使用成本； ➢采用包括玻璃奶、离心吸附柱串联的纯化方式，导致 DNA大量损失，得率很低，很难真实反映土壤微生物的多 样性。 BioTeke的技术创新： ➢采用酶法破碎，保证基因组的完整性； ➢用异丙醇沉淀DNA，DNA无损失。
Thermo M-MLV反转录酶
➢高效的逆转录活性，且无RNaseH活性 ➢适合合成长片段的cDNA,有很强的模板兼 容性，对高GC含量（75%以上）和结构复 杂的模板效果显著 ➢在42℃-60℃具有较好的热稳定性。
One step RT-PCR
模板：
使用BioTeke公司的RNApure 总RNA提取试剂盒提取的鸡肝脏组织
➢化学方法
CTAB法：适用于植物材料等。是一种阳离子去污剂，溶 解细胞膜，与核酸结合。在高盐下溶解释放DNA。
SDS法：适用于血液，细胞，动物组织，细菌，酵母等
➢ 物理方法
机械剪切，超声波破碎，研磨匀浆等。易造成DNA断裂。
➢ 酶法
蛋白酶K
BioTeke基因组DNA提取系列试剂盒综合利用上述方法
➢结果：
1 234
图：小鼠肝脏组织RNA
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..................... 除以上技术外，欢迎大家点播！
以上讲座的具体时间详见论坛通知! 螺旋网：http://www.helixnet.cn 祝大家新年快乐，万事如意!
螺旋课堂第一课－－荧光定量PCR技术 Janson PCR技术的发明极大地推动了分子生物学的发展，而且迅速被推广和应用到生命科学的各个领域，可以说它是目前核酸分子水平的基础及应用研究中使用最广泛的一项技术。 常规PCR中，在扩增反应结束之后，我们一般通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，无法对PCR扩增反应进行实时检测，也无法对起始模板准确定量，而很多情况下，我们所感兴趣的是起始模板量，如转基因动植物中插入某种外源基因的拷贝数或者病人中某种病毒DNA/RNA的精确copy数等，如此，荧光定量PCR技术便应运而生。 本文将分为三大部分向大家介绍，首先是理论篇：首先了解荧光定量PCR的理论知识，如荧光定量PCR技术的原理、方法等；随后为实践篇：如实验的操作流程、注意事项、方法选择、结果分析与处理等；第三部分为问题分析与解答篇：荧光定量PCR过程中有哪些常见问题，我们如何避免和解决。 08年第一期螺旋课堂--“荧光定量PCR技术” 第一章 理论篇 一、荧光定量PCR技术发展史
用了PCR反应中的品进行准确定量的目，一些非特异的PCR而导致定量不准确等术。 1995年美国PE公司成功研制了TaqMan技术，1996年又推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，并使用Ct值进行分析，荧光定量PCR才很快得到大家的接受，并广为应用。 近年来，荧光定量PCR技术不断完善，取得了突飞猛进的发展。由于其具有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等优点，而被广泛应用于基础科学研究、药物研发、临床诊断、转基因研究、基因检测等各个领域研究当中。
二、荧光定量PCR概述 1、荧光定量PCR概念 所谓定量PCR技术（real-time PCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法（图1）。 图1 荧光定量PCR反应原理
荧光基团
荧光检测元件Ct值
螺旋网：http://www.helixnet.cn 祝大家新年快乐，万事如意! 08年第一期螺旋课堂--“荧光定量PCR技术” 2、荧光定量PCR与普通PCR的主要区别
图2 终点法定量PCR的缺陷
理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是96次PCR重复实验，各种条件基本一致，所得结果有很大差异（图2）。 常规PCR的定量方法，测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系（图2），所以不能根据最终PCR产物的量直接计算出起始DNA拷贝数。虽然加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。 而从图2也可以看出，虽然相同模版在同一台PCR仪上进行96次扩增，终点处检测产物量不恒定，但96次PCR扩增曲线都有一个共同的拐点，即荧光定量PCR中Ct值的重现性，恒定的Ct值为荧光定量PCR的分析提供了理
螺旋网：http://www.helixnet.cn 祝大家新年快乐，万事如意! 08年第一期螺旋课堂--“荧光定量PCR技术” 论依据。 前面我们对荧光定量PCR的历史、荧光定量PCR概念和与常规PCR区别有了大致的了解，但你可能心中存在许多疑惑：什么是扩增曲线？什么是Ct值？它们有什么特点？我们如何来判定荧光定量PCR反应中的Ct值，原理是什么？。。。。。。 为了使大家更好的理解、掌握荧光定量PCR技术，在介绍荧光定量PCR检测方法、动力学原理和数据分析方法前，有必要先介绍几个最基本的概念。 3、荧光定量PCR的几个基本概念 3．1扩增曲线 增曲线来进行说明。际上并不是一条标准示PCR循环数，Y－例关系。 图3荧光定量PCR扩增曲线示意图
荧光阈值 从图3可以很直观的看出，荧光定量PCR扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期），荧光信号指数扩增阶段（对数期）和平台期。在基线期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。 3．2荧光阈值
螺旋网：http://www.helixnet.cn 祝大家新年快乐，万事如意! 08年第一期螺旋课堂--“荧光定量PCR技术” 在介绍荧光阈值之前，先了解一下荧光本底信号（图3），我们一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline，基线期），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍（机器自动设置）。我们在做荧光定量PCR实验时，经常采用手动设置，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号是荧光信号超过域值（图4）。 图4 手工调整荧光阈值示意图
3．3 Ct值 了解了荧光阈值的概念后，Ct值就很好理解了。C代表Cycle，t代表threshold，所谓Ct值就是在荧光PCR扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。如图3所示，黑色的线显示的是荧光阈值，当信号超过黑色线时所经历的循环数即为Ct值。从这也可以了解到Ct值是可以变化的，我们实验时带有一定的人为因素。而荧光定量PCR后面的数据处理要用到Ct值来计算，所以有关荧光阈值的设置就显得尤为重要。一般说来，新手按荧光PCR仪的自动设置为好，而如果你非常有经验，一般会手动设置荧光阈值。因为Ct值即达到荧光阈值所经过的循环数，所以它就与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，经过的循环数就越少，Ct值也就越小，反之亦然。正常的CT值范围在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。 前面也提到过，同一模板经过96次PCR扩增，扩增产物虽然不恒定，但Ct值极具重现性。根据这个特点，我们可以利用已知起始拷贝数的标准样品的Ct值做出标准曲线，只要在同一次PCR实验中得到未知样品的Ct值，就可以根据曲线算出该未知样品的起始拷贝数。 接下来我们就来看看通过Ct值算出拷贝数的数学原理是怎样的： 首先我们来回顾一下PCR扩增原理（图5），从PCR原理图中我们也可以很清
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