改良的苯酚_硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究
实验一、硫酸苯酚法测多糖含量
实验一硫酸－苯酚法测多糖含量1．目的要求测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量2．方法原理糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。
3．主要实验仪器及材料浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。
４．掌握要点硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。
５．试剂配制1）葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg，蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。
2）90%苯酚液的配制准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避光保存3）6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。
6.实验步骤表1 标准曲线的制作步骤管号0 1 2 3 4 5 6 7葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0苯酚液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5浓硫酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。
以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。
用exceL软件求得回归方程2）待测样品多糖的测定与计算将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。
改良的苯酚硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究
改良的苯酚硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究一、本文概述多糖和寡糖作为生命体系中的重要组成部分，广泛存在于各类生物体内，具有多种生物学功能，如能量储存、细胞识别、信号传导等。
因此，准确测定多糖和寡糖的含量对于理解其生物学作用以及评估其在食品、医药等领域的应用价值具有重要意义。
传统的苯酚硫酸法是一种常用的多糖和寡糖含量测定方法，但由于其存在的一些局限性，如灵敏度低、抗干扰能力差等，使得该方法在实际应用中受到一定的限制。
因此，本文旨在研究改良的苯酚硫酸法，以提高其测定多糖和寡糖含量的准确性和稳定性，为多糖和寡糖的研究和应用提供更为可靠的分析方法。
本文首先将对传统的苯酚硫酸法进行详细的介绍和分析，阐述其原理、操作步骤以及存在的问题。
在此基础上，本文将详细介绍改良的苯酚硫酸法的具体实施方案，包括试剂的选择、反应条件的优化、干扰物质的排除等方面。
随后，本文将通过一系列的实验验证改良后的方法的可行性和准确性，包括标准曲线的绘制、精密度和稳定性的考察、实际样品的测定等。
本文将对改良的苯酚硫酸法的应用前景进行展望，探讨其在多糖和寡糖研究以及相关领域的应用价值。
通过本文的研究，期望能够为多糖和寡糖含量的准确测定提供一种更为可靠的分析方法，为相关领域的研究和应用提供有益的参考。
二、材料与方法本实验所使用的主要试剂包括苯酚、硫酸、多糖标准品（如葡萄糖、果糖等）以及待测的多糖和寡糖样品。
所有试剂均为分析纯，购自国内知名试剂供应商。
实验所需设备包括电子天平、水浴锅、分光光度计、离心机等。
苯酚硫酸法是一种基于多糖和寡糖在浓硫酸作用下与苯酚发生显色反应的原理来测定其含量的方法。
在酸性条件下，多糖和寡糖会被硫酸水解成单糖，随后与苯酚发生缩合反应，生成有色化合物，其颜色深浅与多糖和寡糖的含量成正比。
（1）标准曲线的绘制：准确称取适量多糖标准品，用蒸馏水配制成不同浓度的标准溶液。
分别取各浓度标准溶液与苯酚硫酸试剂混合，于沸水浴中加热一定时间后冷却，用分光光度计测定各溶液在特定波长下的吸光度。
改良苯酚_硫酸法测定苦瓜多糖含量(1)
简单 # 容易实施的苦瓜多糖测定方法 ! 便于苦瓜种 植基地和加工企业控制 # 检测苦瓜原料的质量 ! 进 而控制和确保苦瓜制品的质量" 通常采用苯酚!硫酸法测定多糖含量! 用标准葡 萄糖绘制标准曲线并计算多糖含量 " 但是 ! 苦瓜多 糖是一种由甘露糖 # 半乳糖等组成的杂多糖 ! 且多 糖中各种单糖的组成与品种有关 " 由于不同单糖与 苯酚!硫酸试剂的显色情况不同! 不同单糖标准曲线 的斜率不同 ! 因此单纯用葡萄糖做标准计算苦瓜多 糖含量必然会存在一定的误差 " 本文针对这一问题 进行研究! 得到苯酚%硫酸法测定苦瓜多糖含量的改 进方法" & 原料! 仪器与试剂 苦瓜$ 扬中绿健天然制品有限公司% ’% 葡萄糖 # 苯酚 # 浓硫酸 # 三氯乙酸 # 氯仿 # 正丁醇$ 国产分析纯% 旋转蒸发器 $ 上海精科实业有限公司 % ()*+ 紫 外%可见分光系统$ 美国,-./-0公司% -123456789!’ 型气相色谱仪$ 美国 -123456公司 % -:;<-=%7冷冻干 燥机 $ 德国 (<./>? 公司 % -@)562 A =B 高速冷冻离心 机$ 美国CD(EF-0公司% :’B%=-离心机$ 北京医用 离心机厂 % G,%=#HI 紫外可见分光光度计 $ 尤尼科 J上海K仪器有限公司% 透析袋J截留分子量LBII’)M$ 德 国进口分装" = 试验步骤 苯酚 % 硫酸法是测定多糖的常用方法 ! 该测
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操作时 ! 所用滤纸型号 " 大小一定 ! 而且滤过
苯酚-硫酸比色法测定多糖含量
苯酚-硫酸比色法测定多糖含量
苯酚-硫酸法是常用的多糖含量测定方法之一。
该方法基于多糖在硫酸的作用下，与苯酚产生颜色反应的原理，利用光度计测定反应产物的吸收值，从而计算出多糖的含量。
步骤如下：
1. 取样品0.1g，在50ml锥形瓶中加入5ml去离子水，振荡
20min溶解。
2. 加入2ml 5%苯酚水溶液，振荡均匀。
3. 加入5ml浓硫酸，使用磁力搅拌器搅拌1-2min。
4. 将混合物放置在冷水中冷却10min。
5. 用紫外分光光度计在490nm处测定吸光度A，同时以含有相同试验液体积的去离子水为对照。
6. 计算样品中多糖含量。
该方法测定简便，精度高，适用于多糖含量较高的样品。
但此法不能区分多糖的种类及其组成，不能应用于含非多糖的样品中。
硫酸苯酚法测多糖原理
硫酸苯酚法测多糖原理
硫酸苯酚法测多糖是一种常用的多糖测定方法，其原理基于多糖与硫酸苯酚反应产生显色化合物的特性。
在测定中，首先将待测样品中的多糖加入到试管中。
然后，向试管中逐渐加入浓硫酸，并快速而彻底地混合。
硫酸的加入会引发多糖与硫酸之间的酸水解反应，生成大量的醛基。
随后，加入苯酚试剂，苯酚与醛基反应生成的有色化合物会根据多糖的种类和含量而呈现出不同的颜色。
颜色的深浅可以通过分光光度计进行测量，从而得到多糖样品中多糖含量的定量结果。
该方法的优点是简单、快速，且对多糖具有较好的选择性。
然而，需要注意的是，在进行测定时应严格控制硫酸和苯酚试剂的加入量和混合程度，以避免反应过程中的误差产生。
总结起来，硫酸苯酚法是一种常用的测定多糖含量的方法，通过多糖与硫酸和苯酚的反应生成有色化合物来实现多糖的测量。
苯酚_硫酸比色法测定多糖含量
随着对生物药物、天然药物和保健食品研究的深入，多糖的研究进展很快。
目前多糖含量的测定方法尚无统一标准，广泛应用的是苯酚－硫酸比色法。
该法具有简单、快速、无需多糖纯品和贵重仪器等优点，且对水溶性样品和非水溶性样品均可测定。
１ 苯酚－硫酸比色法原理苯酚－硫酸比色法测定多糖含量是由Ｄｕｂｏｉｓ等［１，２］提出的。
其原理是：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长４９０ｎｍ处和一定浓度范围内，其吸光度Ａ值与糖浓度Ｃ呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。
２ 实验方法２．１ 标准溶液的配制精密称取１０５℃下干燥至恒重的葡萄糖约１００．０ｍｇ，置１００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。
２．２ 供试品贮备液的配制将样品进行适当处理（如真空干燥、回流提取等，根据各品种不同而有差异），取适量，按一定比例稀释，配制供试品贮备液。
２．３ 苯酚溶液的配制称取苯酚１００ｇ，加铝片０．１ｇ和碳酸氢钠０．０５ｇ，常压蒸馏，收集（１８０±２）℃馏分。
精密称取该馏分约１０．０ｇ置于２００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀后转置于棕色试剂瓶中，即得苯酚溶液，将其置于冰箱中备用。
２．４ 测定条件选择２．４．１ 反应温度选择 精密吸取供试品贮备液、葡萄糖标准液各１．０ｍＬ于１００ｍＬ量瓶中，用水稀释至刻度，分别作为供试品溶液和对照品溶液。
分别吸取供试品溶液１．０ｍＬ于两个具塞试管中，各加苯酚液１．０ｍＬ，并分别迅速滴加浓硫酸５．０ｍＬ。
一份于水浴中煮沸１５ｍｉｎ，另一份于４０℃水浴中恒温３０ｍｉｎ。
另取两份对照品溶液１．０ｍＬ同上操作。
取出，冷却至室温，１５ｍｉｎ后于４９０ｎｍ处测其Ａ值，选取Ａ较高的作为实验温度。
２．４．２ 苯酚及硫酸用量选择 分别吸取供试品液和对照品液１．０ｍＬ５份，各加入苯酚液０．２，０．４，０．６，０．８，１．０ｍＬ，加水至２．０ｍＬ，再各滴加浓硫酸５．０ｍＬ，４０℃恒温３０ｍｉｎ后，测其Ａ值，从苯酚液加入量达到某一值开始，Ａ值基本保持不变，说明苯酚液量达到该值以上时，反应都能完成。
苯酚-硫酸法快速测定多糖方法的优化
1.2.3 单因素试验设计以100μg/mL 葡萄糖标准溶液200μL 为研究对象，酶标仪检测波长为490nm 时的OD 值作为评价指标，分别考察苯酚用量(100、200、300、400、500μL)、浓硫酸用量(600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500μL)、反应温度(30、40、50、60、70、80、90、100℃)、反应时间(5、10、15、20、25、30、40、50、60min)等因素对OD 490nm 值的影响[6]。
1.2.4 正交优化试验在1.2.3单因素试验结果的基础上，选择苯酚用量(A)、浓硫酸用量(B)和反应温度(C)3个因素为自变量，以OD 490nm 值为评价指标，进行L9(33)正交试验，试验因素及水平见表1。
表1 正交试验因素水平表2200700803300800901.2.5 标准曲线制作以蒸馏水为空白，分别精密吸取浓度为0、20、40、60、80、100μg/mL 的葡萄糖标准品溶液各200μL 加入2mL 具塞塑料离心管中，在每支离心管中加入5%苯酚溶液200μL 、浓硫酸700μL 后，迅速摇匀，80℃水浴10min 后，冷水浴5min 终止反应，精密吸取各反应液加入96孔酶标板，每个样品加3个孔，每孔200μL ，采用酶标仪在490nm 波长下测定OD 值，以葡萄糖浓度为横坐标，OD 490nm 值为纵坐标，绘制标准曲线。
1.2.6 酶标仪测定多糖的可行性分析精密吸取浓度为40、60、80、100μg/mL 的葡萄糖标准品溶液各200μL 加入2mL 具塞塑料离心管中，按照1.2.5的操作方法加入苯酚、浓硫酸反应后，酶标仪测定OD 490nm 值，并根据标准曲线计算多糖含量。
2 结果与分析2.1 酶标仪检测波长的确定采用苯酚-硫酸法对葡萄糖标准品进行测定，于紫外可见分光光度计上，在400～600 nm 波长范围内进行扫描，结果如图1所示，葡萄糖标准品在490nm 处有最大吸收峰，故可选择490nm 作为酶标仪检测波长。
苯酚硫酸法测多糖含量
一、硫酸苯酚法测多糖含量1、试剂配制1. 浓硫酸：分析纯，95.5%2. 5%苯酚：取苯酚5 g，置100 ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀后，置棕色试剂瓶中，冰箱中冷藏储存备用。
3. 标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）或分析纯葡萄糖。
准确称取20m g经105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品于500ml容量瓶中，蒸馏水溶解定容。
2、制作标准曲线准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）10mg于250ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml，各以蒸馏水补至1.0ml，然后加入5%苯酚1ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测光密度，以1.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。
1 2 3 4 5 6 7 8 00.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 标准葡萄糖溶液（mL）蒸馏水（mL）0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 1.0 5%苯酚（mL）0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 浓硫酸（mL） 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5葡萄糖标准曲线y = 54.353x + 0.0018R 2 = 0.999400.10.20.300.0010.0020.0030.0040.0050.006葡萄糖浓度（mg/ml）吸光值3 注意事项（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。
（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg 数。
（3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算（4）测定时根据光密度值确定取样的量。
光密度值最好在0.1——0.3之间。
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了几种单糖对葡萄糖的吸光度校正系数 k′i, 并用它们计算寡糖或多糖的 含量。结 果: 对 4 种寡糖和 4 种多糖 ( 包括
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Chin P harm J , 1996 Sep tember , Vol . 31 No. 9 中国药学杂志 1996 年 9 月第 31 卷第 9 期
速, 用于甘草酸的定量研究更为准确, 有较高准
确度及精密度, 能准确地反映制剂中甘草酸的
含量, 可用于质量控制。 3. 3 实验结果表明: x- 为 99. 7% , s 为1. 97% ,
RSD 为 1. 8% , 实验精密度 高, 符合统计 学原
理。
同时, 根据药品质量及生物测定的要求, 在
概率( P = 0. 95) [ 4] 下, 可信度及可 信限率分别
浓度呈线性关系, 从而可用比色法测定其含量。 copyranose) 为 Sigma 产品。可溶性淀粉( 中国
对于匀多糖, 可直接以其组成糖作标准曲 线[ 4] 。但对于由不同糖残基构成的杂多糖, 情况
医药公司) , 经 Sephadex G-200 凝胶过滤柱层 析进一步纯化。香菇多糖( lent inan) 、酵母甘露
RSD (% )
0. 8 0. 6 1. 3 1. 2 1. 1 0. 9 0. 7
3 结果与讨论 3. 1 甘草制剂是一种多组分的复合制剂, 在本 文实验条件下, 其它组分不干扰甘草酸的分离 与测定。 3. 2 甘草酸有效成分的提取是利用甘草酸的 溶解性, 即甘草酸易溶解于热醇、热水溶液, 加 之利用超声波而提取。处理方法简单, 测定迅
酸的含量, 用对照品加入量计算回收率, 平均回 收率 99. 7% , RSD 为 1. 8% 。 2. 2. 4 精 密度 实 验: 取不 同 浓 度 8, 12, 18 mg/ 10 ml 的标准溶液, 各进样 10 次, 测得日内 RS D。取不同浓度 8, 12, 18 mg/ 10 ml 的标准溶 液, 样品每天测定 1 次, 进样 10 Ll, 连续 5 d, 求 得日间 RS D。结果见表 1。
Modif ied phenol -sulfuric acid met hod for determination of the content of oligo- and polysacchar id es
Dong Qun ( Dong Q ) , Zheng Liyi( Zheng LY ) , Fang Jinian ( F ang JN ) ( S ha ngha i I nstitute of Ma ter ia
水中。 标准液分别稀释成浓度为 30, 60, 90, 120,
中国药学杂志 1996 年 9 月第 31 卷第 9 期 Chi n P harm J , 1996 Sep t ember , Vol. 31 N o. 9 ·551·
150, 190 Lg/ ml 的溶液, 取该溶液各 0. 2 ml ( 含 表 2 寡糖及多糖 含量测定的结果
则较为复杂, 因为不同单糖的标准曲线的斜率 聚糖( mannan) 和荚竹桃多 糖 NIA-1( 组成 为:
不同, 所以应采用与杂多糖组成相同的混合单 L -Ar a ∶ D -Gal ∶ D-Glc = 13 ∶ 9 ∶ 70,
糖 制 作 标 准 曲 线。另 外, 目 前 通 常 使 用 的 mol/ mol) 均为本实验室制备, 经高效液相色谱
= 2. 81%
符合可信限率< 10% , 即认为该方法重复
性好。因此, 该方法精密度高, 重现性好, 是定量
测定甘草制剂中甘草酸的好方法。
3. 4 从样品测定结果来看( 表 2) , 不同甘草复
方制剂的不同剂型中甘草酸的含量完全不同,
生产厂应在产品质量上进行定量控制。本文所
建立的一套完整的定量测定方法, 为有关制剂
的标准曲线, 并由此计算杂多糖和寡糖的含量。 1. 2 方法: 标准溶液法
燥的各种单糖各 20 mg, 分别溶于 100 ml 重蒸
1. 1 材料: 苯酚( 分析纯) , 重蒸后配成 50 g/ L 水溶液; 浓硫酸( 分析纯, d = 1. 84 g/ cm- 3) ; D
均聚糖和异聚糖) 的含量用改进的方法进行了测定, 该方法的相对误差小于 4% , 具有良好的重复性, 线性范围含糖 量 0～30 Lg。结论: 利用在改进的测定条件下测得的各种单糖的校正系数, 可以以葡萄糖为标准品对组成己知的寡 糖或多糖的含量进行测定。 关键词 多糖; 寡糖; 定量测定; 改进的硫酸-苯酚法
表 2 甘草制剂中甘草酸含量测定结果(n= 5)
样品名称
牛黄解毒片 牛黄解毒丸 强力银翘解毒片 银翘解毒丸 霍香正气丸 参芩白术散 川穹茶调散
样品批号
无 93 01 11
无 93 01 18 93 12 14 94 10 15
无
含量(mg/ 片)
1. 03 1. 00 1. 35 1. 42 1. 62 1. 90 1. 40
高温迅速水解, 产生单糖, 单糖在这种强酸条件 二 糖 ( cellobiose ) 、乳 糖 ( lact ose, 4-O-B-D-
下与苯酚反应生成橙色衍生物。该衍生物在波 galact opyranosyl-D-gl ucopyrannose) 和蜜二糖
长 490 nm 处和一定浓度 范围内, 吸收值与糖 ( melibiose, 6-O-A-galact opyranosyl-D-gl u-
寡 糖 和多 糖 含 量的 测 定 至今 大 多采 用
Dubois 等提出的苯酚-硫酸比色法[ 1, 2] 。该方法 的原理是[ 3] : 多糖或寡粉被浓硫酸水合产生的
( + ) -葡萄 糖, D ( + ) -甘露 糖为 F luka 产品; L ( - ) -阿拉伯糖, L( - ) -木糖, D ( + ) -半乳糖和 L ( - ) -鼠李糖均为 Merck 产品; 麦芽糖, 纤维
4 周海钧, 申蕴如主编. 生物检定统计方法. 第 2 版. 北京: 人 民卫生出版社, 1983∶9.
( 收稿: 1995- 08- 02)
改良的苯酚-硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究
董群 郑丽伊 方积年( 上海 200031 中国科学院上海药物研究所)
摘要 目的: 建立以葡萄糖为参比测定多糖或寡糖含量的方法。方法: 对苯酚-硫酸法的 测定条件进行了改进, 测定
Medica , Aca demia Sinica, S hang ha i 200031)
ABSTRACT OBJ ECTIVE: T o esta blish a method for det er minat ion of t he content of oligo and polysacchar ides, using only glucose as the st andar d. M ETHOD: The absorbance corr ection coefficent s of several monosaccharides were deter mined with the m odified phenol-sulfuric acid method and then used in the calculation of the content of sacchar ides. RESULTS: T he modified method wa s used for deter mination of the sacchar ide content of four oligosacchar ide and four polysacchride samples, and was shown to be excellent in accur acy and r epr oducibility, with relative err or less t han 4% . T he linear r ange of sacchar ide content was 0～ 30 Lg. CONCLUSI ON: The corr ection coefficients deter mined with the modified phenol-sulfuric acid can be successfully used for deter mination of t he content of oligo-and polysaccharides with only glucose as the standard. KEY WORDS polysa cchar ide, oligosaccharide, quantita tive deter mination, modified phenol-sulf ur ic acid method
表 1 日内、日间 R SD 测定结果( % )
浓度(mg/ 10 ml)
日内(n= 10)
日间( n= 5)
8 12 18
1. 5
2. 2
1. 8
2. 4
1. 2
3. 0
精密度实验表明, 日内、日间实验 RSD 都 较小, 重复性好。 2. 2. 5 测定结果: 精密称取供试品( 约 1 日量, 即 1 份) , 操作方法同供试品溶液的制备方法, 精密进样 10 Ll, 按回归方程计算出其中甘草酸 的含量, 结果见表 2。
Dubois 法, 采用高浓度的苯酚 800 g/ L 易产生 及元素分析鉴定为均一多糖组成。
较大的误差而影响结果的准确性。本文报道的
吸光度用 721 型分光光度计测定, 使用光
苯酚-硫酸法改良后的条件, 使测定过程更方便 径 10 mm 石英比色皿。用 Opt ifix 定量加液器
可行, 结果更可靠, 此外还测定了各种常见单糖 吸加 50 g/ L 苯酚及浓硫酸。