生物化学实验PPT课件：精氨酸激酶的提取、分离、纯化及活力测定
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【课件】医学生物化学实验课程PPT
常用于测定核酸和蛋白质的浓 度，酶反应的动力学研究等。
步骤
准备标准曲线、设置光程、选 择波长、测量吸光度和计算样 品浓度。
凝胶电泳
SDS-PAGE凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳
通过凝胶电泳分离和分析蛋白质。
用于分离和分析核酸，如DNA和 RNA。
非变性凝胶电泳
用于分离和分析蛋白质的三维空 间结构。
西方博洛法
戴好实验手套、口罩和实验服，避免有害物质接触。
3 合理使用实验室设备
学习如何使用化学品和设备，遵守正确的使用方法。
4 注意实验室卫生
保持实验台清洁，妥善处理废弃物和化学品。
酶活性测量
实验原理
通过测量酶催化反应速率来评 估酶活性。
实验步骤
包括制备反应混合物、控制反 应条件和测定反应速率。
数据分析
通过绘制酶活性曲线和计算酶 活性单位来解释实验结果。
医学生物化学实验课程 PPT
探索医学生物化学实验课程，从实验室中的安全措施、基本技术和设备开始， 到酶活性测量、蛋白质层析纯化、蛋白质浓度测定、分光光度法、凝胶电泳 以及PCR等。拓展知识边界，发现医学化学的奥秘。
实验室安全
1 仔细阅读实验手册
熟悉实验步骤和安全规定，确保操作正确。
2 穿戴个人防护装备
蛋白质层析纯化
1
树脂选择
选择合适的层析树脂来分离和纯化目标
制备样品和柱子
2
蛋白质。
预处理样品，并准备层析柱和缓冲溶液。
3
样品加载
将样品加载到层析柱中，充分与树脂互
洗脱和回收
4
作用。
使用洗脱缓冲液洗脱目标蛋白质，并收 集纯化的样品。
蛋白质浓度测定
1 布鲁克法
生物化学实验PPT课件：精氨酸激酶的提取、分离、纯化及活力测定
四、操作步骤
（一）酶液的制备
（二）凝胶层析
1. 凝胶溶胀 根据柱床体积称取一定量 Sephadex G-100 干胶，加入蒸馏水，沸水煮沸2个小时，使之充分溶胀。
2. 装柱 用充分溶胀的Sephadex G-100装柱，装柱前，先 在柱中加入一定量的层析柱平衡液，然后倒入凝胶，打开 柱底部的出口，使其自然沉降,保持柱顶部缓冲液1-2 cm 高。
蛋白质含量及酶活力测定
蛋白质含量测定可采用紫外法或考马斯亮蓝法。 酶活力测定：取3 ml 测活反应液于比色杯中，加入30 l酶液， 立即混匀并测定575 nm处的吸光值，计时，当吸收值达到1.4时 停止测定，并记录所需时间，以每秒575 nm处每变化0.001为一 个酶活力单位，如反应开始时A575为2.0，反应60秒后，A575为 1.4，则酶活力为
恒流泵电源
记录仪
层析柜
思考题
• 1. 影响蛋白质分离效果的因素有哪些? • 2. 获得理想纯化结果应注意哪些关键步骤？ • 3. 蛋白峰的高低和和宽窄与纯化结果有关系？ • 4. 如何确定目的蛋白？ • 5. 如何评价蛋白质纯度？ • 6. 为什么蛋白质纯化过程中每一步都要测定蛋白
质 含量和活性？
精氨酸激酶的提取、 分离、纯化及活力测定
凝胶过滤分离纯化蛋白质
• 实验目的 • 实验原理 • 实验材料、仪器和试剂 • 实验操作步骤 • 仪器使用 • 思考题
一、目的
学习和掌握蛋白质的提取、凝胶层析分离 纯化精氨酸激酶的原理和操作技术，并学习目的 蛋白质的确定方法。
二、原理
凝胶过滤(Gel Fitration Chromatography，GFC) 又称分子筛层析、分子排阻层析、凝胶色谱。基本原理是 混合物中各组分通过层析柱时按其分子大小不同而被分离 的技术。固定相（凝胶）是一种不带电荷的具有三维空间 的多空网状结构的物质，分子量大的蛋白质不能渗入凝胶 颗粒内部，流程短，先被洗脱下来，而分子量小的蛋白质 可可以进入凝胶网孔，流程长，后被洗脱下来，从而达到 分离的目的。
生物化学试验课件
目录
实验一 氨基酸的分离鉴定——纸层析法 (操作性) 4学时 实验二 考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 (操作性) 3学时 实验三 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 (验证性) 5学时 实验四 动物肝肝脏DNA的分离与鉴定 (操作性) 3学时 实验五 血液中葡萄糖的测定 (操作性) 3学时 实验六 血清中总胆固醇的测定 (操作性) 4学时 实验七 唾液淀粉酶活性的观察 (综合性) 4学时 实验八 维生素C的定量测定 (操作性) 4学时 实验九 脂肪酸的β-氧化 (操作性) 4学时
【注意事项】
1．醋酸纤维素薄膜的质量对结果影响很大，最好选用 同一批号、薄膜厚度均匀、质量良好的醋酸纤维素薄膜。 2．血清或其他电泳样品应新鲜。 3．点样应细窄、均匀、集中。点样量不宜过多，点样 位置要合适。 4．盐桥要放置平整，保证电场均匀。 5．电泳槽盖应密封，盖内空间不宜过大。 6．较低温度下电泳一般能获得较好的图谱，故室温不 宜过高。 7．选择合适的缓冲液离子强度。
【实验步骤】
1．薄膜准备 2．点样
3．电泳
4．染色和漂洗 +
白蛋白(A)
α2
β
γ
α1
5．薄膜和透明
6．定量
（1）洗脱法
每种蛋白占总蛋白量的
百分数（%）
该种蛋白管光密度读数 各管光密度读数之和
100 %
注意！白蛋白因加入NaOH的量比其他管多，其光密度值 应乘以稀释倍数，得到数值再代入上式中计算。
8．两电泳槽内缓冲液面应在同一水平。 9．要控制好电流，电压和电泳时间。 10．电泳槽内缓冲液可以多次使用。但操作时应尽量减 少缓冲液的污染、水分蒸发、pH及离子强度的改变， 并应防止霉菌的滋长。 11．染色、漂洗及洗脱时间要控制好，才能获得重复性 良好的定量结果。
生物化学检验ppt课件
酶类CK-MB,α-AMY等。
底物/代谢产物类：包括TG，TC，HDL-C，LDL-C，UA， UREA，Cr，Glu，TP，Alb，T-Bil，D-Bil，NH4+,CO2 等。
无机离子类：包括Ca，P，Mg，Cl 等。
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
吸收曲线
波长从200nm-400nm 的电磁波，称为紫外光，波长从400nm-760nm 的电磁波，称为可见光。以波长(λ)为横坐标，以吸光度为纵坐标而绘 制出的一条曲线称为吸收曲线，在一段波长范围内，有最大吸收波长 λmax 和最小吸收波长λmin，在最大吸收波长处测定可获得最大的测 定灵敏度。
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
二、连续监测法
连续监测法属于动态法检测的一种，适用于酶活性测 定和代谢物检测，多有酶的参与。该法是通过适当的 仪器，连续测定酶促反应过程中某一反应产物或底物 的浓度随时间变化的情况。原理是：在酶反应的最适 条件下，用物理、化学或酶促反应的分析方法，在反 应速度恒定期（零级反应期）来连续观察和记录一定 时间内底物或产物量的变化，以单位时间酶反应初速 度计算出酶活力大小代谢物的浓度。计算方法有：1） 绝对法：酶活力（U/L）=△A×（反应液体积/样品体 积）×（1000/消光系数）；2）相对法：酶活力 （U/L）=〔 △A （测定）/ △A （标准） 〕标准物的 活力或浓度。
两点终点法
两点终点法也称因定时间法，它可以用一种试剂或两 种试剂。这种方法是近年来，可加双试剂的生化分析 仪问世后，才被广泛应用。优点是可以消除样品、试 剂的颜色、浊度，以及一些干扰物对测定的干扰。原 理是：加入样品→试剂1 →读取A1 →试剂2 →读取 A2，其中要读取两次吸光度值，第一次相当于读出样 品空白的值，加入试剂2至第二次读数才是实际呈色 反应，因此A=A1-A2。比浊法也是一种终点法，不过 是一种浊度测定，而不是比色测定。比浊法可分为化 学比浊法与免疫比浊法，免疫比浊法又分为透射比浊 法和散射比浊法。免疫比浊法目前主要用于血清特种 蛋白的测定，如载脂蛋白(apoAI,apoB 等)、补体类(C3、
底物/代谢产物类：包括TG，TC，HDL-C，LDL-C，UA， UREA，Cr，Glu，TP，Alb，T-Bil，D-Bil，NH4+,CO2 等。
无机离子类：包括Ca，P，Mg，Cl 等。
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
吸收曲线
波长从200nm-400nm 的电磁波，称为紫外光，波长从400nm-760nm 的电磁波，称为可见光。以波长(λ)为横坐标，以吸光度为纵坐标而绘 制出的一条曲线称为吸收曲线，在一段波长范围内，有最大吸收波长 λmax 和最小吸收波长λmin，在最大吸收波长处测定可获得最大的测 定灵敏度。
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
二、连续监测法
连续监测法属于动态法检测的一种，适用于酶活性测 定和代谢物检测，多有酶的参与。该法是通过适当的 仪器，连续测定酶促反应过程中某一反应产物或底物 的浓度随时间变化的情况。原理是：在酶反应的最适 条件下，用物理、化学或酶促反应的分析方法，在反 应速度恒定期（零级反应期）来连续观察和记录一定 时间内底物或产物量的变化，以单位时间酶反应初速 度计算出酶活力大小代谢物的浓度。计算方法有：1） 绝对法：酶活力（U/L）=△A×（反应液体积/样品体 积）×（1000/消光系数）；2）相对法：酶活力 （U/L）=〔 △A （测定）/ △A （标准） 〕标准物的 活力或浓度。
两点终点法
两点终点法也称因定时间法，它可以用一种试剂或两 种试剂。这种方法是近年来，可加双试剂的生化分析 仪问世后，才被广泛应用。优点是可以消除样品、试 剂的颜色、浊度，以及一些干扰物对测定的干扰。原 理是：加入样品→试剂1 →读取A1 →试剂2 →读取 A2，其中要读取两次吸光度值，第一次相当于读出样 品空白的值，加入试剂2至第二次读数才是实际呈色 反应，因此A=A1-A2。比浊法也是一种终点法，不过 是一种浊度测定，而不是比色测定。比浊法可分为化 学比浊法与免疫比浊法，免疫比浊法又分为透射比浊 法和散射比浊法。免疫比浊法目前主要用于血清特种 蛋白的测定，如载脂蛋白(apoAI,apoB 等)、补体类(C3、
酶的提取与分离纯化ppt课件
整理版课件
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4.干燥法
气流干燥 真空干燥 喷雾干燥 冷冻干燥
使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、 丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被 抽提出来。
气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干； 真空干燥多用于细菌。
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三、破碎率的测定与破碎技术的研究方向
整理版课件
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5.其他方法
1. X-press法
将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体，利用500MPa 以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破 碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起 的。
此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及 活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。
整理版课件
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3. 反复冻结-融化法
将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多 次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键 结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变 化，引起细胞膨胀而破裂。
适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融 过程中可能引起某些蛋白质变性。
整理版课件
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化学渗透法优点：
对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质 如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍 滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进 一步提取。
缺点： 通用性差；
时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 有些化学试剂有毒 。
整理版课件
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（2）EDTA螯合剂
处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结 构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持， 一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落， 使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补， 从而导致内层膜通透性的增强。
《精氨酸刺激试验》课件
确保相关仪器设备处于良 好状态，校准准确，确保 血样采集和检测的准确性 。
知情同意
向受试者详细解释试验目 的、过程和可能的副作用 ，并签署知情同意书。
精氨酸的注射与采集血样
精氨酸注射
按照规定的剂量和速度，将精氨 酸注射到受试者的静脉中。
血样采集
在注射前、注射后特定时间点采 集血样，用于检测相关激素和代 谢产物的水平。
操作复杂度与误差
精氨酸刺激试验需要严格的操作规程 和精确的剂量控制，否则可能导致结 果不准确。
VS
由于操作复杂，可能需要专业的医务 人员来完成，这增加了试验成本和时 间。
对患者的潜在风险
精氨酸刺激试验可能导致患者血压波动、心率失常等不良反应，需要密切监测。
对于某些患者，精氨酸刺激试验可能引发严重的并发症，如过敏反应、心肌梗死等。
精氨酸是一种氨基酸，在人体内具有多种生理功能，包括促 进血管舒张和调节血压等。精氨酸刺激试验通过注射精氨酸 来刺激心血管系统，观察心血管系统的反应。
精氨酸刺激试验的原理
精氨酸刺激试验的原理基于精氨酸的生理作用。精氨酸能 够刺激一氧化氮合酶的活性，促进一氧化氮的生成。一氧 化氮是一种重要的血管舒张因子，能够扩张血管，降低血 压。
精氨酸刺激试验
目录
CONTENTS
• 精氨酸刺激试验简介 • 精氨酸刺激试验的步骤 • 精氨酸刺激试验的结果解读 • 精氨酸刺激试验的临床意义 • 精氨酸刺激试验的局限性 • 精氨酸刺激试验的未来展望
01
精氨酸刺激试验简 介
精氨酸刺激试验的定义
精氨酸刺激试验是一种用于评估心血管功能和诊断相关疾病 的检查方法。它通过观察精氨酸对心血管系统的反应来评估 心血管功能。
异常结果解读
知情同意
向受试者详细解释试验目 的、过程和可能的副作用 ，并签署知情同意书。
精氨酸的注射与采集血样
精氨酸注射
按照规定的剂量和速度，将精氨 酸注射到受试者的静脉中。
血样采集
在注射前、注射后特定时间点采 集血样，用于检测相关激素和代 谢产物的水平。
操作复杂度与误差
精氨酸刺激试验需要严格的操作规程 和精确的剂量控制，否则可能导致结 果不准确。
VS
由于操作复杂，可能需要专业的医务 人员来完成，这增加了试验成本和时 间。
对患者的潜在风险
精氨酸刺激试验可能导致患者血压波动、心率失常等不良反应，需要密切监测。
对于某些患者，精氨酸刺激试验可能引发严重的并发症，如过敏反应、心肌梗死等。
精氨酸是一种氨基酸，在人体内具有多种生理功能，包括促 进血管舒张和调节血压等。精氨酸刺激试验通过注射精氨酸 来刺激心血管系统，观察心血管系统的反应。
精氨酸刺激试验的原理
精氨酸刺激试验的原理基于精氨酸的生理作用。精氨酸能 够刺激一氧化氮合酶的活性，促进一氧化氮的生成。一氧 化氮是一种重要的血管舒张因子，能够扩张血管，降低血 压。
精氨酸刺激试验
目录
CONTENTS
• 精氨酸刺激试验简介 • 精氨酸刺激试验的步骤 • 精氨酸刺激试验的结果解读 • 精氨酸刺激试验的临床意义 • 精氨酸刺激试验的局限性 • 精氨酸刺激试验的未来展望
01
精氨酸刺激试验简 介
精氨酸刺激试验的定义
精氨酸刺激试验是一种用于评估心血管功能和诊断相关疾病 的检查方法。它通过观察精氨酸对心血管系统的反应来评估 心血管功能。
异常结果解读
《生物化学实验》PPT课件
蛋白质从“－”极向“＋”极移 动，从浓缩胶进入分离胶，速 度变慢，堆积浓缩。
缓冲 液
浓缩胶
分离胶
蛋白质样品进入分离胶后
pH增大(pH 8.9)，Gly－解离度增 大，不存在快、慢离子之分， 蛋白质样品在均一电场强度和 pH条件下泳动。
由于各种蛋白质pI不同，所载有 效电荷不同，因此质点的 有效 迁移率不同，形成不同区带。
交联剂：甲叉双丙稀酰胺交联剂(Bis)
O
O
CH2=CH-C-NH -CH2-NH-C-CH=CH2
催化剂 聚合形成的三维网状结构。
催化剂
（1）过硫酸铵-TEMED系统 碱性条件下催化作用 温度与聚合快慢成正比 （2）核黄素-TEMED系统 光激发的催化反应 用量少，对分析样品无影响 聚合时间可自由控制
4
2
64
64
48
32
20
12
322
40
40
8
20
30
4
12
2
纸层析
纸层析是最简单的液一液相分配层析。 滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时，
大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，因此， 纸及其饱和水为层析的固定相，与固定相不相 混溶的有机溶剂为层析的流动相。 对某些特定化合物，在特定的展层系统，一定 的温度条件下，Rf是个常数。
大分子物质; 高压电泳(500—1000V). 20—200V/cm，几分钟；氨基酸、小肽、
核苷酸等小分子物质; （2）溶液的pH值 pH距待分离物质的pI越远，泳动速度越大； （3）溶液离子强度 离子强度越小,电动势越大,泳动速度越快。 （4）电渗现象：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。
在不同条件 下，占主要地位的作用力可能不同，也可能几种力同 时起作用
缓冲 液
浓缩胶
分离胶
蛋白质样品进入分离胶后
pH增大(pH 8.9)，Gly－解离度增 大，不存在快、慢离子之分， 蛋白质样品在均一电场强度和 pH条件下泳动。
由于各种蛋白质pI不同，所载有 效电荷不同，因此质点的 有效 迁移率不同，形成不同区带。
交联剂：甲叉双丙稀酰胺交联剂(Bis)
O
O
CH2=CH-C-NH -CH2-NH-C-CH=CH2
催化剂 聚合形成的三维网状结构。
催化剂
（1）过硫酸铵-TEMED系统 碱性条件下催化作用 温度与聚合快慢成正比 （2）核黄素-TEMED系统 光激发的催化反应 用量少，对分析样品无影响 聚合时间可自由控制
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纸层析
纸层析是最简单的液一液相分配层析。 滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时，
大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，因此， 纸及其饱和水为层析的固定相，与固定相不相 混溶的有机溶剂为层析的流动相。 对某些特定化合物，在特定的展层系统，一定 的温度条件下，Rf是个常数。
大分子物质; 高压电泳(500—1000V). 20—200V/cm，几分钟；氨基酸、小肽、
核苷酸等小分子物质; （2）溶液的pH值 pH距待分离物质的pI越远，泳动速度越大； （3）溶液离子强度 离子强度越小,电动势越大,泳动速度越快。 （4）电渗现象：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。
在不同条件 下，占主要地位的作用力可能不同，也可能几种力同 时起作用
体液中酶的生物化学检验 ppt课件
（二）参考区间 男性：11--50U/L 女性：7--32U/L
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（三）临床意义
1、肾脏疾病：血清中GGT活性升高不明显 2、肝脏疾病： （1）诊断恶性肿瘤肝转移和肝癌术后复发情况，阳性 率可达90% （2）GGT同工酶II与AFP联合检测可原发性肝癌的检 测阳性率明显升高 3、嗜酒或长期服用某种药物
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三、γ-谷氨酰转移酶（GGT）
是一种含巯基的线粒体酶，参与体内谷胱
甘肽的代谢。肾脏、肝脏和胰腺中含量丰富，
但血清中GGT主要来自肝胆系统。GGT在肝 脏中广泛分布于肝细胞的毛细胆管一侧和整 个胆管系统，因此肝内合成亢进或胆汁排出 受阻时，血清中GGT升高。
19
（一）检测方法
碱性条件下GCNA与甘氨酰甘氨酸反应的方法
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（1-12岁 <500U/L ; >15岁 40--150U/L
男性：1-12岁 <500U/L；
12-15岁 <750U/L；
>25岁 40--150U/L
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（三）临床意义
肿瘤、恶性肿瘤骨转移等
升高
1、骨骼疾病：变形性骨炎、佝偻病、软骨病、骨恶性
2、肝胆疾病：阻塞性黄疸、肝硬化、肝坏死、原发性 和继发性肝癌时明显升高；肝细胞性黄疸升高不明显。
3、肿瘤：乳腺癌、肺癌等
4、其他疾病：甲状腺及甲状旁腺功能亢进、遗传性
ALP过多症
5、药物：巴比妥类、抗生素等
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七、酸性磷酸酶（ACP）
酸性磷酸酶是一种在酸性条件下催化磷酸 单酯水解生成无机磷酸的水解酶。人血清
真性胆碱酯酶（AChE）和假性胆碱脂酶
（PChE）。真性胆碱酯酶也称乙酰胆碱酯酶主要
存在于胆碱能神经末梢突触间隙，PChE又称血清
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三、材料、仪器和试剂
1、材料 市售鲜虾肉 2、仪器 ① 层析柱（直径1.0-1.3 cm；管长30 cm) ② MC99-3自动液相色谱分离层析仪； ③ 核酸蛋白检测仪； ④ 自动部分收集器； ⑤ 分光光度计； ⑥ 低温高速离心机；
3、试剂 （1） 葡聚糖凝胶Sephadex G-100 （2） 精氨酸激酶提取液 （3） 凝胶层析柱平衡液 （4） 凝胶层析柱洗脱液 （5） 精氨酸激酶测定液
四、操作步骤
（一）酶液的制备
（二）凝胶层析
1. 凝胶溶胀 根据柱床体积称取一定量 Sephadex G-100 干胶，加入蒸馏水，沸水煮沸2个小时，使之充分溶胀。
2. 装柱 用充分溶胀的Sephadex G-100装柱，装柱前，先 在柱中加入一定量的层析柱平衡液，然后倒入凝胶，打开 柱底部的出口，使其自然沉降,保持柱顶部缓冲液1-2 cm 高。
六、仪器使用
组装蛋白质 纯化系统
整
2
体
蛋
白
质
纯
化
1
3
系
统
4 1：自动馏分收集器 2：梯度混合仪 3：恒流泵 4：核酸蛋白检测仪
各种层析柱
梯度混合仪
核酸蛋白检测仪
光吸收值显示
样品池
灵敏度选择
调光吸收0
调透过率100
部分收集器
当前收集管号显示
洗脱液出口 收集管
当设置键盘 收集时间显示
流速显示窗 流速调节旋钮
精氨酸激酶的提取、 分离、纯化及活力测定
凝胶过滤分离纯化蛋白质
• 实验目的 • 实验原理 • 实验材料、仪器和试剂 • 实验操作步骤 • 仪器使用 • 思考题
一、目的
学习和掌握蛋白质的提取、凝胶层析分离 纯化精氨酸激酶的原理和操作技术，并学习目的 蛋白质的确定方法。
二、原理
凝胶过滤(Gel Fitration Chromatography，GFC) 又称分子筛层析、分子排阻层析、凝胶色谱。基本原理是 混合物中各组分通过层析柱时按其分子大小不同而被分离 的技术。固定相（凝胶）是一种不带电荷的具有三维空间 的多空网状结构的物质，分子量大的蛋白质不能渗入凝胶 颗粒内部，流程短，先被洗脱下来，而分子量小的蛋白质 可可以进入凝胶网孔，流程长，后被洗脱下来，从而达到 分离的目的。
恒流泵电源
记录仪
层析柜
思考题
• 1. 影响蛋白质分离效果的因素有哪些? • 2. 获得理想纯化结果应注意哪些关键步骤？ • 3. 蛋白峰的高低和和宽窄与纯化结果有关系？ • 4. 如何确定目的蛋白？ • 5. 如何评价蛋白质纯度？ • 6. 为什么蛋白质纯化过程中每一步都要测定蛋白
质 含量和活性？
蛋白质含量及酶活力测定
蛋白质含量测定可采用紫外法或考马斯亮蓝法。 酶活力测定：取3 ml 测活反应液于比色杯中，加入30 l酶液， 立即混匀并测定575 nm处的吸光值，计时，当吸收值达到1.4时 停止测定，并记录所需时间，以每秒575 nm处每变化0.001为一 个酶活力单位，如反应开始时A575为2.0，反应60秒后，A575为 1.4，则酶活力为
3. 加样 打开柱顶，用吸管吸出多余的缓冲液至柱床上薄薄一 层，然后加入酶液，加样量一般不超过凝胶体积的5%。
4. 洗脱与收集 打开恒流泵，控制流速进行洗脱，洗脱液通过 核酸蛋白检测仪并通过自动收集器收集，每管收集2min。
5. 收集目的蛋白 通过测定每个蛋白峰的精氨酸激酶活性， 确定目的蛋白所在的峰，收集，可通过离子交换层析进一 步纯化，直至达到单一蛋白峰。
80
8
60
6
protein content enzymatic activity
40
0
20
40
60
tube number
酶活力测定体系
分别取储备液即57 mmol/L 精氨酸、46 mmol/L ATP、66 mmol/L MgSO4 和指示剂 (包含 0.15% g/ml百里酚蓝和 0.025% g/ml 甲酚红) 各2 ml 加水到20 ml，调至pH 8.0 （575 nm下的吸收值在2.1 左右）。
各种层析技术的主要原理
凝胶过滤层析
交联的葡聚糖凝胶
凝胶颗粒
凝胶颗粒内部的网状结构
表1 常用凝胶分离范围
凝胶类型及规格 葡聚糖凝胶 （ sephadex)
聚丙烯酰胺凝胶 (Bio-Gel ) 琼脂糖凝胶
（Sepharose）
G-200 G-100 G-50
G-25 P-300 P-150 2B 4B 6B
分离范围 6×105 1.5×105 3×104
5×103 5×105 1.5×105 1.5×105 1.5×105 1.5×105
精氨酸激酶活力测定(连续测活法)
精氨酸激酶催化精氨酸与ATP合成磷酸精氨酸 时释放出质子 。L-arginine+Mg•ATP
N-phospho-L-argine+Mg•ADP+H+ 用酸碱指示剂 (0.15 g/ml百里酚蓝和 0.025 g/ml 甲酚红) 指示溶液中质子生成的量，可表示精氨酸激 酶的活性。反应液的pH稍大于8.0时，其575 nm 处的吸光值下降（2.2~1.4范围内）与溶液中H+浓 度的增加成线性关系。 精氨酸激酶的活力用 A575/sec 表示。