免疫组化显色系统
使用对象 可向所有做免疫组化的用户推荐.
催化放大系统CSA
(Catalyzed Signal Amplication System)
原理
在经典三步法免疫组化放大基础上,通过生物素 化酪胺的催化,将又一次加入的酶标记链亲和素 (Streptavidin-enzyme)与二抗中生物素亲和, 使已放大的分子再一次放大.
一抗/HRP(U…)
显色剂 DAB或AEC(K3467或K0697) 素木精复染(S3309)
水漂洗
一步法EPOS
特点:
• 一抗孵育后直接显色 • 即用型试剂 • 快速(一步)完成 • 敏感性较差 • 昂贵 • 使用对象: • 要求快速出结果的免疫组化实验对象
二步法EnVision
• 原理: 在葡聚糖大分子上标记二抗及酶, 将传统 的二抗和三抗(酶)连接在一起,形成一个 复合物EnVision. 两步孵育完成免疫组 化.
免疫组化原理图标注解
抗原2 一抗 1 过氧化物酶 碱性磷酸酶 一抗 2
双染阻断剂
显色剂(棕色)
抗兔二抗
显色剂(红色)
抗鼠二抗 葡聚糖骨架分子
组织抗原1
回顾过去
直接法
二步间接法
三步间接法
酶免疫复合物法
链亲和素-生物 素法(ABC)
目前常用的显色系统
• 一步法: EPOS ( Enhanced Polymer One-Step Staining) • 二步法: EnVision Systems • 双染: General Doublestain • 三步法: LSAB (Labeled Sstreptavidin-biotin) • 催化放大系统:CSA (Catalyzed Signal Amplication
催化放大系统CSA
(Catalyzed Signal Amplication System)
• 原理图
一抗与抗原结合 二抗/Bio与一抗结合
STAV/Bio与 二抗/Bio结合
放大液催化
加入STAV/HRP 与Bio再结合
催化放大系统CSA
(Catalyzed Signal Amplication System)
主要实验流程:
TBS冲洗(S1968) TBS冲洗(S1968)
阻断内过氧(S2001) 水洗 一抗孵育(Mo)
蛋白阻断剂(Kit含) 二抗孵育(Rb a-Mo/Bio) TBS冲洗(S1968)
TBS冲洗(S1968)
链亲和素/生物素 Strep./Bio (Kit含)
放大液(Kit含)
TBS冲洗(S1968)
二步法EnVision
• 原理图
一抗与抗原结合
EnVision二抗复合物与一抗结合
二步法EnVision
• 主要实验流程
阻断内过氧化酶(S2001)
TBS冲洗(S1968)
一抗孵育(Mo . Rb.)
TBS冲洗(S1968)
TBS冲洗(S1968)
EnVision(Mo.K4001 Rb.K4003)
EnVision/HRP( 1 Mo.) 蒸馏水冲洗
双染阻断剂(Kit含) EnVision/AP( 2 Rb.) 蒸馏水冲洗
TBS冲洗(S1968)
TBS冲洗(S1968) 苏木精复染(S3309)
显色剂 2Fast Read(K0597)
EnVision二步法双染
特点:
• 即用,方便,快速,省时. • 敏感性强. 背景低. • 在同一组织切片上, 用两种不同标记物标记两 种不同的抗原. 使用对象 • 需在同一张切片上标记两种抗原者 主要是形态学科研人员
TBS冲洗(S1968)
链亲和素/过氧化物酶 Strep./HRP(Kit含) 蒸馏水冲洗
显色剂DAB或AEC(Kit含)
苏木精复染(S3309)
催化放大系统CSA
(Catalyzed Signal Amplication System)
特点: • 敏感性极强 • 实验步骤较多 • 较贵
使用对象: • 需做免疫组化实验者, 特别适用于某些石蜡片不易 出结果的一抗.
System)
• 动物研究试剂盒: ARK
(Animal Research Kit)
一步法EPOS
• 原理: 在一抗上通过多聚骨架标记过氧化物酶. 即一抗上已标记过氧化物酶. 这种一抗与 抗原结合后即可直接显色.
特异性一抗 多聚骨架分子
过氧化物酶 组织抗原
一步法EPOS
• 主要实验流程
组织片脱蜡,水化 阻断(S2001) TBS冲洗(S1968) TBS冲洗(S1968)
免疫组化显色系统
Visualization Systems of Immunohistochemistry(IHC)
免疫组化技术原理
• 用标记物或显色物标记抗体或抗原 • 通过免疫学中的抗原与已知抗体反应来 检测组织或细胞内的抗原成分 • 免疫组化染色是一项综合性技术 • 组织材料的准备 • 免疫组化染色前处理 • 免疫组化染色(一抗, 显色系统)
二抗/生物素 (Mo.E354 Rb.E353) TBS冲洗(S1968)
链亲和素/HRP或AP
显色剂DAB或AEC(K3467或K0697) Fast Read(K0597或K0699)
蒸馏水冲洗
苏木精复染(S3309)
三步法 LSAB
(Labeled Streptavidin-biotin) 特点: • 便宜 • 有现成的兔, 鼠, 羊通用试剂盒 • 会有内源性生物素造成的非特异性背景
三步法 LSAB
(Labeled Streptavidin-biotin)
原理: 应用生物素标记二抗与过氧化物酶或碱性 磷酸酶标记链亲和素(Streptavidin)的 亲和作用, 连接一抗及抗原, 形成大分子. 再通过相应酶的底物(显色剂)作用使之显 色.
三步法 LSAB
(Labeled Streptavidin-biotin)
双染阻断剂
兔一抗接抗原2
兔EnV/AP接抗兔一抗
Fast Red(显色剂2)
EnVision二步法双染
• 主要实验流程
阻断内过氧化酶(S2001)
TBS冲洗(S1968)
一抗(1 Mo.)孵育 TBS冲洗(S1968)
TBS冲洗(S1968) 显色剂 1 DAB(K3467)
一抗(2 Rb.)孵育
原理图:
一抗与抗原结合
二抗/Bio与一抗结合
STPA/HRP(AP) 与二抗/Bio结合
三步法 LSAB
(Labeled Streptavidin-biotin) • 主要实验流程
阻断内过氧(S2001) TBS冲洗(S1968) 一抗孵育(Mo . Rb.)
TBS冲洗(S1968) TBS冲洗(S1968)
EnVision二步法双染
原理: 与EnVision二步法原理相同, 只是为达 到在同一组织上标记两种抗原. 必需用两 种动物来源的一抗(常用抗小鼠和兔),分 别配相应的EnVision(二抗) , 再用两种 颜色的显色剂显色.
EnVision二步法双染
• 原理图
鼠一抗接抗原1 鼠EnV/HRP接抗鼠一抗 DAB(显色剂1)
显色剂DAB或AEC(K3467或K0697)
苏木精复染(S3309)
二步法EnVision
特点: 二抗及酶通过葡聚糖连成一个大分子试剂(避开了传统 的生物素与链亲和素结合), 不受内源性生物素干扰. • 即用,方便,快速(两步). • 敏感性强. 背景低. • 是目前最理想的免疫组化显色系统 • 使用对象 • 可向所有做免疫组化的用户推荐.
动物研究试剂盒 ARK
(Animal Research Kit)
• 主要实验步骤
一抗与组织抗原反应之前需做试剂的预处理:
小鼠一抗 + 抗小鼠Ig的F(ab)/Bio
复合Байду номын сангаас 1 + 小鼠Ig
复合物 1
复合物 2 (已优化的一抗)
用复合物2作为一抗同LSAB三步法免疫组化染色
动物研究试剂盒 ARK
(Animal Research Kit)
动物研究试剂盒 ARK
(Animal Research Kit)
• 原理 在一抗与组织抗原反应之前: 小鼠一抗 F(c)与生物素化抗小鼠F(ab)片断结合, 再加入小鼠免疫球蛋白, 中和未被结合的 生物素化抗小鼠F(ab). 用该复合物再与 小鼠组织中特异抗原反应, 可降低非特异 性背景.
动物研究试剂盒 ARK
• 特点 小鼠一抗在小鼠组织切片上做免疫组化可 降低背景. • 使用对象 需用小鼠一抗做小鼠组织的免疫组化实 验者.
几种显色系统复杂与敏感性比较
目前最实用的显色系统
• EnVision System
• • • •
EnVision+ /Mo (K4000 K4001 GK400105) EnVision+/Rb (K4002 K4003 GK400305) EnVision Mo/Rb HRP (k1390 K1392 GK139305) EnVision Mo/Rb AP (K1396 k4016)
(Animal Research Kit)
• 原理图
小鼠一抗 抗小鼠Ig 免疫复合物/Bio和游离 免疫复合物/Bio和游离 小鼠Ig 免疫复合物/Bio和被中 抗小鼠Ig F(ab)/Bio 和的抗小鼠Ig F(ab)/Bio 抗小鼠Ig F(ab)/Bio
F(ab)/Bio 与组织抗原结合按LSAB法继续免疫组化染色
免疫组化显色系统 共31页
动物研究试剂盒 ARK
(Animal Research Kit)
• 原理 在一抗与组织抗原反应之前: 小鼠一抗 F(c)与生物素化抗小鼠F(ab)片断结合, 再加入小鼠免疫球蛋白, 中和未被结合的 生物素化抗小鼠F(ab). 用该复合物再与 小鼠组织中特异抗原反应, 可降低非特异 性背景.
动物研究试剂盒 ARK
• 即用,方便,快速(两步). • 敏感性强. 背景低. • 是目前最理想的免疫组化显色系统
• 使用对象 • 可向所有做免疫组化的用户推荐.
EnVision二步法双染
原理: 与EnVision二步法原理相同, 只是为达 到在同一组织上标记两种抗原. 必需用两 种动物来源的一抗(常用抗小鼠和兔),分 别配相应的EnVision(二抗) , 再用两种 颜色的显色剂显色.
(Animal Research Kit)
• 原理图
小鼠一抗 抗小鼠Ig 免疫复合物/Bio和游离 免疫复合物/Bio和游离 小鼠Ig 免疫复合物/Bio和被中
F(ab)/Bio 抗小鼠Ig F(ab)/Bio 抗小鼠Ig F(ab)/Bio
和的抗小鼠Ig
F(ab)/Bio
与组织抗原结合按LSAB法继续免疫组化染色
• 特点 小鼠一抗在小鼠组织切片上做免疫组化可 降低背景.
• 使用对象 需用小鼠一抗做小鼠组织的免疫组化实 验者.
几种显色系统复杂与敏感性比较
目前最实用的显色系统
• EnVision System
• EnVision+ /Mo (K4000 K4001 GK400105) • EnVision+/Rb (K4002 K4003 GK400305) • EnVision Mo/Rb HRP (k1390 K1392 GK139305) • EnVision Mo/Rb AP (K1396 k4016)
全自动免疫组化染色仪工作过原理
全自动免疫组化染色仪工作过原理引言：全自动免疫组化染色仪（Automated Immunohistochemistry Stainer）是一种用于组织学研究和病理诊断的重要设备。
它通过自动化的方法实现对组织标本的免疫染色，为医学研究和临床应用提供了高效、准确的技术支持。
本文将介绍全自动免疫组化染色仪的工作原理及其应用。
一、全自动免疫组化染色仪的组成全自动免疫组化染色仪主要由样本处理模块、试剂盘、染色盘、显微镜、相机和控制系统等部分组成。
其中，样本处理模块负责对组织标本进行预处理，包括脱水、脱脂、抗原修复等；试剂盘用于存放和供应试剂；染色盘用于容纳染色液和组织标本；显微镜和相机用于观察和记录染色结果；控制系统用于控制整个仪器的运行。
二、全自动免疫组化染色仪的工作原理全自动免疫组化染色仪的工作原理可以分为以下几个步骤：1. 样本制备：将组织标本切片后，通过组织学处理方法，如脱水、脱脂、抗原修复等，使组织标本符合染色要求。
2. 抗体染色：将标本放置在染色盘中，通过试剂盘供应抗体溶液。
全自动免疫组化染色仪通过控制系统，精确控制抗体的投放量和时间，确保染色的准确性和一致性。
3. 洗涤：染色后，仪器自动进行洗涤步骤，以去除未结合的抗体。
4. 显色：通过试剂盘供应显色液，使已结合的抗体表现出可见的颜色反应。
5. 去色：洗去多余的显色液，使染色结果更加清晰。
6. 固定：通过试剂盘供应固定液，使染色结果稳定并防止褪色。
7. 观察和记录：将染色结果放置在显微镜下观察，并通过相机记录结果。
全自动免疫组化染色仪的高分辨率相机可以捕捉到细胞和组织的微观结构，为研究和诊断提供准确的图像数据。
三、全自动免疫组化染色仪的应用全自动免疫组化染色仪在医学研究和临床应用中具有广泛的应用价值。
它可以用于研究细胞和组织的免疫表型，帮助科学家了解细胞和组织的分子特征和功能。
同时，全自动免疫组化染色仪在病理诊断中也起到了重要的作用。
通过对组织标本的免疫染色，医生可以确定疾病类型、判断疾病的严重程度和预后，为患者的治疗提供准确的依据。
免疫组化显色系统-PPT精品文档
双染阻断剂
兔一抗接抗原2
兔EnV/AP接抗兔一抗
Fast Red(显色剂2)
EnVision二步法双染
• 主要实验流程
阻断内过氧化酶(S2019)
TBS冲洗(S1968)
一抗(1 Mo.)孵育 TBS冲洗(S1968)
TBS冲洗(S1968) 显色剂 1 DAB(K3467)
一抗(2 Rb.)孵育
苏木精复染(S3309)
二步法EnVision
特点: 二抗及酶通过葡聚糖连成一个大分子试剂(避开了传统 的生物素与链亲和素结合), 不受内源性生物素干扰. • 即用,方便,快速(两步). • 敏感性强. 背景低. • 是目前最理想的免疫组化显色系统 • 使用对象 • 可向所有做免疫组化的用户推荐.
免疫组化原理图标注解
抗原2 一抗 1 过氧化物酶 碱性磷酸酶 一抗 2
双染阻断剂
显色剂(棕色)葡聚糖骨架分子
组织抗原1
回顾过去
直接法
二步间接法
三步间接法
酶免疫复合物法
链亲和素-生物 素法(ABC)
目前常用的显色系统
• 一步法: EPOS ( Enhanced Polymer One-Step Staining) • 二步法: EnVision Systems • 双染: General Doublestain • 三步法: LSAB (Labeled Sstreptavidin-biotin) • 催化放大系统:CSA (Catalyzed Signal Amplication
System)
• 动物研究试剂盒: ARK
(Animal Research Kit)
一步法EPOS
• 原理: 在一抗上通过多聚骨架标记过氧化物酶. 即一抗上已标记过氧化物酶. 这种一抗与 抗原结合后即可直接显色.
免疫组化显色原理
免疫组化显色原理
免疫组化显色是指利用免疫学原理，通过特异性抗体与抗原之间
的结合，利用染料或物质标记来标示出目标蛋白质或细胞。
在免疫组
化显色中，常使用辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等标记
物质，并且利用色素反应的原理，对标记物质进行染色。
其中，HRP染色采用的是DAB（3-3’-二氨基联苯）染色法，AP染色则使用的是
NBT/BCIP（硝基蓝/四氯化磷杂蓝）染色法。
在DAB染色法中，HRP将DAB氧化成为可见的褐色沉淀物，这种
沉淀在组织中呈现出棕色或褐色，可以被光镜观察到。
而NBT/BCIP染
色法中，AP将NBT和BCIP还原成为可见的紫色颗粒物和暗蓝色沉淀物。
这两种染色法的选择，取决于使用的抗体和实验设计的需要。
免疫组织化学技术的原理及方法
❖单克隆抗体：针对某一抗原决定簇， 由单株淋巴细胞（克隆）所产生的 抗体
多克隆抗体与单多克隆抗体及其产生
多克隆抗体的产生
❖ 以纯化的抗原免疫动物而获得，实际上是针对多个抗原决定 簇的多个抗体组成，检测范围广。在病理诊断 中，有利划归 肿瘤的基本类型。
酶标亲和素
在AB复合物中，酶是标记 在生物素上，而后与亲和素 合成复合物。在标记的亲和 素-生物素方法中是将辣根 过氧化酶直接标记在亲和素 上，辣根过氧化酶与亲和素 间有极强的结合力，因此 LSAB法比ABC法更敏感
多聚物载体
1、 核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分 子，起到载体的作用
2、 一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗 和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种能 与二抗相联结的由HRP标记的多聚物
显示系统
辣根过氧化酶的免疫组化染色的反应过程: HRP + H2O2 →HRP·H2O2 →有色分子终末产
物+ HRP DAB（电子供体） HRP：酶 H2O2：底物 HRP·H2O2：酶·底物复合物
显示系统
免疫过氧化酶染色的多种方法中，其主要的不同点 在于显色系统的差异： ❖ 间接酶标法：利用标记于桥联抗体的酶 ❖ PAP法： 利用PAP复合物 ❖ ABC法： 利用AB复合物 ❖ LSAB法: 利用直接标记于亲和素的酶 ❖ EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物载体
标记抗体
1、在抗体上用化学方法联接某种标记物，目的是使抗原抗体 的结合能用肉眼观察到
2、标记物种类：荧光素：异硫氰酸荧光素或罗丹明 酶：辣根过氧化酶，碱性磷酸酶 金属离子：胶体金颗粒
3、标记的方法：化学性结合将降低抗体效价及标记物的活性， 从而使染色敏感性降低
免疫组化技术规范
6．检测系统：通用的检测系统有生物素标记的ABC、SP、LSAB等，此类检测系统较为经济，日前仍有不少医院在使用。非生物素类检测系统价钱较贵，由于不需通过生物素的结合，可以避免内源性生物素的干扰，其特点：敏感、省时、方便、背景低。
一、 免疫组化成功的要素
病理科医生要有相当的免疫组化诊断知识和免疫组化技术经验，要清楚认识免疫组化技术是一门实验性、技术性非常强的技术，要多了解多种抗体在组织中的表达情况，以及影响免疫组化结果的各种因素，只有提高医生的免疫组化诊断水平才能避免错误的判断，才能确保免疫组化诊断的准确性。病理技术人员是免疫组化实验成功的关键因素，操作人员要有丰富的免疫组化的理论知识及熟练的免疫组化染色技术，十分清楚每一个步骤的应用原理，使实验结果更具可靠性。可靠的实验试剂和实验方法是每个实验室的必备条件。由于实验方法多种多样，抗体的品种繁多，每个实验室都应当确保高质量高效价的试剂，并摸索出最佳的实验条件。优质的免疫组化取决于有效的抗原修复、敏感的检测系统、合适的实验质控对照及熟练和有责任心的技术人员。
2．固定：在众多的组织固定液中(如甲醛、乙醇、戊二醛、多聚甲醛 等)，不同的实验方法在使用上各有千秋。但在保持组织细胞结构的完整性、抗原可测定性、组织渗透性以及试剂的价格上，福尔马林是最好、既经济又通用。而含酸或含汞的固定液对抗原保存均不理想。组织离体后固定一般不要超过30分钟，在常温条件下固定时间为8-24小时。同时还要注意避免福尔马林过度固定造成的组织抗原丢失，有研究发现新鲜组织经过福尔马林一周固定后组织抗原丢失严重，抗原几乎不能被检测，因为组织固定后会引起蛋白或蛋白分子之间形成交联，导致抗原位点遮盖，可以通过抗原修复方法来修正，若加抗体前不采用抗原修复，则免疫组化染色常不能到达理想结果或不成功。组织同样不能长时间放置在70%的乙醇中，酒精固定后的组织形态不如福尔马林固定的组织。脱钙液对抗原破坏较为严重，因此在组织脱钙前最好在福尔马林液中固定48小时，若组织没有固定透则酸会破坏抗原，脱钙液中酸的浓度与脱钙时间都必须尽量控制在最低的限度。
免疫组化常用方法
标记生物素-抗生物素技术(Labelled Avidin-biotin technique,LAB技术)
2.差异大,注意厂家、批号
3.4C保存
Disadvantages of ABC
1.ABC的IP约为10,中性pH时带正电荷,容易与nucleus等带负电荷结构非特异结合.
2.Avidin是glycoprotein,与lectins等分子通过碳水化合物连接
•通过用streptavidin(抗生蛋白链霉素)代替avidin克服上述缺陷.
3.标本:不能太厚
4.封裱剂:无自发荧光,无色透明,pH8.5-9.5,常用甘油和0.5mol/L pH9.0-9.5碳酸盐缓冲液等量混合
5.镜油:无荧光镜油,或甘油或液体石蜡
2.Enzyme-Mediated Detection
直接法(Direct)
间接法(Indirect)
基本原理
•以间接法法为例
•阳性对照：已知阳性
•阴性对照：
1.已知阴性
2.空白对照BS代替特异性抗体
3.替代对照:用同种属正常血清代替特异性抗体
4.吸收实验:先用抗原吸收一抗
5.抑制实验:先用未标记抗体,再用标记抗体
6.置换实验:用无关的特异性抗体代替一抗
Antibody Detection
• There are several different methods that can be employed to detect antibodies bound to tissue, depending upon whether the label used is enzymatic or fluorescent.
几种免疫组化显色系统的选用与比较
第３６卷温卅Ｉ医学院学报第２期图１ＤＡＢ＋苏木素系统显色效果欠理想，背景非特异性着色明显（×１００）。
Ｆｉｇ．１ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆＤＡＢ＋Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｃｏｌｏｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗａｓｇｏｏｄ；ｉｎｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ，ｔｈｅｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｓｔａｉｎｗａｓｏｂｖｉｏｕｓｌｙ（Ｘ１００）．图２ＡＥＣ＋苏木素系统显示：胞浆阳性定位准确、清晰，与背景反差强（Ｘ２００）。
Ｆｉｇ．２ＡＥＣ＋ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｃｏｌｏｒａｔｉｏｎｓｙｓ＝ｓｈｏｗｅｄ：ｃｙｔｏｐｌａｓｍｗａｓｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｌｏｃａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｗａｓａｎｄｂｅｔｔｅｒｗｉｔｈｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ．ｆ×２００）．极强，但色彩强度略低；甲基绿复染后，虽两种色彩对比欠强，但阳性细胞仍能明显区分；核快红复染后色彩对比增强，阳性部位胞浆显示明显，背景无干扰（见图４）。
２．４几种显色系统的总体比较从显色时间，阳性部位定位，复染后背景干扰情况，显色剂和复染剂反差等进行综合比较（见表１）。
表１．显色系统的效果比较Ｔａｂｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｃｏｌｏｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ注：＋表示显色效果一般；＋＋表示中等；＋＋＋表示效果最好。
一表示不能组合使用３讨论为使免疫组化结果容易识别，我们用食管下端肌间神经丛（位于环形肌和纵行肌之间）的氮能神经元作为阳性细胞。
实验结果表明，同一组织，在抗体浓度、孵育时间等条件完全相同的情况下，选用不同显色系统后，其显色效果差异很大。
尤其是对一些弱表达的抗原，用常规ＤＡＢ＇ｆＥ难清晰显示出来，因此可能产生完全相反的结果［１］，也可能在某些组织与内外源性棕黄色颗粒难区分［引，同时，ＤＡＢ系统作为实验室最常用的免疫组化显色试剂，与本实验中所选用的几种显色系统比较，其显色效果欠理想。
ＡＥＣ＋苏木素系统和４一ＣＮ＋核快红系统显色效果最佳，但该类切片只能用水溶性封片剂封图３ＡＥＣ＋甲基绿系统中，胞浆阳性显示清晰，但背景细微结构显示差（×１００）。
免疫组化
ABC法
特点：三步法，敏感性较高，特异性强，
应用范围广，但 某些组织中存在高内
源性生物素干扰 Avidin与核酸及细胞膜
中磷脂有非特异反应
免疫组化基本步骤
1. 抗原修复（抗原暴露）
2.内源性过氧化物酶抑制 3. 酶标记体 7. DAB- H2O2显色
正常细胞核
致密浓染的凋亡细胞
2、丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细 胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细 胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细 胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
荧光素标记的刀豆蛋白A染色。绿色荧光 （外源性凝集素）勾勒出凋亡细胞表面的 小泡，红色荧光被包被在其中。
凋亡细胞核被YO-PRO-1绿染，坏死细胞被红染
四、流式细胞仪定量分析
（一）检测原理
细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加， 但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利 用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色， 利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度 来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。
利用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有 抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取 Hoecha染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细 胞主要摄取碘化丙啶（PI)而呈强的红色荧 光。
3、台盼蓝染色：
此方法可反映细胞膜的完整性以区别坏死
如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进 入细胞，细胞变蓝，即为坏死。
如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色， 则为正常细胞或凋亡细胞。
4、透射电镜观察
凋亡细胞表面微绒毛消失
核染色质固缩、边集，常呈新月形
核膜皱褶
胞质紧实，细胞器集中
胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体
HRP显色反应：
免疫组化实验流程及常见问题
免疫组化实验流程及常见问题1 免疫组化概念原理2 免疫组化染色步骤目录3 结果分析4 常见问题分析※免疫组化原理PART 1免疫组化概念原理※免疫组化样本种类免疫组化概念原理免疫组化学（immunohistochemistry，IHC）应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究样本种类：组织标本和细胞标本两大类，包括石蜡切片（IHC-P）和冰冻切片(IHC-P)，细胞片(ICC)。
※实验步骤流程图※样本取材固定PART 2免疫组化染色步骤※实验步骤讲解实验流程图种器官，优先取消化器官，其次取中枢神经系统器官(脑，脊髓等)，皮肤、肌肉等可放到最后取。
3.组织块大小：未经灌注的标本组织厚度不要超过1cm 。
5.固定液量：固定液体积为组织的10倍，且组织能在容器内自由移动，不贴壁不沉底，并做好清晰标记。
4.固定液：针对不同的标本特点及实验目的一定要选用正确的固定液，4%多聚甲醛，有致密外膜Carnoy 液，活检用Bouin 。
7.固定温度：常温即可，无需冷藏，切勿冷冻结冰，否则固定液结冰形成冰晶严重破坏组织形态结构6.固定时间：6-24h最佳，固定越久所需修复强度越大，容易出现非特异性。
取材及固定切片选择要保存简单--- 选石蜡片!要速度快---选冰冻片!要结构漂亮---选石蜡片!抗原不稳定---选冰冻片!抗原稳定---石蜡片冰冻片皆可!组织形态结构保存完好顺序：新鲜组织立即投入固定液内固定石蜡切片>组织-80°冷冻后投入固定液内固定石蜡切片>新鲜组织立即投入固定液内固定冰冻切片>组织-80°冷冻后直接冰冻切片。
切多厚?脱蜡步骤石蜡片3-8um ， 一般4-5um;冰冻片5- 15pm,一般8μm水温40-45 ℃, 组织平整后玻片有油漆的一面贴近组织向斜上方提起怎么捞片?烤多久?37 ℃ 过夜或 60 ℃ 1-2h 注意:使用防脱处理的玻片实验步骤切片烤片实验步骤：灭活1内源性过氧化物酶在血管瘤、肝、胎盘、阑尾炎,坏死区域和急性炎症组织含量较高 2显色系统为过氧化物酶 (HRP )系统，该步骤建议一定要做3碱性磷酸酶 (AP )系统以及免疫荧光，该步骤可以不做4在灭活时,如组织片中出现细小且密集的气泡，表示过氧化物酶含量过高，这时用 3%H2O2溶液难以完全阻断，可以用0.5%高碘酸溶液室温条件孵育10min实验步骤柠檬酸盐缓冲液( PH6.0 )和EDTA( PH8.0或9.0)修复液经验证，对于大多数的抗体来说后者使用效果更优固定时间越久，修复强度越强旧标本修复强度强于新鲜标本3修复液的选择1 抗原修复方式4消化酶的选择需格外注意的各种消化酶的最佳工作PH值2消化酶的选择抗体选择1单抗和多抗各有优势，按需选用2 一抗4°C孵育效果最佳，备选37 ℃ 1-2h 3二抗需与一抗的种属、类别或亚类相匹配，推荐驴，山羊,绵羊等种属4二抗/SABC -般37 ℃孵育30 min 封闭1 5%BSA是最常用2血清，效果最全面3封闭血清与抗同源，与一抗不能同源封片1 DAB显色用中性树胶封片2免疫荧光建议用抗荧光衰减封片剂3 AEC显色用水溶性封片剂显色1 DAB显色液现用现配2建议镜下控制反应时间3根据显色时间反向优化实验条件※抗原定位※结果分析方法PART 3结果分析抗原定位胞膜型表达胞核型表达胞质型表达胞膜-质型表达胞核-质型表达抗原定位查数据推荐：01 Option here02Option here 评分法:通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度( 0-3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色)、阳性范围进行评分(1-4分为0-25%、26 -50%、51-75%、76-100%) ，最终可以分数想加，再进行比较阳性着色细胞计数法:在40X光镜下,随机选择不重叠的3-5个视野，人工或机器计数阳性着色细胞和总细胞数，比较阳性细胞比率图片软件分析:通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用图片分析软件进行分析，然后进行统计分析即可H-SCORE分析:设置组织切片上所有的深棕色为强阳性，棕黄色为中度阳性，浅黄色为弱阳性，蓝色细胞核为阴性。