直接化学发光免疫分析用吖啶酯直接标记抗体抗原

自动化免疫浊度分析
一、免疫透射比浊法
（一）原理：
一定波长的入射光线通过抗原抗体反应后的溶液 时，被其中的免疫复合物微粒吸收、反射和折射而 减弱，在一定范围内，吸光度与免疫复合物量呈正 相关，而形成的免疫复合物量与参与反应的抗原和 抗体的量呈正相关。与已知浓度的抗原标准品比较， 可确定标本中抗原含量。
免疫自动化仪器分析技术
第一节 第Baidu Nhomakorabea节 第三节 第四节
免疫浊度测定的自动化分析 发光免疫测定的自动化分析 荧光免疫测定的自动化分析 酶联免疫测定的自动化分析
第一节免疫浊度测定的自动化分析
免疫浊度分析的基本原理是：抗原、抗体在特定的电解质溶 液中反应，形成小分子免疫复合物（<19S），在增浊剂（如PEG、 NaF等）的作用下，迅速形成免疫复合物微粒（>19S），使反应 液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复 合物量随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦随之增大，即 待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。
2. 抗原过量检测
(1) 抗体适当过量 (2) 对抗原过量进行阈值限定
定时散射比浊法测定原理示意图
(二)速率散射比浊法（rate nephelometry）
速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的动力学测 定法。连续测定各时间复合物形成的速率与其产生 的散射光信号联系在一起，形成动态的速率散射比 浊法，每项检测仅1～2min即可完成。
（二）仪器工作过程
1.将待检标本和抗原参考品作适当稀释。
2.将待测标本和标准抗原溶液（5个浓度抗原标准 品）与适当过量的抗血清混合，在一定条件下，抗 原抗体反应完成后，在340nm处测定各管吸光度。
3.按log-logit转换或y=ax3+bx2+cx+d方程进行曲线 拟合，制备剂量-反应曲线，由计算机处理，计算 出抗原浓度。
1. 仪器测定技术要点
• 检测分两时间进行： – ①预反应阶段----加少量样本与抗体反应，测定 第一次散射光信号（7.5-120s）； – ②反应阶段----加入全量待测样本，4分钟内测定 第二次散射光信号。
• 第二次散射光信号作为待测抗原与抗体形成复合物 颗粒产生的信号峰值，经计算机软件处理转换为待 测抗原浓度。
第十四章 临床免疫检验自动化分析
免疫检验自动化 （automation of immunoassays) 是将免疫学反应检测过程中的取样、加试剂、混合、 温育、固相载体分离、信号检测、数据处理、打印报 告和检测后的仪器清洗等步骤由计算机控制，自动化 进行。
• 20世纪50-80年代:免疫学检测主要是手工操作 • 20世纪80年代末:随着单克隆抗体技术、免疫标
（二）方法评价
本法敏感度大大高于普通比浊法，可达ng/L水平， 操作简便，易自动化；血清中的类风湿因子(RF)可 与IgG Fc段结合，使IgG致敏胶乳颗粒出现非特异 性凝集，用F(ab’)2片段代替IgG既可消除此干扰， 又可克服IgG致敏胶乳的自凝现象；免疫胶乳轻度 自凝或抗体活性降低会严重影响结果。
三、免疫散射比浊法
原理
粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子受到光 线照射后，微粒子对光线产生反射和折射而形成散 射光。悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒 的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等 因素密切相关，其公式如下：
Iθ＝ I0［4π2（dn/dc) 2 Mc(1+cosθ)］ Nγ2λ4
记技术以及计算机技术的出现，自动化免疫分析 技术引入临床
- 提高检测灵敏度，增加检测项目 - 缩短检测时间 - 提高实验结果的精确度和准确度
自动化免疫分析仪的共同特点
主机系统
样本处理 系统
试剂 系统
温育反应 系统
信号检测 系统
计算机系统
自动稀释 自动进样 自动清洗
信号处理及 数字转换
信号储存 分析报告
（三）方法评价
优点: 灵敏度高，稳定性好，操作简便，结果准确
不足: ①抗体用量较大； ②溶液中存在的抗原－抗体复合物分子应足够大 ③透射比浊测定在抗原－抗体反应的第二阶段，检 测需在抗原抗体反应达到平衡后进行，耗时较长。
二、免疫胶乳比浊法
（一）原理：
用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒（一般为0.2 μm）， 在遇到相应抗原时，胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳 颗粒凝聚 ，使透射光和散射光即出现显著变化。如图所示：a为单 个胶乳颗粒不阻碍光线透过，b为抗原抗体结合形成的凝聚胶乳大颗 粒使透射光减弱或散射光增强。
• 速率-----指抗原抗体结合反应过程中，每一单 位时间内两者结合的速度。
抗原抗体复合物形成表
累积时间（秒）
复合物形成的量
形成速率值
5
8
-
10
13
5
15
25
12
20
60
35
25
150
90
30
230
80
35
300
免疫散射比浊法
• 定时散射比浊法 • 速率散射比浊法
(一)定时散射比浊法（fixed time nephelometry）
定时散射比浊法是在保证抗体过量的情况下，加入 待测抗原，此时反应立即开始，在反应的第一阶段， 溶液中产生的散射光信号波动较大，所获取的信号 计算出的结果会产生一定的误差。定时散射比浊法 是避开抗原抗体反应的不稳定阶段，即散射光信号 在开始反应7.5s～2min内的第一次读数，专门在抗 原抗体反应的最佳时段进行读数，将检测误差降到 最低。
式I θ中为与入射光成θ角处散射光强度；λ和I0为入 射光的波长和强度；dn/dc为校正因子，反映了溶液折 射指数和颗粒浓度的变化；M为颗粒分子量；c为浓度； N为阿佛加德指数；γ为颗粒到检测器的距离；θ为散 射光与入射光的夹角（散射夹角）。
散射颗粒与散射光
• 两种散射：Rayleigh-散射（颗粒直径<<入射光波长: 均匀散射）、Mile-散射（颗粒直径≈或>入射光波长: 不均匀散射）
• 大多数蛋白质分子直径比光波长小很多，因而只产 生Rayleigh-散射
• Rayleigh散射：散射光的强度与复合物的量呈正比、 与入射光波长成反比。
• 散射免疫比浊分析时一定要保持抗体过量，以维持 抗原抗体复合物的相对不溶解性；
• 测定的散射信号值应在曲线的上升臂部位，浊度信 号与待测抗原量呈正比。