柴胡皂苷合成途径中三个关键酶基因片段的克隆与序列分析
收稿日期：２００８＿０７一１４
基焦磷酸酯（ＤＭＡＰＰ），然后向ＤＭＡＰＰ上逐个添加
修回日期：２００８－－０９—１５
★
国家科技支撑计划重点项目（２００６ＢＡｌ０９ＢＯ！）：生物技术与中药材优良品种选育研究，负责人：魏建和；国家中医药管理局科技专项
（２００４ＺＸ０６－３）：北柴胡、丹参、川贝母种子种苗质量标准化、规范化示范研究，负责人：陈士林。 ★★ 联系人：魏建和，研究员，主要研究方向：药用植物基因资源及分子育种研究。Ｔｅｌ：０１０－６２８１８８４１，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｊｉａｎｈ＠２６３．ｎｅｔ；刘玉军，教授，主要
堕噬童隆
利用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取的北柴胡根尖的总ＲＮＡ为
模板，经ＲＴ—ＰＣＲ后，凝胶电泳显示得到４７０ｂｐ、 ５３０ｂｐ及４６０ｂｐ左右的ＰＣＲ产物（图２）。ＰＣＲ片段纯 化后，连接到ＰＭＤｌ９一Ｔ载体上，蓝白斑筛选获得阳 性转化子，进一步提取质粒，用原引物进行ＰＣＲ扩 增，再用位于克隆位点两侧的限制酶切出插入片段， 与ＰＣＲ扩增产物作电泳比较，结果初步证明这些 ＰＣＲ扩增片段已被成功克隆。将此阳性克隆测序，结
司，ＡＭＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ购自日本博日公司，内 切酶为美国ＮＥＢ产品。
二、方法
１．北柴胡根总ＲＮＡ提取 由于北柴胡根中含的多糖及次生物质较多，因 此北柴胡总ＲＮＡ的提取采用本实验室改进的ｔｒｉｚｏｌ 方法。（１）取ｌＯＯｍｇ北柴胡的幼嫩根，液氮速冻后研 磨成粉末，移入１．５ｍＬ预先冷却的离心管。（２）力１１人 ｌｍＬ ｔｒｉｚｏｌ试剂，轻轻摇匀，室温放置５ｍｉｎ。（３）再次 混匀后于１２０００ｘｇ、４。Ｃ离心１０ｍｉｎ。（４）取上清液，加 入ｌＯＯｍＬ ５ｍｏｌ／Ｌ Ｎａｃｌ，轻轻摇匀，再加３００ｍＬ的酚一 氯仿一异戊醇（２５：２４：１），混匀后于１２０００ｘｇ、４０Ｃ离心 ｌＯｍｉｎ。（５）将上层水相转移至另一离心管中，加入 ３００ｍＬ的酚一氯仿一异戊醇（２５：２４：１），重复抽提一次。 （６）取上清液，加两倍体积的无水乙醇，混匀，室温放 置ｌＯｍｉｎ。（７）１２０００ｘｇ、４。Ｃ离心１０ｍｉｎ。（７）弃去上清 液，沉淀用７０％乙醇洗两次，室温下干燥１０ｍｉｎ。（８） 沉淀溶于２０１ｘＬ ＤＥＰＣ水中，取３１ｘＬ用于１％的琼脂 糖凝胶电泳检测，其余一８０℃冰箱中保存备用。 ２．引物设计与合成 引物的设计依据其它植物的ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ、ＦＰＳ 基因的保守序列，并参照Ｋｉｍ等【４１发表的引物序列设 计。ＨＭＧＲ基因上游引物Ｈ１为：５’一ＧＧＴＧＡＴＧ— ＣＡＡＴＧＧＧＡＡＴＧＡＡｃＡＴＧ一３’．下游弓Ｉ物Ｈ２为：５ ７一 Ｇ７ＩＴＩ’ＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧ７Ｉ＇ＡＣＣＡＡＣＣＴ一３’；ＩＰＰＩ基因上 游引物１１为：５ ７一ＣＡＡＡＴＡＴＡＡＴＦＧＴＣＡＴＣＴＧＡＴＧＧＡ Ａ一３’，下游引物１２为：５’一ＣＣＡＣＣＡＣｒｌｌＷＡＷＣＡＡ— ＧＡＡＡＴＹＧＴＣ一３’；ＦＰＳ基因上游引物Ｆｌ为：５ ７一 ＣＴＹＧＧＴＹＧＧＴＧＹＡＴｒＧＡＡＴＧＧＣＴ一３’，下游引物·Ｆ２ 为：５ ７一ＣＡＴＣＣＴＧＡＡＣＴｒＧＡＡＡＧＴＡＧＲＴＴＣＣＣＡ一３ ７。 引物的合成由北京博迈德科技发展有限公司完成。 ３．ＲＴ—ＰＣＲ反应体系及扩增条件 （１）ｃＤＮＡ第一链的合成。 将２斗Ｌ ＲＮＡ和基因（ＨＭＧＲ／ＩＰＰＩ／ＦＰＳ）下游引物 １斗Ｌ（１０斗ｍｏｌ，Ｌ）于７０。Ｃ水浴１０ ｍｉｎ打开其二级结构， 立即插入冰中１０ ｍｉｎ，依次加入４／ｘＬ ｄＮＴＰ（２．５ｒｅｔｏｏｌ／ Ｌ），１¨Ｌ１０ ｘＡＭＶ Ｂｕｆｆｅｒ，０．２５斗Ｌ ＲＮａｓｉｎ（４０Ｕ／斗Ｌ），
整性。进一步通过紫外分光光度法测得吸光度（Ａ） 值，Ａ２６０／Ａ２８０比值介于１．８～２．０，表明总ＲＮＡ纯度 较高，酚类、多糖、蛋白质和无机盐等杂质已基本去 除干净。此提取方法提取时间仅为１．５ｄ左右，大大提 高了提取效率，降低了ｍＲＮＡ降解的风险。
２．皇垦錾翅丛丛Ｑ照，！￡堕，￡堕基因璺旦ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ△塑！兰筮
（３）ＰＣＲ反应条件。 ９５℃预变性５ｍｉｎ；然后９４℃变性３０ｓ。退火３０ｓ （ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ、ＦＰｓ基因的退火温度分别为５７℃、 ５５．８℃、４５．８℃），７２℃延伸２ｍｉｎ，３５个循环；最后７２℃ 延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物用ｌ％的琼脂糖凝胶电泳检测。 （４）ＰＣＲ产物回收、克隆及序列测定。 ＰＣＲ产物经ｌ％琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片 段，用胶回收试剂盒经回收纯化后与ＰＭＤｌ９一Ｔ载体 在１６℃下连接过夜，将连接产物转化入Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ｅｔ 感受态细胞中。在ＬＢ／ＡＭＰ／ＩＰｒＧ／Ｘ—Ｇａｌ平板上筛选 阳性克隆，然后随机挑选５个白斑菌落和一个蓝斑 菌落，抽提质粒ＤＮＡ，对质粒ＤＮＡ进行双酶切鉴定、 ＰＣＲ鉴定和蓝白斑质粒ＤＮＡ比较鉴定。鉴定结果为 阳性克隆的用于测序，测序工作由北京三博远志生 物技术有限责任公司完成。 （５）序列分析。 将所测定的序列结果通过ＢＬＡＳＴ搜索Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）的蛋白质 和核苷酸数据库，将所测序列通过ＤＮＡＭＡＮ软件寻 找最大读码框，翻译成氨基酸序列并与其他植物的 ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ、ＦＰＳ基因的氨基酸序列进行多重比较。 特征序列查找及分子系统进化分析也是通过ＤＮＡ— ＭＡＮ软件完成。
关键词：北柴胡 柴胡皂苷３一羟基一３甲基戊二酰辅酶Ａ还原酶（ＨＭＧＲ） 异戊烯基焦磷酸异 构酶（ＩＰＰＩ） 法尼基焦磷酸合酶（ＦＰＳ）
甲羟戊酸（ＭＶＡ）途径是植物体内合成萜类的主 的条件下可催化３一羟基一３甲基戊二酰辅酶Ａ生成
要途径。３一羟基一３甲基戊二酰辅酶Ａ还原酶（３一 ＭＶＡ。由ＭＶＡ形成的异戊烯焦磷酸（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ
研究方向：药用植物学，Ｔｅｌ：０１０－６２３３７８５５，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｊｈｕｂｉｏ＠１６３．ｃｏｍ。
万方数据
［‰枷Ｓｃ／ｅｎｅｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ｍｏｄｅｒｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ】５６
２００８第十卷第五期－ｒＶ０１．１０ Ｎｏ．５
一、材料与试剂
１．丝盘 本试验所用材料采自中国医学科学院药用植物 研究所试验田中栽种的北柴胡品种“中柴Ｉ号”。采 集一年生北柴胡盛花期的幼嫩根，用锡箔纸迅速包 好后，冻存于液氮中。 ２．达 型 Ｔｆｉｚｏｌ试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，Ｂ型小量胶回收 纯化试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责 任公司，Ｅｘ Ｔａｑ酶、ｐＭＤｌ９一Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ购自ＴａＫａＲａ公
５７［Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ∥Ｍｏｄｅｒｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ］
万方数据
世界科学技术一中医药现代化★基础研究
０．５１ｘＬ ＡＭＶ逆转录酶（５Ｕ／ｔｒＬ），用ＤＥＰＣ水补齐至 １０Ｌ体系。４２℃温育４０ｍｉｎ后于一２０℃存放。
北柴胡（Ｂｕｐｌｅｕｒｕｍ ｅｈｉｎｅｎｓｅ ＤＣ．）为伞形科柴胡 属植物，是药用柴胡的主要来源之一，其中所含的 主要有效成分柴胡皂苷类具有抗炎、保肝利胆、抗 菌、抗病毒、抗肿瘤、降低血压等作用”引。柴胡皂苷 是一种齐墩果烷类型的ｉ萜化合物，虽然其生物合 成途径到目前为止并不清楚，但Ｋｉｍ等１４１通过三岛 柴胡毛状根研究ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ和ＦＰＳ基因表达水平 与柴胡皂苷含量的关系时发现在用３倍的毛状根 培养基培养时，ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ、ＦＰＳ基因的表达水平与 柴胡皂苷的含量都迅速提高。除此之外，关于柴胡 皂苷合成途径的研究还很不深入，这些关键酶基因 在柴胡植株内的表达及功能尚不清楚。到目前为 止，还未见关于从北柴胡中克隆ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ和ＦＰＳ 基因的报道。本文采用ＲＴ—ＰＣＲ方法首次从北柴胡 植株中克隆了ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ和ＦＰＳ基因核心ｃＤＮＡ 片段，并进行了初步的序列分析，对从分子水平上 探讨三萜皂苷生物合成机制具有重要意义，为进一 步研究关键酶基因的表达特征和柴胡皂苷的代谢 调控打下了基础。
本文经编委遴选，英文版将通过ＳｃｉｅｎｃｅＤｉｒｅｃｔ全球发行。
摘要：本文以北柴胡幼嫩根的总ＲＮＡ为模板，通过ＲＴ—ＰＣＲ方法，克隆出３一羟基一３甲基戊二 酰辅酶Ａ还原酶（３－ｈｙｄｒｏｘｙ一３一ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＨＭＧＲ）、异戊烯基焦磷酸异构酶 （ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＩＰＰＩ）和法尼基焦磷酸合酶（ｆａｒｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＦＰＳ）基因 的ｃＤＮＡ片断，大小分别为４７０ｂｐ、５３２ｂｐ、４６６ｂｐ，分别编码１５７、１７７、１５５个氨基酸多肽。提交到Ｇｅｎ— Ｂａｎｋ上，得到登陆号分别为：ＨＭＧＲ（ＥＵ４００２１７）、ＩＰＰＩ（ＥＵ４００２１８）、ＦＰＳ（ＥＵ４００２１９）。ＮＣＢＩ在线ｂｌａｓｔ 结果表明，推断的北柴胡ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ和ＦＰＳ基因的氨基酸序列分别与杜仲、三岛柴胡和雷公藤的一 致性最高，分别为９３％、９９％、９７％。对ＨＭＧＲ基因和ＦＰＳ基因进行特征性保守域分析，结果显示，推 断的ＨＭＧＲ氨基酸序列存在两个ＮＡＤＰＨ结合基序，ＦＰＳ存在三个特征性保守序列：ＤＤＩＭＤ、ＧＱＭＩＤ 和ＫＬ。构建的植物ＩＰＰｌ的分子进化树表明，北柴胡ＩＰＰＩ基因与伞形科植物（胡萝卜和三岛柴胡）亲缘 关系最近，与单子叶植物（玉米和水稻）亲缘关系较远。本文首次分离报道了北柴胡柴胡皂苷合成途径 中三个关键酶基因（ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ和ＦＰＳ）ｃＤＮＡ的克隆，新获得的基因片段序列为进一步克隆全序列 和了解调控柴胡皂苷的生物合成奠定了基础。
（２）ＰＣＲ扩增。 ＰＣＲ扩增总的反应体系为２５１山Ｌ，其中１０ｘＥｘ Ｔａｇ ｂｕｆｆｅｒ（含Ｍ９２＋）２．５１ｘＬ，２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ２恤Ｌ，１０ ｍｏｌ／Ｌ上、下游引物各ｌｌｘＬ，模板ｃＤＮＡ第一链２斗Ｌ， ５Ｕ／“Ｌ Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶０．２斗Ｌ，重蒸超纯水
１６．３斗Ｌ。
30多种皂苷成份
皂苷是一类具有广泛生物活性的天然化合物，它们在植物界中分布广泛，尤其在许多中草药和食用植物中含量丰富。
至今，科学家们已经从各种植物中分离出了30多种皂苷成分，这些成分因其独特的结构和生物活性而备受关注。
以下将对这些皂苷成分进行详细的介绍和探讨。
一、皂苷的概述皂苷是一类具有表面活性的化合物，其分子结构中含有糖基和苷元两部分。
糖基部分通常是由葡萄糖、半乳糖等单糖组成的多糖链，而苷元部分则是由甾体、三萜等化合物构成的。
这种特殊的结构使得皂苷具有降低水溶液表面张力的能力，从而产生泡沫，因此皂苷也被称为皂素。
二、皂苷的种类与功能1. 人参皂苷：人参皂苷是从人参中提取的一类重要活性成分，具有多种药理作用。
如人参皂苷Rg1、Rb1等能够增强免疫力、改善心血管功能、抗衰老等。
此外，人参皂苷还具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等作用，对于多种疾病的治疗和预防具有积极意义。
2. 薯蓣皂苷：薯蓣皂苷是从薯蓣科植物中提取的一类皂苷成分，具有显著的降血脂、抗动脉粥样硬化等作用。
薯蓣皂苷能够降低血液中的胆固醇和甘油三酯水平，减少脂质在血管壁的沉积，从而预防心血管疾病的发生。
3. 柴胡皂苷：柴胡皂苷是从柴胡中提取的一类活性成分，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等作用。
柴胡皂苷能够调节免疫系统功能，增强机体对病原体的抵抗能力，对于感冒、肝炎等疾病的治疗具有显著效果。
4. 七叶皂苷：七叶皂苷是从七叶树中提取的一类皂苷成分，具有抗炎、抗渗出、消肿胀等作用。
七叶皂苷能够促进血液循环，改善微循环障碍，对于静脉曲张、痔疮等疾病的治疗具有积极意义。
除了上述几种皂苷外，还有许多其他类型的皂苷成分，如甘草皂苷、知母皂苷、远志皂苷等。
这些皂苷成分在植物中的含量和种类因植物种类和生长环境的不同而有所差异。
三、皂苷的生物合成与提取方法皂苷的生物合成是一个复杂的过程，涉及多个酶促反应和基因调控。
在植物体内，皂苷的合成主要发生在细胞质和质体中，通过一系列的酶促反应将前体物质转化为皂苷成分。
实验五、柴胡中皂苷类成分的提取、分离和鉴定
实验五、柴胡中皂苷类成分的提取、分离和鉴定一、实验目的1.掌握柴胡中总皂苷的提取分离方法及操作2.熟悉三萜皂苷类化合物的检识及鉴定方法二、实验原理柴胡是伞形科柴胡属植物柴胡干燥的根，是我国传统中药中重要和常用的药材。
我国药典规定北柴胡(Bupleurum chinenseDC．)和狭叶柴胡(Bupleurumscorzonerifolium Willd．)为正品供药用。
我国柴胡资源极其丰富，主要分布于我国的陕西、内蒙古、甘肃、青海、宁夏、河北等地。
柴胡是柴胡滴丸，小柴胡汤等中药产品的主要成分。
研究发现柴胡皂苷具有解表和里疏肝解郁、升举阳气之功效。
一、柴胡化学成分柴胡的化学成分比较复杂，除含皂苷、挥发油，尚含有黄酮、多元醇、植物甾醇、香豆素、脂肪酸成分1等有效成分，尤其以柴胡皂苷为主。
迄今为止，从柴胡根、种子的不同部位中已分离到50多种单体皂苷成分。
这些皂苷成分有a、c、d、b1、b2、b3、b4等，其中以皂苷a、d的生物活性最为显著。
（柴胡中主要含有柴胡皂苷a、c、d）1.皂苷a（C42H68O13）物理性质：本品为结晶粉末，易溶于水，稀醇，特别是热水和热醇，在丁醇和戊醇中溶解性大，难溶或不溶于苯，乙醚，氯仿等溶剂。
化学反应：Molish 反应阳性，Lieberman-Burchard 反应产生紫色。
2.皂苷c（C48H78O17 ）物理性质：易溶于水，稀醇，特别是热水和热醇，在丁醇和戊醇中溶解性大，难溶或不溶于苯，乙醚，氯仿等溶剂。
化学性质：Molish 反应阳性，Lieberman-Burchard 反应产生紫色。
3.皂苷d（C42H68O13 ）物理性质：白色粉末，易溶于热水、稀醇、热甲醇和热乙醇。
化学性质：Molish 反应阳性，Lieberman-Burchard 反应产生紫色三萜皂苷类，由于糖分子的引入，使极性增大，可溶于水，易溶于热水、稀醇、热甲醇和热乙醇中，几乎不溶于或难溶于丙酮、乙醚以及石油醚等极性小的有机溶剂。
柴胡皂苷吸收、聚集特性及隐性柴胡皂苷的研究
柴胡皂苷吸收、聚集特性及隐性柴胡皂苷的研究柴胡皂苷吸收、聚集特性及隐性柴胡皂苷的研究柴胡皂苷是一类重要的有效成分，广泛存在于柴胡植物中，并具有多种药理活性。
对柴胡皂苷的吸收、聚集特性以及隐性柴胡皂苷的研究已成为近年来药学和生物医学领域的热点研究内容。
首先，我们来探讨柴胡皂苷的吸收特性。
研究表明，柴胡皂苷可以通过口服、注射、皮肤渗透等途径被人体吸收。
口服是最常见的给药途径，柴胡皂苷在胃肠道中可以进行被动扩散、主动转运等吸收方式，其中活性转运是一种重要的途径。
柴胡皂苷在胃肠道中吸收不完全，主要原因是其分子结构复杂、极性较大，导致其在胃肠道腔内和黏膜下层聚集，形成粘附。
此外，肝脏对柴胡皂苷的吸收也有一定的影响，肝细胞具有较强的吸收和代谢能力，柴胡皂苷在通过肝脏时可能发生代谢转化。
其次，让我们了解柴胡皂苷的聚集特性。
柴胡皂苷具有亲油性和亲水性的双重亲性特点，这是由其分子结构中两个部分组成的。
柴胡皂苷中的脂溶性醇基团能与疏水性官能团结合，使其具有较好的亲油性；而醛缩基团则使其具有较好的亲水性。
这种亲油性和亲水性的双重特性使得柴胡皂苷在生物体内具有一定的聚集能力。
研究发现，柴胡皂苷在水溶液中可以形成各种聚集态，如胶束、尸体、微粒等，这些聚集态对其在体内的吸收、分布、代谢和药效均具有重要影响。
最后，我们来讨论隐性柴胡皂苷的研究。
隐性柴胡皂苷是指体内代谢后形成的柴胡皂苷代谢物。
研究发现，柴胡皂苷经过代谢转化后，可以形成多种隐性柴胡皂苷，其中以柴胡皂苷的醛缩基团与多种代谢酶反应而生成的醛缩衍生物最为常见。
隐性柴胡皂苷在体内具有较好的稳定性，对柴胡皂苷的药效、毒性和代谢途径研究具有重要意义。
此外，隐性柴胡皂苷可能对柴胡皂苷的疗效产生影响，因此对隐性柴胡皂苷进行深入研究有助于揭示柴胡皂苷的作用机制和药效评价。
综上所述，柴胡皂苷的吸收、聚集特性以及隐性柴胡皂苷的研究是目前药学和生物医学领域的热点研究内容。
深入探究柴胡皂苷的吸收、聚集机制以及隐性柴胡皂苷的代谢途径对于揭示柴胡皂苷的作用机制和药效评价具有重要意义，有助于进一步开发和利用柴胡皂苷的药理活性综上所述，柴胡皂苷具有较好的亲油性和亲水性，使其在生物体内具有聚集能力。
柴胡中皂苷类成分的提取分离和鉴定
柴胡中皂苷类成分的提取、分离和鉴定一、实验目的1.掌握柴胡中总皂苷的提取分离方法及操作2.熟悉三萜皂苷类化合物的检识及鉴定方法二、实验原理柴胡是伞形科柴胡属植物柴胡干燥的根，是我国传统中药中重要和常用的药材。
我国药典规定北柴胡(Bupleurum chinenseDC．)和狭叶柴胡(Bupleurumscorzonerifolium Willd．)为正品供药用。
我国柴胡资源极其丰富，主要分布于我国的陕西、内蒙古、甘肃、青海、宁夏、河北等地。
柴胡是柴胡滴丸，小柴胡汤等中药产品的主要成分。
研究发现柴胡皂苷具有解表和里疏肝解郁、升举阳气之功效。
一、柴胡化学成分柴胡的化学成分比较复杂，除含皂苷、挥发油，尚含有黄酮、多元醇、植物甾醇、香豆素、脂肪酸成分1等有效成分，尤其以柴胡皂苷为主。
迄今为止，从柴胡根、种子的不同部位中已分离到50多种单体皂苷成分。
这些皂苷成分有a、c、d、b1、b2、b3、b4等，其中以皂苷a、d的生物活性最为显著。
（柴胡中主要含有柴胡皂苷a、c、d）1.皂苷a（C42H68O13）物理性质：本品为结晶粉末，易溶于水，稀醇，特别是热水和热醇，在丁醇和戊醇中溶解性大，难溶或不溶于苯，乙醚，氯仿等溶剂。
化学反应：Molish 反应阳性，Lieberman-Burchard 反应产生紫色。
2.皂苷c（C48H78O17 ）物理性质：易溶于水，稀醇，特别是热水和热醇，在丁醇和戊醇中溶解性大，难溶或不溶于苯，乙醚，氯仿等溶剂。
化学性质：Molish 反应阳性，Lieberman-Burchard 反应产生紫色。
3.皂苷d（C42H68O13 ）物理性质：白色粉末，易溶于热水、稀醇、热甲醇和热乙醇。
化学性质：Molish 反应阳性，Lieberman-Burchard 反应产生紫色三萜皂苷类，由于糖分子的引入，使极性增大，可溶于水，易溶于热水、稀醇、热甲醇和热乙醇中，几乎不溶于或难溶于丙酮、乙醚以及石油醚等极性小的有机溶剂。
柴胡皂苷的提取与结构鉴定
天然药物化学课程实验柴胡皂苷的提取及结构鉴定XXXXXXXXXXXX柴胡皂苷⏹【产品名称】柴胡提取物⏹【英文名称】Radix Stellaviae⏹【拉丁名称】Radix Bupleuri⏹【来源】本品为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzoner-ifolium Willd.的干燥根。
按性状不同，分别习称“北柴胡”及“南柴胡”。
春、秋二季采挖，除去茎叶及泥沙，干燥。
⏹【功能主治】和解表里，疏肝，升阳。
用于感冒发热，寒热往来，胸胁胀痛，月经不调，子官脱垂，脱肛。
柴胡皂苷理化性质⏹ 1.物理性质三萜皂苷分子大，不易结晶，大多数为白色或乳白色无定形粉末，仅少数为结晶体，皂苷元大多有完好的结晶。
皂苷多数为具有苦味和辛辣味，且多具有吸湿性。
三萜皂苷有降低水溶液表面张力的作用，其水溶液经常强烈振摇能产生持久性泡沫，不因加热而消失。
三萜皂苷的熔点都很高，常在熔融前分解，分解点多在200℃-300℃之间。
⏹ 2.溶解度三萜皂苷一般可溶于水，易溶于热水、含水稀醇、热甲醇和热乙醇中，几乎不溶或难溶于丙酮、乙醚、苯等有机溶剂。
皂苷在正丁醇或戊醇提取皂苷，可使之与亲水性杂质分离。
三萜皂苷元能溶于石油醚、苯、乙醚、三氯甲烷等有机溶剂，而不溶于水。
⏹3.金属盐类反应三萜皂苷的水溶液可与一些金属盐类，如铅盐、钡盐、铜盐等产生沉淀。
酸性皂苷水溶液，加入中性盐类即生成沉淀；中性皂苷水溶液则需加入碱式醋酸铅或氢氧化钡等碱性盐类才能产生沉淀。
⏹4.显色反应三萜皂苷在无水条件下，与强酸（硫酸、磷酸、高氯酸）、中强酸（三氯乙酸）或Lewis酸（氯化锌、三氯化锑）作用，会出现一系列显色变化或荧光。
⏹5.光谱特征除少数化合物如甘草酸、远志皂苷等外，大多数三萜化合物无明显的紫外吸收或仅在200 nm附近有末端吸收柴胡皂苷的现代药理综述⏹1对中枢神经系统作用1．1抗惊厥作用1 . 2抗癫痫作用⏹2抗肿瘤作用⏹3护肝作用⏹4抗炎、免疫抑制作用⏹5促胰腺腺泡酶分泌作用柴胡皂苷的提取⏹取一定量的北柴胡根部干粉，加入70％乙醇浸泡3 d，纱布滤纸过滤后收集滤液，滤渣继续重复上述操作2次，最后合并3次所得的滤液。
柴胡皂苷a药理学研究进展
D01：10. 13193/j.issn. 1673-7717.2021.04.007柴胡皂苷a药理学研究进展程玉鹏，姜丽丽，王语哲，仁朋英，高宁，王博(黑龙江中医药大学药学院，黑龙江哈尔滨150040)摘要：柴胡是我国传统中药，其正品为伞形科植物柴胡或狭叶柴胡的干燥根。
由于柴胡广泛的药理活性及临床应用范围，使得关于柴胡及其有效成分的研究受到广泛重视。
柴胡皂苷a是从柴胡中分离得到的具有多种药理活性的天然化合物，在抗肿瘤、抗炎、抗癫痫、保肝护肝等方面均展现出良好的应用前景。
基于C N K I与ISI W e b of K n o w l e d g e数据库查找及追溯了近年来关于柴胡皂苷a的最新研究文献报道，归纳总结了其药理学研究进展，以期为相关研究人员提供参 考。
关键词：柴胡；天然产物；抗肿瘤；抗炎；抗癫痫中图分类号：R285 文献标志码:A文章编号：1673-7717(2021 )04-0024>04Research Progress on Pharmacology of Saikosaponin aC H E N G Y u p e n g,J I A N G Lili,W A N G Y u z h e,R E N Pengying,G A O N i n g,W A N G B o(Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150040 ,Heilongjiang, China)Abstract ：C h a i h u(Bupleuri R a dix),a traditional Chinese herb,i s the dried root of Chaihu(Bupleurum chinense D C.or Bup-leurum scorzonerifolium Willd. ).T h e research on C h aihu(Bupleuri Radix)and i t s bioactive c o m p o u n d s have been receiving garnered plenty of attention,for a wide range of pharmacological and clinical applications.Saikosaponin a,isolated from Chaihu (Bupleuri R a dix),is a kind of natural c o m p o u n d s with m a n y pharmacological activities.There were reports of saikosaponin a a-bout anti- t u mor,anti- inflammatory,anti- epilepsy,liver protection and so o n.Based on C N K I and ISI W e b of knowledge database,this paper searched and traced the latest literature on pharmacology of saikosaponin a and m a d e a s u m m a r y,in order to provide reference for researchers.Keywords：C h a i h u( Bupleuri R a dix)；natural product；anti- tumor；anti- inflammatory；anti- epilepsy柴胡阜苷a(saikosaponin a,S S a)是中药柴胡的主要有效成分之一，其结构为五环三萜类齐墩果烷型衍生物，分子式为C42 H6s〇13,分子量781 g/m o l，其与柴胡皂苷d互为异构体,区别在 于柴胡皂苷a的16位羟基是p构型，柴胡皂苷d在相应位点 为a构型（图I ),《中华人民共和国药典》m将柴胡皂苷SSa 的含量作为柴胡质量标准的重要指标，对于S S a的药效作用研 究也受到广泛关注。
柴胡皂苷合成途径中三个关键酶基因片段的克隆与序列分析
构酶 （Ｐ Ｉ 法尼 基 焦磷 酸合 酶 （ Ｐ ） ＩＰ ） Ｆ Ｓ
甲羟戊 酸（ Ｖ ） Ｍ Ａ 途径 是植物体 内合成萜类 的主 要 途 径 。３ 羟 基 一 一 ３甲基 戊 二 酰 辅 酶 Ａ 还 原 酶 （ 一 ３
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二 、方 法 １ 北 柴 胡根 总 Ｒ Ａ提 取 ． Ｎ
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２ ０ 第十卷 ０８
第五期 ★ｖ １ ０ Ｎ ． ｏ． ｏ５ １
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现碳链延 伸 ，而是 首先通过异 构反应形成 甲基丙稀
实验五柴胡中皂苷类成分的提取分离和鉴定
实验五柴胡中皂苷类成分的提取分离和鉴定引言：柴胡是一种传统中药，在中医学中广泛应用。
柴胡中的皂苷类成分具有广泛的药理活性，对于抗炎、镇痛、抗肿瘤等具有显著的疗效。
本实验旨在提取、分离和鉴定柴胡中的皂苷类成分。
材料与方法：材料：柴胡片、乙醇、正己烷、二甲基亚砜、石油醚、甲醇、氯仿、醋酸乙酯、硅胶、碘化钾、浓盐酸等。
方法：Step 1: 提取柴胡中的皂苷类成分1.将柴胡片研磨成粉末状；2.取适量的柴胡片粉末，用乙醇进行粉碎提取，反复浸提2次；3.将乙醇提取液浓缩至干燥，得到柴胡粗提物。
Step 2: 分离皂苷类成分1.将柴胡粗提物溶解在正己烷中，得到类皂苷的正己烷溶液；2.将正己烷溶液与等量的二甲基亚砜混合，振荡均匀；3.分液，得到上层的正己烷相和下层的二甲基亚砜相；4.重复步骤2和步骤3，直到得到等体积的正己烷相。
Step 3: 鉴定皂苷类成分1.取等体积的正己烷相，用石油醚进行溶解；2.取少量石油醚溶液，加入甲醇和硅胶，搅拌均匀，制备薄层色谱板；3.将制备好的薄层色谱板置于色谱槽中，加入溶剂系统（如正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水），进行上样和上色；4.开始显色后，取出色谱板，用碘化钾溶液进行喷雾显色；5.观察色谱板上形成的斑点，用紫外光进行观察；6.依据斑点的颜色、相对迁移率等特征，进行鉴定。
结果与讨论：通过上述方法，我们成功地提取、分离和鉴定了柴胡中的皂苷类成分。
在薄层色谱鉴定中，观察到柴胡中皂苷类成分的斑点呈现为紫色。
根据斑点的相对迁移率，可以初步判断柴胡中所含的皂苷类成分种类。
结论：本实验成功提取、分离和鉴定了柴胡中的皂苷类成分。
通过本实验的结果，我们可以进一步研究柴胡的药理活性以及其作用机制，为柴胡的临床应用提供科学依据。
柴胡皂苷防治肝病机制研究进展
河南科技大学学报（ 医学版）
2011 年 12 月 第 29 卷 第 4 期
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高，加强糖、盐 代 谢，同 时 产 生 抗 炎、抗 过 敏、抗 病 毒 等多方面效应［9］。 3 抗肿瘤作用 3． 1 诱导肝癌细胞凋亡 SS 可影响癌细胞增殖，诱 导凋亡。SSd 对引起细胞凋亡的受体 Fas 和 Fas 配 体的表达均有明显促进作用，可引起 G1 期细胞堆 积，诱导凋亡发生［10，11］。此外，SSd 可通过上调细胞 质 кβ 抑 制 蛋 白 （ кβα） 水 平，下 调 细 胞 核 因 子-кB （ NF-кB） 水平，减少 Bcl-XL 表达 抑 制 细 胞 信 号 传 导［3］。SS 对人 HepG2 肝癌细胞的细胞毒作用是由 于激活了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 和 7，引起多聚 二磷酸腺苷-核糖聚合酶（ PARP） 分裂，从而诱导细 胞凋亡［12］。 3． 2 抑制肝癌细胞分裂与生长 柴胡可抑制人肝 癌细胞的生 长，对 抗 人 肝 细 胞 癌。 小 柴 胡 汤 水 溶 液 能抑制肝癌 KIM-1 细胞和胆管上皮细胞癌 KMC-1 细胞的增殖，对 正 常 人 外 周 血 淋 巴 细 胞 及 小 鼠 正 常 肝细胞则 没 有 影 响［12］。 给 大 鼠 投 予 化 学 致 癌 剂 后 发现，SSd 治疗组血清肝功能指标水平下降，癌细胞 分化程度高，异型性低，肿瘤发生延缓［13］。 3． 3 控制肿瘤转移 作为各种前列腺素合成的关 键酶，环氧合酶-2（ COX-2） 在体内的表达与前列腺素 合成调 节 密 切 相 关。COX-2 可 诱 导 肿 瘤 血 管 的 生 成，参与肝癌的发生、发展、浸润及转移。实验表明， SSd 在抑制人肝癌细胞 SSMC － 7721 增殖并诱导凋 亡的同时还能明显下调肿瘤细胞 COX-2 mRNA 和蛋 白质表达水平，降低 COX-2 活性而起到抑制肿瘤作 用［12］。张丰华［14］等 通 过 给 予 荷 瘤 小 鼠 小 剂 量 小 柴 胡汤发现，给药组较对照组肿瘤血管密度明显下降， 瘤体内血管内皮生长因子（ VEGF） 表达下降，抗瘤率 提高，提示小柴胡汤可通过下调 VEGF 的表达抑制 肿瘤血管生 成 而 抑 制 肿 瘤，并 且 呈 一 定 的 剂 量 依 赖 关系。 4 抗炎作用
柴胡皂苷类化学成分及药理作用研究进展
#综述#柴胡皂苷类化学成分及药理作用研究进展谢东浩1,2*,蔡宝昌1,安益强3,李霞3,贾晓斌3(1南京中医药大学药学院,江苏南京 210046;2江苏大学附属医院,江苏镇江 212001;3江苏省中医药研究院,江苏南京 210028)摘要:对柴胡皂苷近年来的化学成分及药理作用研究进展进行综述。
关键词:柴胡;柴胡皂苷;化学成分;药理作用;综述中图号:R282.71 文献标识码:A 文章编号:1000-5005(2007)01-0063-03柴胡原名茈胡,2000版5中国药典6收载为伞形科植物柴胡Bu pleu rum chinens e D C.习称/北柴胡0或狭叶柴胡Bu 2pleurum sco rzonerifolium Willd.习称/南柴胡0的干燥根。
江苏地区习用柴胡为狭叶柴胡春季采收的带根全草,又称/春柴胡0、/芽胡0。
柴胡始载于5神农本草经6,列为上品,5伤寒论6、5千金翼方6、5经史证类备急本草6、5和剂局方6、5本草求真6等历代医家名著中均有详细记载[1]。
柴胡具有抗炎、保肝、解热、镇痛等功效,临床用于治少阳症,肝气郁结所致头痛,月经不调,痛经;气虚下陷证;感冒,胃及十二指肠溃疡,胆结石,痢疾,胆汁返流性胃炎[2]。
柴胡根中主要成分为柴胡皂苷,其次含有植物甾醇、侧金盏花醇,以及少量挥发油、多糖;地上部分主要含黄酮类、少量皂苷类、木脂素类、香豆素类成分。
研究发现柴胡皂苷具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、调节内分泌及免疫系统等作用。
本文对柴胡皂苷近年来的化学成分及药理作用研究进展作一综述。
1 柴胡皂苷类化学成分研究柴胡皂苷结构均为五环三萜类齐墩果烷型衍生物,其苷元分为7种不同类型:环氧醚(Ñ),异环双烯(Ò),12-烯(Ó),同环双烯(Ô),12烯-28-羧酸(Õ),异环双烯-30-羧酸(Ö),18-烯型(×)。
柴胡皂苷中一般只含葡萄糖、呋糖、鼠李糖和木糖,此外,除以上各种糖外还有戊糖醇(pentitol)。