探针设计原则及各种染料发射波长TaqMan
Taqman探针设计要领
如何设计荧光定量PCR实验方案 如何设计荧光定量PCR实验方案 PCR
根据仪器和个人的喜好，确定荧光定量PCR的方 法，选择荧光素的种类 合成引物和探针 收集样品、提取RNA或DNA（-80℃保存，避免反 复冻融 ） 制备标准品（质粒、化学合成的目的基因）
拷贝数=质量÷分子量×6.0×1023 标准曲线通常由4～5个点组成
定量—— 定量 绝对标准曲 线方法
标准品：纯化的质粒dsDNA，体外转录的RNA 准确配制标准系列并且注意其稳定性，最好 分装后保存于-80℃ 荧光材料：杂交探针、水解探针或SYBR Green I 不可以使用DNA作为标准品对RNA进行定量 应用于定量病毒荷载量等
定量—— 定量 相对 标准曲 线方法 指在测定目的基因的同时测定某一内对照基因，用
配制好的引物和探针，保存于-20℃，注意避光 保存探针 RT反应
如何设计荧光定量PCR实验Байду номын сангаас 如何设计荧光定量PCR实验方 PCR 案
不加探针的常规PCR反应，验证引物是否 合适、模板是否降解、模板纯度是否合适。 同时确定最佳反应体系和反应条件 每次实验都设置阴性对照和标准品，每个 样品设两个平行孔
• 引物和探针的设计原则的重要程度由上 往下越来越低 • 如果是设计SYBR Green I引物，也要选 择TaqMan Primer and Probe design并 遵守这些规则，但是只需要合成引物就 可以了。 • 为了确保引物和探针的特异性，最好将 设计好的序列在 www.ncbi.nlm.nih/blast 中核实一次， 如果发现由非特异性互补区，建议重新 设计引物探针。
一系列已知外参物做标准曲线，根据该标准曲线得 到目的基因和内对照基因的量，再将目的基因的同 内对照基因的比值作为定量的最后结果
taqman探针原理
taqman探针原理
Taqman探针是一种基于荧光的实时聚合酶链反应（real-time PCR）技术中常用的探针。
它通过结合于扩增DNA序列的内部区域并在聚合酶链反应过程中进行降解来测量DNA扩增的数量。
Taqman探针主要由一个与目标DNA序列互补的引物和一个含有荧光染料和淬灭染料的荧光探针构成。
在PCR反应开始时，聚合酶链反应体系中存在的引物和Taq DNA聚合酶开始扩增DNA的目标序列。
同时，Taqman探针也与目标序列的内部互补区域结合。
这个内部区域一般位于引物之间，并且特异性地结合于目标序列上。
在DNA扩增的过程中，Taq DNA聚合酶逐渐移动，并且在目标序列的内部区域进行脱氧核苷酸的合成。
这导致Taqman探针在聚合酶链反应的过程中被切割，并将荧光染料和淬灭染料分离开来。
在扩增过程中，荧光染料被释放出来，并且可以被特定荧光探针识别和检测。
一旦有荧光信号的释放，荧光探针就会与其结合，产生荧光信号的峰值。
这使得实时PCR仪器可以测量DNA扩增的数量，从而确定初始样本中目标DNA的量。
Taqman探针的优势在于其高特异性和灵敏度。
由于荧光探针是特异性地与目标序列结合，可以避免假阳性信号的产生。
此外，实时PCR技术可以在PCR反应过程中进行数据收集，使得结果可以实时监测和分析。
总而言之，Taqman探针是一种基于荧光的实时PCR技术中常
用的探针，通过结合于目标序列的内部区域并在PCR反应过
程中降解来测量DNA扩增的数量。
它具有高特异性和灵敏度，并且可以实时监测和分析扩增过程。
realtimePCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价
real-time-PCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：real time PCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价一、实时荧光Taqman 探针设计总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。
即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。
当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。
在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。
但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。
这样，可保证在将来扩增时，即便没有完全扩增，也有荧光信号报告出来。
两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠。
若在原序列中找不到合适的探针与引物(1主要是探针和上游引物的距离太远，而离下游引物的距离却较近时；2突变位点要求在探针的5’ 端也能检测到荧光信号，但却是在3’端)，可在互补的序列中设计引物与探针。
另real-time PCR中的探针和引物的Tm值，均要高于平常PCR的引物和杂交的探针的Tm值。
二、探针的设计探针设计的基本原则：1．保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。
理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。
若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。
且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。
且最好为A或T，而不能为G或A，因为A、T为双键，而G、A为三键。
2．探针长度Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm 值要比引物的Tm值高出10℃，这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。
taqman探针原理
taqman探针原理
Taqman探针是一种用于实时聚合酶链反应（real-time PCR）
的荧光标记探针。
它利用荧光共振能量转移（FRET）原理，
对靶标DNA进行定量分析。
Taqman探针包括一个发光染料（如荧光素）连在5'端，一个
荧光抑制剂（如四乙酰基二甲基氧基哌啶，BHQ1）连在3'端。
在无靶标DNA时，发光染料和荧光抑制剂保持在近距离，从
而导致荧光信号被抑制。
当探针与靶标DNA结合时，PCR扩
增过程中，3'至5'外切的Taq聚合酶会识别并切割探针。
此时，荧光染料和抑制剂分离，荧光信号显现出来。
通过实时PCR仪器的荧光探测系统，可以监测到Taqman探
针的荧光信号的增加，以推断靶标DNA的浓度。
通过测量PCR循环数与荧光信号的关系，可以获得准确的定量PCR结果。
Taqman探针的这种特点使得其在基因表达分析、突变检测、
病原体检测等领域具有广泛的应用价值。
它准确、灵敏、特异性高，成为实时PCR中最常用的探针之一。
qpcr探针设计原则
qpcr探针设计原则
qPCR探针设计的原则有以下几点：
1. 确定靶序列：选择靶序列时，需要确保其能够准确区分目标
基因和其他相关基因，避免干扰。
同时，靶序列长度不应过长或过短，一般在100-250 bp之间。
2. 选择探针类型：常见的探针类型有探针（TaqMan探针、MGB
探针）、探针（SYBR Green探针）。
TaqMan探针在靶序列上会特异性
结合，产生荧光信号，而SYBR Green探针则能够与任何DNA结合并发
出荧光信号。
3. 合理设计探针：探针的设计需要考虑到靶序列的特点，如GC
含量、序列是否存在二级结构、SNP等，以保证探针的特异性和稳定性。
4. 选择合适的引物：引物需要在靶序列上特异性扩增特定片段，同时需要满足一定的比例关系，避免扩增效率过高或过低。
5. 优化PCR反应条件：反应条件的优化包括反应体系、PCR循环参数等方面，从而提高PCR反应的特异性和灵敏度。
实时荧光Taqman 探针设计
一、实时荧光Taqman 探针设计总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。
即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。
当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。
在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。
但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。
这样，可保证在将来扩增时，即便没有完全扩增，也有荧光信号报告出来。
两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠。
若在原序列中找不到合适的探针与引物(1主要是探针和上游引物的距离太远，而离下游引物的距离却较近时；2突变位点要求在探针的5’ 端也能检测到荧光信号，但却是在3’端)，可在互补的序列中设计引物与探针。
另real-time PCR中的探针和引物的Tm值，均要高于平常PCR的引物和杂交的探针的Tm 值。
二、探针的设计探针设计的基本原则：1．保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。
理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。
若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。
且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。
且最好为A或T，而不能为G或A，因为A、T为双键，而G、A为三键。
2．探针长度Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃，这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。
因此探针最好是富含GC的保守片段，保证其的Tm值较高。
现在有Taqman MGB探针，在TAMER之后再标记一个MGB，可使探针的Tm值较高,即使探针片段较短，也可达到Taqman探针的Tm值要求(68-70℃)。
定量PCR Taqman探针设计要领
定量PCR+Taqman探针设计要领自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR 荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。
当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。
一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。
第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA 或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DN***段重叠的情况）内。
第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则* 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
* 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。
建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
* 扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。
较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。
* 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。
两种定量分析方法的比较及Taqman探针引物设计原则
两种定量分析⽅法的⽐较及Taqman探针引物设计原则两种定量分析⽅法的⽐较及Taqman 探针、引物设计原则遗传物质DNA ⾸先要把所携带的遗传信息转录成为信使RNA （mRNA ）,携带遗传信息的mRNA 从细胞核进⼊到细胞质中与核糖体结合，在核糖体中mRNA 携带的遗传信息被翻译成为多肽，多肽经过进⼀步加⼯后变成蛋⽩质，⾄此遗传物质DNA 完成了表达过程。
期间的转录过程是基因表达中⾮常重要的调节步骤，所转录的mRNA 的多少直接影响着相关最终蛋⽩质的多少，所以通过对细胞内某条基因mRNA 含量多少的分析，就能⼤致判断出该条基因的表达是否活跃。
定量PCR 仪是在普通PCR 仪的基础上加装了荧光激发装臵和荧光检测装臵，PCR 扩增和检测同时进⾏；在PCR 反应体系中加⼊荧光基团，利⽤荧光信号的积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进⾏定量分析。
该技术于1996年由美国Applied Biosystems 公司推出，由于该技术不仅实现了PCR 从定性到定量的飞跃，⽽且与常规PCR 相⽐，它具有特异性更强、有效解决PCR 污染问题、⾃动化程度⾼等特点，⽬前已得到⼴泛应⽤。
定量PCR 常⽤的三个常⽤概念扩增曲线、荧光阈值、Ct 值扩增曲线：反映PCR 循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR 仪每次轮PCR 扩增都会⾃动记录荧光强度的变化荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，⼿动设臵的原则要⼤于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最⾼值，同时要尽量选择进⼊指数期的最初阶段，并且保证回归系数⼤于0.99。
CT 值： PCR 扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。
扩增曲线阈值及CT 值荧光定量PCR 的数学原理理想的PCR 反应：X=X0*2n⾮理想的PCR 反应：X=X0* (1+Ex)n（n ：扩增反应的循环次数；X ：第n 次循环后的产物量；X0：初始模板量；Ex ：扩增效率）在扩增产物达到阈值线时: C(t) valueXCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量，在阈值线设定以后,它是⼀个常数,我们设为M⽅程式(1)两边同时取对数得:log M=log X0 (1+Ex)Ct (2)整理⽅程式(2)得:log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3)由此可见，log X0浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的该基因的初始模板量。
taqman探针荧光定量pcr原理
taqman探针荧光定量pcr原理
TaqMan探针荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种高保真度、高灵敏度、高特异性的荧光定量PCR技术。
该技术采用的是一种荧光探针——TaqMan探针进行荧光定量。
TaqMan探针是由FAM（荧光染料）标记的探针序列和由Quencher（猝灭剂）标记的引物序列连接而成。
PCR反应过程中，引物与模板DNA特异性结合、延伸。
当引物到达TaqMan 探针的靶位点时，Taq聚合酶酶解TaqMan探针中FAM染料与Quencher猝灭剂之间的化学键，使FAM染料释放并荧光发出，同时探针被降解。
荧光信号的強度与模板DNA浓度成正比关系。
因此，通过TaqMan探针荧光定量PCR技术能够快速、准确地检测和定量基因、病原微生物、突变等一系列生物标记物分子的含量和质量。
Taqman探针及SYBR Green I荧光染料技术
半定量RT-PCR步骤 步骤 半定量
步骤： 抽提 抽提RNA，2.反转录获得 反转录获得cDNA，3.以cDNA 步骤： 1.抽提 ， 反转录获得 ， 以 为模板做PCR 为模板做 注意： 步骤 ，RNA抽提质量一定要好，注意污染。内 抽提质量一定要好， 注意： 步骤1， 抽提质量一定要好 注意污染。 参的选择，常用的有 两种。 参的选择，常用的有βactin和GAPDH两种。步骤 ，半 和 两种 步骤3， 定量RT-PCR应该在两管中进行，既内参和目的基因各一 定量 应该在两管中进行， 应该在两管中进行 管，这样便于控制，做图的时候可以放在一各泳道里跑！ 这样便于控制，做图的时候可以放在一各泳道里跑！ 指数期和平台期一定要摸清楚！ 指数期和平台期一定要摸清楚！
TaqMan探针法 探针法
TaqMan探针法是高度特异的定量 探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用 技术， 探针法是高度特异的定量 技术 其核心是利用Taq酶的 酶的 5′→3′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板 外切核酸酶活性， 外切核酸酶活性 切断探针，产生荧光信号。 是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。 是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。 在TaqMan探针法的定量 探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条 反应体系中，包括一对 引物和一条 探针法的定量 反应体系中 探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。 探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探 针的5′端标记有报告基团 端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记 针的 端标记有报告基团 ， 、 等 端标记 有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候， 有荧光淬灭基团 ， 等 当探针完整的时候， 报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。 报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随 着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其 的进行， 酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针， 的进行 酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针 3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其 外切核酸酶活性就会将探针切断， 外切核酸酶活性就会将探针切断 报告基团远离淬灭基团， 能量不能被吸收，即产生荧光信号（ ）。所以 能量不能被吸收，即产生荧光信号（图4）。所以，每经过一个 ）。所以，每经过一个PCR 循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。 循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信 号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。 的拷贝数。 号的强度就代表了模板 的拷贝数