吸光光度法和分光光度计
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第八章 吸光光度法解析
2018/10/21
吸光光度法特点： （1）灵敏度高： 10-5~10-6，10-7~10-8，10-10 mol· L-1 （2）准确度高：
比色分析，相对误差5~10%， 分光光度法，2~5%，1~2%；
（3）应用广泛：
可测定绝大多数无机物和许多有机物；
（4）操作简便仪器设备易普及。
2018/10/21
A
C. 200~780nm
D. 200~1000nm
2 、符合比尔定律的一有色溶液，当其浓度增大 时，最大吸收波长和吸光度分别是 A. 不变，增加 C. 增加，不变 B. 不变，减少 D. 减少，不变
A
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3、下列表述不正确的是
C
A. 吸收光谱曲线，表明了吸光度随波长的变化关系 B. 吸收光谱曲线中,最大吸收处的波长为最大吸收波长 C. 吸收光谱曲线，以波长为纵坐标,以吸光度为横坐标
分子内部价电子运动，分子内原子振动和分子绕其重心的转动。
分子能量
E Ee Ev Er
电子能 振动能 转动能
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分子吸收光谱产生： 分子吸收外界能量（光、电、热）引起分子能级 跃迁，从基态跃迁到激发态
E E1 E2 hv
2018/10/21
电子跃迁能级较大， 能量在1~20eV，紫外 可见吸收光谱在
2018/10/21
偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面： 1. 光学因素； 2. 化学因素
二.偏离朗伯-比尔定律的原因
1、光学因素：非单色光引起的偏离 严格地说，朗伯-比尔定律只适用于单色光。
设入射光由 1 和 2 两种波长组成，溶液的吸光 质点对两种波长的光的吸收均遵从吸收定律
对1： A lg I 01 bc 1 1 I
吸光光度法特点： （1）灵敏度高： 10-5~10-6，10-7~10-8，10-10 mol· L-1 （2）准确度高：
比色分析，相对误差5~10%， 分光光度法，2~5%，1~2%；
（3）应用广泛：
可测定绝大多数无机物和许多有机物；
（4）操作简便仪器设备易普及。
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A
C. 200~780nm
D. 200~1000nm
2 、符合比尔定律的一有色溶液，当其浓度增大 时，最大吸收波长和吸光度分别是 A. 不变，增加 C. 增加，不变 B. 不变，减少 D. 减少，不变
A
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3、下列表述不正确的是
C
A. 吸收光谱曲线，表明了吸光度随波长的变化关系 B. 吸收光谱曲线中,最大吸收处的波长为最大吸收波长 C. 吸收光谱曲线，以波长为纵坐标,以吸光度为横坐标
分子内部价电子运动，分子内原子振动和分子绕其重心的转动。
分子能量
E Ee Ev Er
电子能 振动能 转动能
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分子吸收光谱产生： 分子吸收外界能量（光、电、热）引起分子能级 跃迁，从基态跃迁到激发态
E E1 E2 hv
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电子跃迁能级较大， 能量在1~20eV，紫外 可见吸收光谱在
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偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面： 1. 光学因素； 2. 化学因素
二.偏离朗伯-比尔定律的原因
1、光学因素：非单色光引起的偏离 严格地说，朗伯-比尔定律只适用于单色光。
设入射光由 1 和 2 两种波长组成，溶液的吸光 质点对两种波长的光的吸收均遵从吸收定律
对1： A lg I 01 bc 1 1 I
吸光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一类
Ak1b
1852年；比尔： 阐明了物质对光的吸收程度与溶液浓度之间的关 系.
Ak2c
由比尔将二者结合起来,就得到布格-朗伯-比尔定 律,一般叫做朗伯-比尔定律.
AKbc
2、朗伯-比尔定律 的推导〔数学表达 式〕<略〕
3、灵敏度的表示方法
<1>吸收系数a〔吸光系数a 〕 当液层厚度b以cm为单位、吸光物质的浓度c以
§8-4 吸光光度法分析条件的选择
在光度分析中,一般需先选择适当的试剂与试样中的 待测组分反应使之生成有色化合物,然后再进行测定.
因此,分析条件的选择包括反应条件和测量条件的选 择.
一、显色反应及其条件的选择 〔一〕显色反应和显色剂 1、概念：
显色反应：将被测组分转变成有色化合物的反应称 为显色反应. M + R = MR
这种方法简便、快速,对于解离度小的络合物,可 以得到满意的结果.
2、等摩尔连续变化法
此 法 的 做 法 是 保 持 CM 和 CR 的 浓度保持不变,即CM + CR = 常数, 连续改变CM和CR的比值,在选定 的仪器条件和波长下测定溶液的 吸光度A.
以A对CM/CR +CM作图.
等摩尔连续变化法测定络合物组成
g·L-1为单位时,K用a表示,称为吸收系数,其单位为 L·g-1·cm-1.此时朗伯-比尔定律表示为
A=abc
<2>摩尔吸光系数ε 当液层厚度b以cm为单位、吸光物质的浓度c
以mol·L-1为单位时,K用ε表示,称为摩尔吸收系 数,其单位为L·mol-1·cm-1.此时朗伯-比尔定律表 示为
A= εbc
二、吸光光度法的测量误差及测量条件的选择
光度法的误差除各种化学因素外,还有因仪器精度 不够,测量不准所带来的误差.
1852年；比尔： 阐明了物质对光的吸收程度与溶液浓度之间的关 系.
Ak2c
由比尔将二者结合起来,就得到布格-朗伯-比尔定 律,一般叫做朗伯-比尔定律.
AKbc
2、朗伯-比尔定律 的推导〔数学表达 式〕<略〕
3、灵敏度的表示方法
<1>吸收系数a〔吸光系数a 〕 当液层厚度b以cm为单位、吸光物质的浓度c以
§8-4 吸光光度法分析条件的选择
在光度分析中,一般需先选择适当的试剂与试样中的 待测组分反应使之生成有色化合物,然后再进行测定.
因此,分析条件的选择包括反应条件和测量条件的选 择.
一、显色反应及其条件的选择 〔一〕显色反应和显色剂 1、概念：
显色反应：将被测组分转变成有色化合物的反应称 为显色反应. M + R = MR
这种方法简便、快速,对于解离度小的络合物,可 以得到满意的结果.
2、等摩尔连续变化法
此 法 的 做 法 是 保 持 CM 和 CR 的 浓度保持不变,即CM + CR = 常数, 连续改变CM和CR的比值,在选定 的仪器条件和波长下测定溶液的 吸光度A.
以A对CM/CR +CM作图.
等摩尔连续变化法测定络合物组成
g·L-1为单位时,K用a表示,称为吸收系数,其单位为 L·g-1·cm-1.此时朗伯-比尔定律表示为
A=abc
<2>摩尔吸光系数ε 当液层厚度b以cm为单位、吸光物质的浓度c
以mol·L-1为单位时,K用ε表示,称为摩尔吸收系 数,其单位为L·mol-1·cm-1.此时朗伯-比尔定律表 示为
A= εbc
二、吸光光度法的测量误差及测量条件的选择
光度法的误差除各种化学因素外,还有因仪器精度 不够,测量不准所带来的误差.
第七章 吸光光度法 (1)
2 一些基本名词和概念
吸收光谱曲线：物质在不同波长下吸收光的强度大小
A～ 关系
最大吸收波长 max：光吸收最大处的波长
Δ
对比度(Δ ):络合物最大吸 收波长( MRmax)与试剂最大 吸收波( Rmax)之差
max
吸收曲线的讨论：
（1）同一种物质对不同 波长光的吸光度不同。吸 光度最大处对应的波长称 为最大吸收波长λmax
ΔE=E2-E1=hν
不同的物质微粒由于结构不同而具有不同的量子化能级， 其能量差也不相同。仅当照射光光子提供的能量(hν)与被照物 质的基态与激发态能量之差ΔE相等时才能发生吸收。所以物 质对光的吸收具有选择性。
h
S3 S2
E3 E2 E1
A
S1
S0
纯电子能态 间跃迁
S2 h
E0
锐线光谱
A
光的互补
若两种不同颜色的单色光按一定的 强度比例混合得到白光，那么就称 这两种单色光为互补色光，这种现 象称为光的互补。
10-2 nm 10 nm
射 线 x 射 线
102 nm 104 nm
紫 外 光 红 外 光
0.1 cm 10cm
微 波
103 cm
105 cm
无 线 电 波
可
绿 蓝绿 绿蓝 蓝 红
2、化学反应引起的偏离 L-B中浓度(c) 应指吸光物质的平衡浓度， 即吸光型体的平衡浓度。 实际常用吸光物质的分析浓度。只有当平衡 浓度等于或正比于分析浓度时，其吸光度符合 比尔定律。但溶液中吸光物质常因缔合、离解、 互变异构，络合物的逐级形成，以及与溶剂的 相互作用等而形成新的化合物或改变吸光物质 浓度，这些都将导致偏离比尔定律。如
第九章 吸光光度法
发生相互作用。 假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)时才基本符合。 当溶液浓度c >10 －2 mol/L 时，吸光质点间可能发 生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。 故：朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。 溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的 形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化 ，影响吸光度。
度的乘积成正比。 朗伯——比耳定律不仅适用于有色溶液，也适 用于其它均匀、非散射的吸光物质(包括液体、气 体和固体)，是各类吸光光度法的定量依据。
A bc
式中，A：吸光度，描述溶液对光的吸收程度； b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位； c：溶液的摩尔浓度，单位mol· －１； L
无线电波 11000m
光谱名称 波长范围 X射线 0.1—10nm 远紫外光 10—200nm
跃迁类型
辐射源
分ห้องสมุดไป่ตู้方法 X射线光谱法
真空紫外光 度法
K和L层电子 X射线管 中层电子 氢灯 氢灯 钨灯
碳化硅热棒
近紫外光 200—400nm 价电子 可见光 400—750nm 价电子
近红外光 0.75—2.5μ m 分子振动 中红外光 2.5— 分子振动 5.0μ m
A总 lg(I01 I02 ) /(I01 10
1bc
I02 10
2bc
)
讨论: A总 lg(I0 I0 ) /(I0 10
1 2 1
1bc
I02 10
2bc
)
(1) 1= 2 = 则： A总 ＝lg（Ｉo/Ｉt）＝ bc
(2) 若 2≠ 1 ；A与C则不成直线关系。 2与 1
I0 A lg I t A Kbc
第10章 吸光光度分析
无机及分析化学
34
3、吸光度范围
被测溶液的吸光度值在0.2～0.8范围内，使测定
结果有较高的准确度，过大或过小应予以调节。 而当A= 0.434或T% = 36.8时，测定的误差最小。 为此可从以下三方面加以控制： 一是改变试样的称样量，或采用稀释、浓缩、富
无机及分析化学
12
质量吸光系数，摩尔吸光系数
• 质量吸光系数 a: 当一定波长的单色光，通过浓度 为 1g/L，吸收池的液层厚度为 1cm的溶液时，测 得的吸光度。单位为L.g-1.cm-1
• 摩尔吸光系数ε • 物理意义：当一定波长的单色光，通过浓度为 1mol/L，吸收池的液层厚度为1cm的溶液时，测 得的吸光度。单位为L.mol-1.cm-1
比耳定律假设了吸收粒子之间是无相互作用的， 因此仅在稀溶液（c < 10-2 mol/L )的情况下才适用。
(2)非单色光引起的偏离
朗伯一比尔定律只对一定波长的单色光才能成立，但 在实际工作中，入射光是具有一定波长范围的。
无机及分析化学
18
化学因素
溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化也会引起偏离。
不同的显色反应的适宜 pH 是通过实验确定的。 无机及分析化学
24
3 、显色温度：要求标准溶液和被测溶液在测定 过程中温度一致。
4 、显色时间：通过实验确定合适的显色时间， 并在一定的时间范围内进行比色测定。
5、溶 剂：有机溶剂降低有色化合物的解离度， 提高显色反应的灵敏度。 6、共存离子的影响
无机及分析化学
偏离朗伯—比尔定律。
无机及分析化学
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§10－2 显色反应及其影响因素
一、显色反应与显色剂
显色剂
显色反应：加入某种试剂使被测组分变成有色化合物的反应 在光度分析中生成有色物质的反应主要有配位反应、 氧化还原反应等，其中以配位反应应用最广。
第九章吸光光度法(简)
解 已知T=0.501，则A=－lgT=0.300，b=2.0cm,
c
25.0 10 6 g 50.0 10 3 L
5.00 10 （4 g L1)
则根据朗伯—比尔定律 A=abc，
a
A bc
0.300 2.0cm 5.00 10 4 g
L1
3.00
10 2 L.g -1.cm1
III
III 0.0006mg/mL
0.3
0.2
II
I
0.1
0.0
400
500
600
/nm
１，１０－邻二氮杂菲亚 铁溶液的吸收曲线
吸收光谱或吸收曲线
max
KMnO4溶液的吸收曲线
(cKMnO4:a<b<c<d)
KMnO4溶液
对波长525nm附近的绿 色光吸收最强，而对紫 色光吸收最弱。光吸收 程度最大处的波长叫做
实验确定 4.溶剂 5.干扰的消除
三 显色剂
1 无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵等。 2 有机显色剂：种类繁多 （1）偶氮类显色剂：性质稳定、显色灵敏度高、选择 性好、对比度大，应用最广泛。偶氮胂III、PAR等。 （2）三苯甲烷类：铬天青S、二甲酚橙等
§9－4 吸光度测量条件的选择
一 选择适当的入射波长
2.由于溶液本身的原因所引起的偏离
朗伯—比尔定律是建立在 均匀、非散射的溶液这个基础 上的。如果介质不均匀，呈胶 体、乳浊、悬浮状态，则入射 光除了被吸收外，还会有反射 、散射的损失，因而实际测得 的吸光度增大，导致对朗伯— 比尔定律的偏离。
3. 溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化
其中有色化合物的离解是偏离朗伯—比尔定律的主
荧光分光光度法与吸光光度法的异同
荧光分光光度法与吸光光度法的异同
荧光分光光度法和吸光光度法都是基于物质对光的吸收或发射来进行分析的方法，但它们之间也存在一些区别。
1. 原理不同：吸光光度法是基于物质对光的选择性吸收来进行分析的方法，而荧光分光光度法是基于物质被激发后发出荧光的特性来进行分析的方法。
2. 光源不同：吸光光度法通常使用可见光或紫外光作为光源，而荧光分光光度法需要使用能够激发荧光的光源，通常是紫外线或短波长的可见光。
3. 灵敏度不同：荧光分光光度法的灵敏度通常比吸光光度法高，因为荧光的强度与物质的浓度成正比，而且荧光信号比吸光信号更容易检测。
4. 应用范围不同：吸光光度法适用于测定溶液中物质的浓度、纯度等，而荧光分光光度法更适用于分析低浓度、微量的物质，如生物样本中的蛋白质、核酸等。
5. 干扰因素不同：吸光光度法容易受到其他物质的干扰，因为其他物质也可能吸收光源的能量。
而荧光分光光度法的干扰相对较小，因为只有被激发的物质会发出荧光。
6. 仪器设备不同：荧光分光光度法需要特殊的荧光分光光度计，而吸光光度法则通常使用普通的分光光度计。
总之，荧光分光光度法和吸光光度法在原理、光源、灵敏度、应用范围、干扰因素和仪器设备等方面都存在一定的差异。
选择哪种方法取决于分析的具体需求和样品的特性。
紫外吸光度的检测方法
紫外吸光度的检测方法
紫外吸光度（UV absorbance）是指物质对紫外光的吸收能力。
常用的紫外吸光度检测方法包括：
1. 分光光度法：使用分光光度计，将待测物溶液通过样品池，测量在特定波长下的吸光度。
这种方法可以同时测量多个波长的吸光度，可用于分析样品的成分和浓度等。
2. 过程分析法：通过不断测量待测物的吸光度变化，可以了解反应的进程和动力学。
常用的过程分析方法有动力学紫外吸收光谱（UV-vis动力学），用于研究快速反应和反应速率常数等。
3. 衍射光谱法：通过衍射光谱仪测量待测物在不同波长下的吸光度，可以确定样品的结构和光学参数。
4. 荧光光谱法：某些物质在紫外光照射下会发生光致荧光，可以通过测量荧光光谱来获得吸光度信息。
这种方法常用于分子结构和功能的研究。
上述方法需要根据具体的实验要求选择适当的波长范围和检测设备，以获得准确的吸光度结果。
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4. 吸光系数(Absorptivity)
当c的单位用g·L-1表示时，用a表示，
A＝abc
a的单位: L·g-1·cm-1
当c的单位用mol·L-1表示时，用k表示.
k－摩尔吸光系数(Molar absorptivity)
A＝ kbc
k的单位: L·mol-1·cm-1
Ｋ在数值上等于1cm溶液厚度中吸光物 质为1 mol·L-1时的吸光度。
一、分光光度法特点 (1)方法灵敏度高：
测定下限可达10－3～10－6mol/L。 (2)方法的准确度能满足微量组分测定的要求。 (3)操作简便快速,仪器设备简单。 (4)应用广泛:几乎所有的无机离子和有机化合物
都可直接或间接地用吸光光度法进行测定。
二、物质对光的选择性吸收
电磁辐射按波长顺序排列，称电磁波谱。
γ射线→ X 射线→紫外光→可见光→红外光→微波→无线电波
高能辐射区 γ射线 能量最高，来源于核能级跃迁
χ射线 来自内层电子能级的跃迁
光学光谱区 紫外光
来自原子和分子外层电子能级的跃迁
可见光
红外光 来自分子振动和转动能级的跃迁
波谱区 微波
来自分子转动能级及电子自旋能级跃迁
无线电波 来自原子核自旋能级的跃迁
440
nm
0.2
Absorbance
300
400
500
600
700 /nm
物质对光的吸收本质——
光作用于物质时，物质吸收了可见光，而显示出特 征的颜色，这一过程与物质的性质及光的性质有关。
物质对光的吸收
S3
h S2
S1
E3 E2
E1 h E2 E0
S0
E0
物质对光的吸收满足Plank 条件
2、吸收光谱或吸收曲线 吸收曲线：测定某种物质对不同波长单色光的吸 收程度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图。
最大吸收波长，max
(cKMnO4:a<b<c<d)
定量分析的基础： 某一波长下测得的 吸光度与物质浓度 有关。
吸收曲线(absorption spectrum)的讨论—— 1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光
3）不同物质吸收曲线的形状和最大吸收波长 均不相同。光吸收曲线与物质特性有关，故据 此可作为物质定性分析的依据。
Cr2O72-、MnO4-的吸收光谱 (Absorption spectra of Cr2O72-、MnO4- )
350
1.0
Cr2O72-
0.8
525 545 MnO4-
0.6
0.4
A— 吸光度(absorbance) b— 介质厚度(length/cm) c— 浓度(concentration) K— 吸光系数(absorptivity)
T－透光度(Transmittance)
T = It I0
A = lg (I0/It) = lg(1/T) = -lgT = Kbc
T = 10-kbc = 10-A
吸光度(A)、透光率(T)与浓度(c)的关系
A
T
T = 10-kbc
A=kbc
线性关系
c
5. 朗伯-比尔定律的分析应用
A
溶液浓度的测定——
A＝ kbc
0.8
0.6
A~c
0.4
工作曲线法
0.2
(校准曲ห้องสมุดไป่ตู้)
0
Calibration curve 0 1 2
光学光谱区(Spectral region)
远紫外 近紫外 可见 近红外 中红外 远红外
(真空紫外)
10nm~ 200nm
中层 电子
200nm ~400nm
价电 子
400nm 760 nm ~ 750nm ~ 2.5 m
价电 子
分子 振动
2.5 m 5.0 m ~ 5.0 m ~1000 m
度最大处对应的波长称为最大吸收波长(max)
2）同一物质不同浓度的溶液，光吸收曲线形状相 似，其最大吸收波长不变；但在一定波长处吸光度 随溶液的浓度的增加而增大。这个特性可作为物质 定量分析的依据。在实际测定时，只有在λmax处 测定吸光度，其灵敏度最高，因此，吸收曲线是吸 光光度法中选择测量波长的依据。
E
E2
E0
h
hc
目录
§ 11.2光的吸收定律（朗伯-比尔定律）
1. 朗伯定律(Lambert’s law)
A=lg(I0 /It )=Kb
2. 比尔定律(Beer’s law)
A=lg(I0 /It )=Kc
入射光 I0
透射光 It
3. 朗伯-比尔定律
A = lg (I0/It) =Kbc
学习目的——
1.了解比色法、分光光度法的特点。 2.掌握光的吸收定律及其适用范围。 3.掌握分光光度法的分析方法。 4.了解显色反应及其条件的选择。 5.了解分光光度法仪器测量的误差及测量条
件的选择。 6.了解分光光度法的某些应用。
本章内容(P422)——
§ 11-1 概述 § 11-2 光吸收的基本定律 § 11-3 比色法和分光光度法及其仪器 § 11-4 显色反应及显色条件的选择 § 11-5 分光光度法仪器测量误差
及其消除 § 11-6 分光光度法的某些应用
化学分析与仪器分析方法比较——
化学分析(Chemical analysis)： 准确度高
仪器分析(Instrumental analysis)： 灵敏度高
§ 11.1 概述
比色法：比较待测溶液的颜色深浅测定物质的浓 度。
§ 11.1 概述
吸光光度法（Absorption Photometry）：是一种 基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一种分 析方法。 ——可见吸光光度法、紫外-可见吸光光度法和红 外光谱法等。
颜色 紫
蓝 绿蓝 蓝绿 绿 黄绿 黄 橙 红
互补光 黄绿
黄 橙 红 红紫 紫 蓝 绿蓝 蓝绿
物质的颜色是由于物 质对不同波长的光具有 选择性的吸收作用而产 生的，物质的颜色由透 过光的波长决定。
例：高锰酸钾溶液因吸白光中的绿色光而呈紫色。
如果两种适当颜色的光按一定的强度比例混合可 以得白光，这两种光就叫互为补色光。物质呈现的颜 色和吸收的光颜色之间是互补关系。
分子 振动
分子 转动
1、光的互补性与物质的颜色
单色光：只具有一种波长的光。 混合光：由两种以上波长组成的光，如白光。
绿 黄
青
橙 红
白光
青蓝
蓝 紫
不同颜色的可见光波长及其互补光——
/nm 400-450
450-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-610 610-650 650-760