细胞融合技术研究进展
细胞融合技术及相关进展
细胞融合技术及相关进展摘要：细胞工程是四大生物工程之一，在生物、医学等许多领域取得了开创性的研究成果。
细胞融合方法得到不断更新，融合率也得到逐步提高。
该技术在细胞遗传学、单克隆抗体及种质资源的开发利用等方面的研究具有重要意义。
因此本文对细胞融合的定义机理、应用及融合技术方面的相关研究成果进行总结和阐述。
关键词：细胞融合；生物法；化学法；物理法细胞融合技术是近30多年来迅速发展起来的一项新兴细胞工程技术，已在农业、畜牧业、医药等多领域取得研究成果，且应用领域不断扩大[1]。
细胞融合不仅为细胞的起源、肌肉骨骼胎盘的发育、干细胞介导的组织再生等理论领域研究提供了有力手段，而且被广泛应用于育种学、发生生物学及免疫医学，特别是在动植物新品种的培育、单克隆抗体的制备以及抗癌疫苗的研发等方面具有重要意义。
1细胞融合的定义及机理细胞融合也称细胞杂交，是在自然条件下或用人工方法使两个或两个以上的同源或异源细胞或原生质体相互接触，发生膜融合、胞质融合和核融合而形成杂种细胞的过程。
细胞融合与病毒和细胞之间的融合有许多相似之处，即带包被的病毒或细胞通过转膜病毒蛋白介导与宿主细胞的细胞膜进行融合，过程中伴随蛋白构象的变化。
细胞融合主要经过以下几个主要步骤：原生质体或细胞相互靠近；质膜融合形成细胞桥；胞质渗透；细胞核融合。
其中细胞桥的形成是细胞融合的关键一步，而只有细胞核发生了融合，多核细胞才能存活下去。
2细胞融合的方法2.1生物法病毒诱导细胞融合：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用而与宿主细胞膜直接融合。
当其同时进入两个细胞时，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，打破两个细胞膜的隔阂，引起细胞质的交流，进而使细胞发生融合。
单纯疱疹病毒（HSV）：HSV介导细胞-细胞融合需要四种关键包膜蛋白gD，gB和异二聚体gH/gL，其介导细胞融合的过程如下：gD与细胞受体结合，导致其胞外域的C端部分发生构象变化，暴露出核心部位[2]；激活的gD与gH / gL相互作用并将其转化为正调控因子；正调控因子激活gB成为活性的融合因子[3]。
破骨细胞融合分子机制的研究进展
2020 年 02 月 第 17 卷 第 1 期doi: 10.3969/j.issn. 1672-5972.2020.01.017 : swgk2018-09-00165生物骨科材料与临床研究 ORTHOPAEDIC BIOMECHANICS MATERIALS AND C LINICAL STUDY综述与讲座破骨细胞融合分子机制的研究进展*杨文杰 1,2 李耀玺 2 段莉 2 王大平 * 1,2[摘要] 破骨细胞是体内介导骨吸收的主要细胞 破骨细胞融合过程包括 识别 半融合结构及融合孔形成 最后融合孔扩张 细胞内容物混合 破骨细胞融合与破骨细胞的大小及其骨吸收能力密切相关 对破骨细胞融合分子机制的研究可为骨吸收亢进性疾病的治疗寻求新的突破口 本文就国内外破骨细胞融合过程及其分子机制的最新研究进展进行综述[关键字] 破骨细胞 细胞融合 分子机制[中图分类号] R329.2[文献标识码] AAdvances in molecular mechanism of osteoclasts fusion[Abstract] Osteoclasts are the main cells that mediate bone resorption in vivo. The process of osteoclasts fusion include the recognition and formation of hemifusion structure and fusion pore. Finally, the fusion pore expands and the cell contents mixed. Osteoclasts fusion are closely related to their size and bone resorption capacity. Research on the molecular mechanism of osteoclasts fusion can seek new breakthroughs in the treatment of bone resorption aggressive diseases. This review summarizes recent advances in the process of osteoclasts fusion and their molecular mechanisms in our state and abroad. [Key words] Osteoclast; Cell fusion; Molecular mechanism破骨细胞 osteoclast OC 是一类由骨髓造血干细胞 来源的单核/巨噬前体细胞融合分化而来的多核巨细胞 含 有 3 100 个细胞核 细胞直径可达 100 m 是体内介导 骨吸收的主要细胞 破骨细胞体积越大 其所含的骨降解相 关酶 如基质金属蛋白酶 9 组织蛋白酶 K 等 就越多 其 骨吸收能力也越强 所以破骨细胞体积大小是评估或衡量衡 量破骨细胞骨吸收能力的重要指标 破骨细胞的体积与破骨 细胞核的数量成正相关 [1] 研究表明 单核细胞与单核细 胞 单核细胞与多核破骨细胞以及多核破骨细胞之间均可相 互融合 其中以单核细胞与多核破骨细胞融合为主 以形成 破骨细胞或细胞核数目更多的破骨细胞 所以细胞间融合是 生成破骨细胞的关键 [2] 随着近年来对破骨细胞相关研究的 不断推进 人们对破骨细胞融合分子机制的认识也不断加 深 这为治疗破骨细胞功能亢进所致的骨破坏过多疾病 如* 基 金 项 目: 国 家 自 然 科 学 基 金 81772394 ; 深 圳 市 科 技 计 划 项 目 JCYJ20170306092215436 作者单位: 1 汕头大学医学院 广东 汕头 515000; 2 深圳市组织工程重点实验 室 广东省智能化数字骨科工程技术研究中心 深圳市第二人民医院 深圳大 学附属第一医院 广东 深圳 518035骨质疏松 类风湿性关节炎 骨关节炎等 寻求新的突破点 正常情况下 细胞的脂质双分子层之间通过疏水作用静电斥力和膜蛋白质的空间相互作用使自身结构稳定下来 破骨细胞前体细胞被招募 迁移到骨表面时 各细胞生物膜 之间的初始距离较大 >20 nm 融合蛋白必须使预融合细 胞间的脂质双层局部弯曲 使最强的膜间排斥面积最小化 从而使预融合细胞间紧密接触 几纳米的距离 下游的融 合事件才得以进行 [3] 细胞融合过程可归纳如下 首先 细 胞识别其融合伴侣细胞 然后细胞质膜中的磷脂双层相互接 触形成半融合结构 随后半融合结构进一步形成融合孔 最 后融合孔扩张 细胞内容物混合完成细胞融合 [4-5] 1 细胞识别细胞识别 cell recognition 是指细胞通过其表面的分 子选择性地和其他细胞表面分子结合的现象 这些表面分子 主要是蛋白质和糖蛋白 研究表明 发生融合的破骨细胞前 体 即破骨细胞融合伴侣 osteoclast fusion partners 间存 在互补分子的差异 融合前融合伴侣间存在选择性 故破骨 细胞融合伴侣间存在细胞间的相互识别 [6]抑制或敲除 CD47 可分别抑制鼠 OCs 以及巨噬细胞的生物骨科材料与临床研究 ORTHOPAEDIC BIOMECHANICS MATERIALS AND C LINICAL STUDY2020 年 02 月 第 17 卷 第 1 期融合 [7] Frendo 等 [8] 在 Syncytin-1 反义 RNA 存在或不存在 情况下研究人类滋养层细胞融合时对所得细胞的核数量进行 终点分析发现 3 5 个核的合胞体的比例明显增加 而 6 个 核以上合胞体的比例显著降低 Møller 等 [7] 在研究破骨细 胞融合不同阶段中 CD47 和 Syncytin-1 的参与情况 共分析 了 1 808 个破骨细胞前体个体融合事件 发现 CD47 和 Syncytin-1 在破骨细胞融合中具有不同的作用 其作用取决于 融合伴侣的核数目 CD47 促进单核破骨细胞前体间融合 Syncytin-1 可促进 2 个多核破骨细胞间的融合 因此 CD47 和 Syncytin-1 可能介导破骨细胞前体间的识别 此外 破骨 细胞融合伴侣间融合主要通过 2 种不同类型的细胞接触进 行 吞噬杯状结构和宽接触表面 CD47 主要通过融合伴侣 细胞膜间的宽接触表面来介导融合 而 Syncytin-1 则通过吞 噬杯状结构来介导融合破骨细胞前体细胞表达的 CD47 又称整联蛋白相关蛋 白 和信号调节蛋白 SIRP- 都是 Ig 超家族的成员 其 中 CD47 可以作为 SIRP- 的配体 CD47-SIRP 相互作用可抑 制巨噬细胞的吞噬作用 并促进巨噬细胞融合形成破骨细胞[9]破骨细胞的树突状细胞特异性跨膜蛋白 DC-STAMP 是一种多次跨膜蛋白 是主导破骨细胞前体融合的主要蛋白 质 是 OC 融合的关键因素之一 其主要在单核破骨细胞前 体的质膜上发现 [10] RANKL 可诱导破骨细胞前体表达 DCSTAMP 在破骨细胞形成过程中 DC-STAMP 的表达是逐渐 降低的 [11] Mensah 等 [10] 研究 DC-STAMP 在巨噬细胞和 RAW264.6 巨噬细胞细胞系的融合中发现 这些细胞在用 RANKL 处理后可引起大约一半细胞细胞膜上的 DC-STAMP 转 移至细胞质内 然后根据巨噬细胞和 RAW264.6 巨噬细胞系细 胞膜上 DC-STAMP 含量分成 DC-STAMP hi 和 DC-STAMP Lo 两 个群体 当一个融合伴侣细胞膜上的 DC-STAMP hi 另一个 为 DC-STAMP lo 时 破骨细胞间才能有效融合 [10,12] Søe 等 [2] 在研究人类 656 个破骨细胞的融合事件中发现人类破骨细胞 前体 preOCs 和破骨细胞 OCs 在选择合适融合伴侣时 的特征: 融合伴侣通常包括一个不移动的融合受体细胞和一 个可移动融合供体细胞; 不移动细胞主要是多核的 并且主 要通过与含有一个细胞核的可移动细胞融合来增加它们的核 数目; 较成熟的 preOC / OC 趋向于和较不成熟的 preOC 融 合 RANKL 刺激 preOC / OC 可诱导 DC-STAMP-配体 该 配体尚未被鉴定出来 可能是可溶性的或者是与膜结合的 的表达 随后 DC-STAMP-配体通过自分泌和 或 通过 G 蛋白偶联受体 GPCR 信号传导介导的旁分泌来诱导融合 基因表达 [13] 因此推断 DC-STAMP 可能参与破骨细胞前体 间某些起识别 如 CD47 Syncytin-1 等 或融合作用分子 表达的调控2 融合中间结构的形成 当两个 preOC / OC 相互识别后 细胞即将进入细胞膜脂质双层融合阶段 见图 1 A 当然这需要某些特定融合 蛋白的存在 对无蛋白质的脂质膜融合过程的研究中发现存 在 2 种重要的中间结构 半融合结构和融合孔 [4] 其中半融 合结构是形成融合孔的中间体 [14]半融合结构表示相互黏附脂质双层间的外层小叶之间有 联系 而内层小叶仍保持不变 见图 1C [4] 蛋白质通过诱 导膜接触处的局部脱水和控制膜的弹性应力来促进半融合结 构的形成 半融合结构是一种瞬时结构 它可解离形成 2 个 分离的 脂质双层 细胞 也可进一步融合形成融合孔 [15-16]Chernomordik 等 [3] 对生物重塑表征良好的流感血凝素 介导的融合现象和机制与无蛋白的脂质双层融合进行比较 认为脂质双层发生半融合和形成融合孔的倾向主要取决于脂 质双层中脂质的组成 脂质双层中特定的脂质分子通过其分 子结构和单层内的脂质相互作用形成有效的自发曲率 从而 影响不同融合中间结构的形成 磷脂酰乙醇胺 PE 的脂 质倾向于形成负自发曲率 呈锥形 见图 2A 磷脂酰胆 碱的脂质倾向于形成略微负曲率 其自发曲率接近于零 近 似圆柱形 见图 2B 溶血磷脂酰胆碱 LPC 倾向于形 成正自发曲率 呈倒锥形 见图 2C 当把倒锥形的 LPC 和锥形的 PE 添加到接触小叶中时 可分别抑制和促进半融 合 这表明半融合结构的形成与净负曲率相关 当把 LPC 和 PE 添加到接触小叶外 即膜的非接触处 可分别促进和 抑制融合孔形成 表明融合孔形成与非接触小叶的净正曲率 相关 [4] 说明半融合结构形成后 预融合的脂质双层在接触 处要形成较大的净负曲率 而在非接触处则需形成较大的净 正曲率 半融合结构才能进一步形成融合孔在生物物理学上 PE 的头基较少与水结合 使得相邻 的富含 PE 的脂质双层可以容易地彼此相互作用 [5] Kreutzberger 等 [17] 在对细胞胞吐过程的研究中指出 PE 可促进膜变 形和稳定融合孔 Irie 等 [5] 在通过定量 PCR 和 shRNA 介导 基因敲除的方法研究破骨细胞形成过程中磷脂的动力学 首 次证明了 PE 在质膜中的重新分布 从脂质双层的内层小叶 转移至外层小叶 是破骨细胞融合所必需的 其中 ABCB4 和 ABCG1 负责 PE 的重新分布 将单核细胞表面 PE 固定 可使其不能融合形成多核破骨细胞 [5,18] 在融合过程中融合 蛋白的主要作用是产生和控制膜弹性应力 [3] 融合蛋白引发 脂质重排的关键步骤是将膜双层局部弯曲成指向即将与其融 合的伴侣细胞的乳头状突起 见图 1B 并且融合蛋白可通 过降低半融合结构形成和融合孔开放的能障使乳头状突起的 顶部融合 [4,19] 所以 推测将破骨细胞前体质膜中 PE 固定 或抑制 PE 在质膜中的再分配使破骨细胞前体不能形成多核2020 年 02 月 第 17 卷 第 1 期生物骨科材料与临床研究 ORTHOPAEDIC BIOMECHANICS MATERIALS AND C LINICAL STUDY破骨细胞原因可以解释为: 即使融合蛋白使 2 个破骨细胞 前体间密切接触 但由于质膜外层小叶中无足够的 PE 使 得细胞前体间的相互作用力不足 致使二者不能进行融合;在破骨细胞前体间的接触小叶处不能形成有效的或足够大 的负性曲率 从而抑制破骨细胞前体由半融合结构向融合孔 方向发展融合孔是发生融合的 2 个脂质双层膜间内 外层小叶之 间的连接 它的形成在细胞间建立了水性连接 见图 1D 融合孔形成后相互融合的前体细胞间有内层小叶脂质和水内 容物的混合 [16,20] 融合孔的结构是由融合蛋白跨膜结构域TMD 围成的完全蛋白质通道样结构 且其外层可能被脂 质覆盖 从而在膜的接触小叶之间形成脂质连接 [21]图 1 两细胞脂质双分子层间的融合是通过半融合途径进行的 A B C D 为两个细胞膜脂质双分子层的融合顺序 A. 2 个预融合 细胞间在促融合剂作用下或相互识别后 逐步相互靠近或接触; B. 2 个预融合细胞膜脂质双分子层局部弯曲成乳头状突起; C. 半融合结 构形成: 2 个细胞膜 脂质双分子层 呈乳头状突起 脂质双分子层中 的外层小叶相互接触混合 而内层小叶仍各自保持独立; D. 融合孔 形成: 2 个细胞膜脂质双分子层中的内外层小叶以及 2 个细胞的胞 浆相互混合PEPCLPC图 2 不同的脂质分子可自发地形成不同的曲率的单层 从而表现为 不同的子形状: A. 磷脂酰乙醇胺 PE 可形成的锥形单层 单层向烃 链的方向上膨胀 ; B. 磷脂酰胆碱 PC 可形成几乎平坦的单层; C. 溶 血磷脂酰胆碱 LPC 可形成倒锥形的单层 单层向极性头的方向上 膨胀ATP 门控 P2X7 受体是属于 P2X 嘌呤能受体家族的质膜受体 由造血起源的细胞表达 其活化后主要通过改变细胞 膜对离子的通透性 从而触发多种细胞内信号传导事件 如 细胞因子释放 炎症 免疫应答和细胞凋亡 [22-23] 另外 有 研究表明 P2X7 受体参与多核巨细胞和细胞多核化的产生[24] 在体内 外人破骨细胞均可表达 P2X7 受体 且 P2X7 受体 具有明显的成孔作用 用拮抗剂氧化 ATP 用单克隆抗体阻 断 P2X7 受体或抑制 P2X7 受体基因表达均可显著抑制破骨 细胞前体间的融合 所以 P2X7 受体可能参与破骨细胞间融 合孔的形成 [24]脂筏 lipid-raft 是位于质膜的外层小叶中由脂质 脂 质 胆固醇 鞘脂和饱和脂肪酸 [25-26] 和脂质 蛋白质 [27]膜 肌动蛋白细胞骨架 相互作用形成的动态结构域 大 小约 70 nm stomatin 是脂筏的主要成分之一 在许多细胞类 型中广泛表达 存在于质膜和外泌体中 具有疏水结构域 棕榈酰化和寡聚化等特殊结构 其可通过分子间相互作用来 调节膜受体 并诱导不同类型的细胞融合形成多核细胞 [28-29] 当外泌体与靶细胞膜融合或者以胞吞作用进入靶细胞后 stomatin 可在脂筏内形成高级寡聚体并执行其功能 stomatin 可通过共聚效应促进促融合蛋白之间的相互作用 也可通过 增加质膜渗透性来缓解膜弯曲应力 导致促融合分子聚集 到肌动蛋白细胞骨架上 从而作为刚性支撑平台或肌动蛋 白聚合位点以驱动融合孔的扩张 在破骨细胞形成过程中 stomatin 的增加可促进 preOC 融合 stomatin 的减少抑制 preOC 融合 [30] 3 展望破骨细胞融合过程包括识别 融合中间结构和融合孔的 形成 破骨细胞前体间的融合与破骨细胞大小及其骨吸收能 力密切相关 故对其融合进行调控有望成为治疗骨吸收亢进 性疾病的突破点 目前 已确定与融合中间结构形成有关的 分子包括 ABCB4 ABCG1 P2X7 受体等 然而 这些分 子并非是 preOC /OC 特异表达 如单用某种药物来长期抑 制破骨细胞的形成可导致严重的不良反应 因此 深入研究 破骨细胞特异性融合蛋白 或分子 可为研发治疗骨吸收 亢进性疾病的特异性药物奠定基础参考文献 [1] Diepenhorst NA, Nowell CJ, Rueda P, et al. 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细胞融合技术研究进展
细胞融合技术研究进展随着生物科技的发展，细胞融合技术已成为重要的研究手段之一。
细胞融合技术是指将两个或多个不同来源的细胞融合成为一个细胞而形成的一种技术。
这种技术可以改变细胞表达的基因、蛋白质和代谢物质等特征，从而产生新的生物功能。
细胞融合技术目前已广泛应用于生物医学、农业、食品工业等多个领域。
本文将从细胞融合技术的基本原理、研究进展和应用前景三个方面进行阐述。
一、细胞融合技术的基本原理1.1 细胞融合机制细胞融合是指两个或多个细胞膜在一定条件下融合成为一个细胞的现象，融合的机制与人体生殖细胞和免疫细胞有关。
其中，生殖细胞是通过卵子与精子的融合而产生的新生命，免疫细胞则是为了对抗病原体而融合形成多核细胞，起到放大杀伤作用。
1.2 细胞融合技术的操作步骤细胞融合技术通常是通过两种或多种不同来源的细胞融合来产生新的细胞，按照操作方式的不同，可分为自然融合和人工融合两种方式。
自然融合：几乎所有人类细胞都可以形成细胞融合状态，如卵子和精子的结合。
人工融合：通常需要特殊条件，比如高浓度聚乙二醇、电脉冲等。
细胞融合技术常用于以下几个方面：构建免疫融合瘤细胞、制备单克隆抗体、制备基因工程生物等。
2.1 核移植技术核移植技术是指将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞的胞浆中，以此产生新的生物体。
这种技术被称为克隆技术的基础。
2.2 基因重组基因重组是指将两种不同的基因或同一基因的不同部分重新组合形成一个新的基因。
借助细胞融合技术可以使共同表达基因的细胞融合，从而实现新的基因重组。
2.3 细胞融合生物的生成细胞融合技术可以产生许多特殊的细胞，如免疫融合瘤、核仁瘤、杂交瘤等细胞。
这些细胞除了具备父母双亲的某些特征外，还拥有一些新的遗传特征，可以应用于生物医学等领域。
3.1 微生物发酵工程利用细胞融合技术可以构建新的高效发酵菌株，改良微生物代谢途径，增加产物产量、提高发酵效率等，实现绿色、可持续的生产方式。
3.2 细胞治疗细胞融合技术可用于干细胞和分化细胞的融合，产生细胞重构或细胞异核瘤等特殊细胞，促进体内细胞再生，缓解或治疗某些疾病。
细胞融合技术及进展
细胞融合技术及进展摘要：细胞工程是四大生物工程之一，细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果，而且应用领域不断扩大。
本文综述了关于细胞融合的基本理论并重点综述了细胞融合的基本方法及最新进展。
关键字：细胞融合生物技术方法综述前言细胞工程是生物工程主要组成之一，出现于20世纪70年代末至80年代初，是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。
细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段，而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发生生物学，特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的意义。
细胞融合使细胞能不受种属的局限可实现种间生物体细胞的融合，使远缘杂交成为可能，因而是改造细胞遗传物质的有力手段。
它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限，扩大了遗传物质的重组范围。
但融合后获得的杂种细胞具有染色体异倍性，致使细胞株的遗传性不稳定、植株不育性、畸形、生育迟缓等不符合育种要求的性状出现，直接利用杂种细胞作育种材料目前还有许多障碍。
细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，在技术和仪器设备上的要求不像基因工程那样复杂，投资少，有利于广泛开展研究和推广，有着重大的实践意义，正得到科学界的日益重视。
随着细胞融合技术研究的不断深入，细胞融合技术的发展前景及其产生的影响将日益显著。
1关于细胞融合的基本理论及概念所谓细胞融合就是指在外力(诱导剂或促融剂)作用下，两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合(cell fusion)或细胞杂交(cell hybridization) 。
如取材为体细胞则称体细胞杂交(somatic hybridization)。
细胞融合技术讲义
细胞融合技术讲义上一节我们讲了细胞融合过程，这里系统学习一、细胞融合技术的研究进展Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。
Virchow（微尔啸）于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。
Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。
细胞是生命的基本单位，一般由细胞核、质、膜构成。
一般来说，多数细胞只有一个细胞核，如果某些细胞出现了多核现象，那是一般是出了什么问题？细胞融合，两个细胞融合就是双核，多核可能是多个细胞融合的结果。
Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。
Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。
1958年日本学者冈田单雄发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。
1974年华裔加拿大学者KAO高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。
1978年德国科学家梅歇尔斯融合了番茄和马铃薯，嫁接技术。
科学家也把两种不同的植物细胞融合起来，生成新品种。
20世纪80年代出现了电融合技术、电磁融合技术、激光融合等随着新型技术的出现，细胞融合也由自发融合进入了诱导促进阶段，细胞间的融合率大大提高，其应用领域也得到了迅速的推广，被广泛应用于食品、药品、发酵工业中。
如我们熟知的酱油，酱油是利用曲霉菌发酵生产的，其品质取决于曲霉菌产生的蛋白酶、肽酶等，选育产蛋白酶活力高的菌株的重要的方法就是采用细胞融合技术。
二、细胞融合技术定义在外力因素（诱导剂或促融剂）的作用下，两个或多个异源细胞（种、属）相互接触后，细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程。
诱导剂或促融剂我们在后面会讲到，比如病毒、PEG（聚乙二醇）等按照生物学分类，界门、纲、目科属种，不同的种，人和鼠，不同的界人和大豆。
细胞融合又叫原生质体融合。
细胞融合与单克隆抗体
优点： 外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；导入过
程直观； 整合率高
缺点： 设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求 低效率（尤其是大家畜） 对卵子伤害大，胚胎存活率低 基因整合随机性
2、胚胎干细胞（ES细胞）法
ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜 能细胞系。
1．核受体细胞的准备 去核卵母细胞常常作为核移植的受体细胞。 卵母细胞的来源有两种方式：一是用激素对雌体进行超排处理， 从输卵管冲出体内成熟的卵母细胞。二是从屠宰场收集卵巢，吸出 滤泡中的卵丘—卵母细胞复合体(COCs)，在体外培养成熟后作为受 体。
2．核供体细胞的准备 在核移植操作中，细胞核供体细胞首先必须是完整的二倍体，
该细胞必须保持有供体动物完整的基因组； 其次，供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产生细
胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一样，能重新完成 从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。
供体细胞主要有两大类：胚胎卵裂球和体细胞。另外，核供 体细胞的来源还有胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞。
3．细胞核移植 常用的核移植方法有两种，即胞质内注射和透明带下注射。胞质
细胞融合和单克隆抗体 胡丽芳
一、细胞融合
细胞融合，又称体细胞杂交或细胞杂交，是指在离体条件 下用人工方法将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞 通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。 杂交细胞：融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信 息的细胞。 细胞融合技术的出现标志着细胞工程的诞生。
广泛应用于单克隆抗体制备、生物的远缘杂交、新品种培 育等。
体外培养 注射到小鼠腹腔
单克隆抗体
单抗的制备过程要点：
1. 动物特异性免疫 2. 分离B淋巴细胞（B）；培养骨髓瘤细胞（G）。注意B淋巴细胞
细胞融和实验心得
细胞融和实验心得介绍细胞融和实验是一种常用的实验方法，用于研究细胞融合、细胞膜的功能以及细胞间相互作用等问题。
本文将详细介绍细胞融和实验的流程和技巧，并分享一些实验心得。
实验流程细胞融和实验的基本流程如下：1.选择相应的细胞系：根据研究目的选择适合的细胞系，如癌细胞系、原代细胞系等。
2.细胞培养：将细胞培养在合适的培养基中，保证细胞的健康生长。
3.细胞准备：用PBS等缓冲液洗涤细胞，使细胞悬浮在合适的浓度。
4.细胞融和：将需要融合的细胞混合在一起，并通过适当的方法（如电融合、化学融合等）使细胞融合。
5.细胞分离：用合适的培养基对融合细胞进行培养和筛选，将未融合的细胞分离出来。
6.结果观察：观察融合细胞的形态、生长情况等，并进行相应的实验分析。
实验技巧在进行细胞融和实验时，有一些技巧可以提高实验的成功率和准确性：1. 细胞培养•选择适合的培养基和培养条件，保证细胞的健康生长。
•定期观察细胞的形态，及时发现并处理异常情况。
2. 细胞准备•细胞的浓度要适中，过高或过低的浓度都会影响细胞融合效率。
•注意细胞的处理时间，以防止细胞的凝聚或沉淀。
3. 细胞融合•选择合适的融合方法，如电融合、化学融合、病毒介导的融合等，根据实验需求选择最合适的方法。
•控制融合条件，如融合时间、融合温度等，不同实验可能需要不同条件的优化。
4. 细胞分离•通过培养基中添加适当的筛选物质，如抗生素、色素等，将未融合的细胞分离出来。
•注意分离细胞时的操作技巧，避免对融合细胞造成损伤。
实验心得通过多次细胞融和实验的实践，我总结出一些心得体会：1.充分准备：在进行细胞融和实验前，要充分准备所有需要的试剂和设备，并确保实验条件的稳定和一致性。
2.注意细节：实验过程中，要注意细节操作，如细胞的处理时间、细胞悬浮液的轻柔混合等。
这些看似微小的细节都可能对实验结果产生影响。
3.实验优化：根据实验结果，及时调整实验条件和方法，进一步优化实验流程，提高实验效率和准确性。
细胞融合技术及其研究进展
细胞融合技术及其研究进展摘要：自1958年Okada首次表明紫外灭活的仙台病毒可以诱导体外培养细胞融合形成多核体以来，细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术，已在医药、环保、免疫学、医药、食品以及农业等领域的基础研究和应用开发。
本文综述了细胞融合技术中的常用方法：仙台病毒（HVJ）诱导法、聚乙二醇（PEG）化学诱导法、电融合诱导法及激光诱导法的基本原理和研究进展。
关键词：细胞；细胞融合；细胞工程1 引言在细胞融合是 20 世纪发展起来的一种细胞工程技术，可以在一定的条件的诱导下使两个或多个细胞(原生质体) 相互接触，进而发生膜融合、胞质融合和核融合，从而形成杂种细胞。
细胞融合所形成的新细胞( 杂合细胞) 得到了来自两个父本细胞的遗传物质，因而具有新的遗传学或生物学特性[1]。
细胞融合逐渐成为细胞工程的一项核心技术，它不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等领域的研究提供了有力手段，而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发育生物学、免疫学、医药、食品以及农业等领域具有广泛应用价值[2]。
它已成为杂交育种、单克隆抗体制备、动物克隆以及抗癌疫苗研发等现代生物医学研究中的一项关键技术。
随着研究的不断深入，细胞融合技术的应用领域越来越广，产生的影响也日益显著，本文就其现有的研究情况进行讨论。
2 细胞融合技术2.1仙台病毒(HVJ)诱导法2.1.1仙台病毒诱导法原理1962年日本的冈田善雄偶然发现了由仙台病毒引起的细胞融合成多核细胞的现象[2]。
由于仙台病毒诱导细胞融合法较简便,特别是许多种类的细胞对其敏感,所以常选用仙台病毒作为细胞融合的诱导剂。
仙台病毒属于RNA病毒,其质膜表面存在两种糖蛋白,一种是HANA 蛋白,它具有凝集红细胞能力和神经氨酸普酶活性。
一种是F蛋白,它具有质膜融合能力(质膜和细胞膜融合的能力)、细胞融合能力和溶血能力。
仙台病毒诱导细胞融合的能力与共质膜表而两种糖蛋白有关:(1)HANA蛋白能使病毒吸附在细胞膜表面,具有凝集素的作用。
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细胞融合技术研究进展年级专业课程学生姓名学号指导教师摘要：人们对细胞融合的机理、融合方法的了解越来越多，其应用范围也越来越广。
对细胞融合的机理、方法、应用及目前存在的问题进行了综述。
关键词：细胞融合;机理;方法;应用细胞融合不仅为细胞的起源、核质关系、肌肉骨骼胎盘的发育[1]、肿瘤发生、干细胞介导的组织再生等理论领域的研究提供了有力的手段[2],而且被广泛应用于微生物学、育种学、发生生物学,特别是在单克隆抗体[3-4]及动植物远缘杂交育种方面具有重要意义。
1细胞融合的机理最近研究表明,细胞融合与病毒和细胞之间的融合以及细胞内的膜泡融合有许多相似之处,即带包被的病毒(或细胞)通过转膜病毒蛋白介导与宿主细胞的细胞膜进行融合。
I类病毒融合蛋白包括流感病毒红血球凝集素(HA)和人类免疫缺陷病毒包被蛋白,它们都具有相似的结构域,即都具有a-螺旋结构。
病毒和细胞之间正是通过这些蛋白来完成融合过程(伴随有构象的变化)的。
细胞内的膜泡融合也是如此,其相关融合蛋白包括GTPases及SNARE家族。
因此推测细胞融合采用相似的机理。
然而细胞融合蛋白并不全具有a-螺旋结构,提示a-螺旋并非融合所必需[2]。
2细胞融合的方法2.1生物法自从发现活的仙台病毒可在体内介导癌细胞融合后,人们又实现了利用灭活的病毒促进动物异种细胞融合,从而打破了细胞融合的种属屏障,推动细胞融合技术跃上新台阶。
解决病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异等问题是病毒诱导细胞融合新的研究方向。
2.2化学法2.2.1盐类融合法此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。
盐类融合剂对原生质体的破坏小。
今后研究应提高其融合率,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。
2.2.2高钙和高pH值融合法Keller首先发现高Ca2+和高pH值可以诱发融合。
Melchers用此法将烟草种内2个光敏感突变体诱导融合成功并获得100余株体细胞杂种。
提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。
2.2.3聚乙二醇融合法(PEG法)加拿大籍华人高国楠(1974)用聚乙二醇(PEG)为融合剂诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈加野豌豆与豌豆的融合[5]。
此法比病毒更易制备和控制,活性稳定,用PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合。
在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%～55%)对细胞的毒性应进一步减小。
2.3物理法2.3.1电脉冲诱导细胞融合技术电脉冲诱导细胞融合技术,产生于20世纪80年代,目前已成为细胞融合的有效手段之一。
该技术融合效率高,是PEG的100倍,操作简便、快速,对细胞无毒无害,可在显微镜下观察融合全过程[6]。
2.3.2激光融合技术1987和1989年德国海德堡理化研究所采用准分子激光器使油菜原生质体融合,从开始照射到完成融合仅需几秒钟[7]。
该法可选择任意两个细胞进行融合,易于实现特异性细胞融合,作用于细胞的应力小,定时定位性强,损伤小,参数易于控制,操作方便,可利用监控器清晰地观察整个融合过程,实验重复性好,无菌无毒性,但它只能逐一处理细胞。
2.3.3空间细胞融合技术植物细胞融合过程中由于地球重力的存在,有无液泡的原生质体密度差很大,异源细胞融合率低[8]。
在利用动物细胞融合生产单克隆抗体过程中,在地面上由于无法排除地球重力的影响,要提高B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合得率相当困难。
20世纪80年代以来,在空间材料科学的启发下,试图利用空间微重力条件改进细胞融合技术。
2.3.4离子束细胞融合技术。
20世纪80年代证实了离子注入生物效应和粒子沉积生物效应的存在,建立了质量、能量、电荷三因子作用机制体系,据此原理发展了该技术。
离子束的可操纵性高,可用微束对细胞进行超微加工,有目的地切割染色体,通过消除部分染色体或染色体的某些片段达到细胞非对称融合的目的[9]。
该项研究一旦成功,将改变传统的一对一细胞融合的弊端,减少供体细胞导入的染色体范围,使融合更具目的性,大大减少筛选的工作量,将是细胞融合研究的一大进步。
2.3.5非对称细胞融合技术。
即利用某种外界因素(如γ射线)辐照某一细胞原生质体,选择性地破坏其细胞核,并用碘乙酰胺碱性蕊香红6 G,处理在细胞核中含有优良基因的第2种原生质体,选择性地使其细胞质失活。
然后融合来自这2个原生质体品系的细胞,实现所需胞质和细胞核基因的优化组合。
实践表明非对称细胞融合技术通过γ射线X 射线照射为实现供体亲本少数基因的转移,创造种间、属间杂种提供了可能性[10]。
3细胞融合的应用3.1动物细胞融合技术的应用3.1.1用于研究细胞的核质关系。
Prescott等1972年首先应用离心术结合细胞松弛素B分离哺乳类动物细胞的胞质体获得成功,为研究哺乳类细胞的核质关系、细胞质基因的转移开创了新途径[11]。
3.1.2用于揭示疾病发生的机制。
细胞融合是一种揭示疾病机理的有效方法。
Lattanzi等将细胞融合技术与免疫荧光、生化分析、电镜技术相结合,对肌肉萎缩症发生的机理进行了研究并取得较大的进展[12]。
细胞融合技术与显微技术相结合可以研究膜蛋白动力学以及这些膜蛋白之间的关系,Aguilar等研究发现,多次跨膜蛋白Prm1在酵母细胞的结合现象中起重要作用,该蛋白缺陷的突变体不能完成质膜之间的识别与融合[13],这有助于了解禽流感病毒的致病机理。
3.1.3用于基因定位研究。
JP2杂种细胞中某一染色体或其片段的存在与细胞的某一性状表达与否相联系,从而可以实现把基因定位于某一染色体或某一区段上。
1967年Weise等发现在人和鼠的融合细胞中,人的染色体优先丢失,利用这一特点可以对人染色体上的基因进行定位。
3.1.4用于衰老机制研究。
Tam等采用细胞融合的方法在干细胞研究中揭示了衰老的分子机制:衰老是一个可逆的过程,它决定于直接或间接控制端粒长度及端粒酶活性的生物分子之间的平衡作用,通过改变染色质的状态进而进行表观遗传修饰调节基因表达[14]。
3.1.5动物细胞融合用于动物育种动物体细胞融合后,杂种细胞一般难以发育再生为一个个体,但借助于细胞核移植的方法将融合后杂种细胞的细胞核移入去核成熟卵内,可培育出新的杂种。
3.1.6动物细胞融合用于生产单克隆抗体Zou等应用细胞融合技术和酶连免疫技术成功制备出一种新基因Urg11的抗体[3]。
单抗试剂盒可对一些过敏性疾病查找过敏源(抗原检测),癌症、性病、妊娠、妇女月经排卵等进行早期诊断。
3.1.7动物细胞融合用于细胞疗法SCNT(Somatic cell nu-clear transfer)将患者的任何体细胞与去核卵细胞融合,融合子进行有丝分裂形成囊胚,囊胚的内细胞团是多能干细胞,对多能干细胞进行诱导使其定向分化可形成所需的组织和器官用于器官移植,不仅解决了器官和组织来源问题,而且避免了宿主对外来物的免疫排斥。
Lagutina等的研究工作解决了动物体细胞与去核卵细胞融合率低的问题[15]。
3.2植物细胞融合技术的应用3.2.1基础理论研究Yamagishi等设计了一种新的高效原生质体培养体系,增加了不对称杂交属内种间细胞融合率[16]。
可以设想,细胞融合技术改善后,可把人参和冬虫夏草的细胞融合产生新的品种,并具备它们各自特有的药效。
3.2.2改善作物品质杂种优势现象在生物界普遍存在,利用这一现象是提高农作物品质和产量的有效途径之一,即可以利用雄性不育系进行杂交一代种子生产。
核基因控制的雄性不育的保持系很难解决,而细胞质雄性不育的不育系、恢复系和保持系较易通过体细胞杂交短期内得到。
3.2.3培育抗逆植株Shelley用马铃薯二倍体作亲本经过体细胞杂交得到抗科罗拉多马铃薯甲虫的四倍体体细胞杂种;Bastia等对耐霜冻的野生种和栽培种进行体细胞杂交,获得的所有体细胞杂种都比栽培种亲本耐霜冻,其中有3株比野生种亲本的耐性还高[17]。
3.2.4应用于种质保存和有用物质生产目前可将各种细胞器、DNA、质粒、病毒、细菌等外源遗传物质引入原生质体,从而有可能引起细胞遗传性的改变,为某些珍稀植物的快速繁殖、植物的复壮提供可行的方法,还可应用于种质保存、无性系的快速繁殖和有用物质生产[18]。
3.3微生物细胞融合技术的应用微生物细胞融合技术一方面用于生物药品的生产,包括抗生素、生物活性物质、疫苗等;另一方面为发酵工业提供优良菌种,如酿酒酵母和糖化酵母的种间杂交,分离子后代中个别菌株具有糖化和发酵的双重能力。
4目前存在的问题及前景细胞融合的确切机理至今仍不清楚,融合后获得的杂种细胞具有染色体异倍性,致使细胞株的遗传性不稳定、植株不育性、畸形、生育迟缓等性状出现,此外,细胞融合也存在伦理方面的问题,如将人的细胞核植入牲畜细胞核内,难免会使牲畜遗传信息传入人的细胞核内,如果用于医疗,将是非常危险的。
任何事物都是一把双刃剑:了解细胞与细胞融合的机理有望对诸如细胞凋亡、神经系统发生、肿瘤发生、干细胞生物学等生命现象作出诠释,对癌症及传染病进行有效的防护和治疗。
人体皮肤细胞与动物卵母细胞融合有望克隆出人类胚胎,用于治疗性克隆研究,获取人类胚胎干细胞,再在体外诱导分化,克隆出人体全身所有组织和器官。
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