钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ和胞外信号调节激酶对高脂血症大鼠勃起功能障碍影响实验研究论文
SOX5_对大鼠成骨细胞增殖及核因子-资B_信号通路的影响
[收稿日期]2021-08-25 [修回日期]2022-09-23[基金项目]湖北省卫生健康委2021-2022年度青年人才项目(WJ2021F032)[作者简介]冷冬月(1985-),女,硕士,主治医师.[文章编号]1000⁃2200(2024)02⁃0146⁃06㊃基础医学㊃SOX5对大鼠成骨细胞增殖及核因子⁃κB 信号通路的影响冷冬月1,李旭峰2,方兴刚1(1.湖北省十堰市太和医院中西医结合科,442000;2.湖北省十堰市人民医院中医科,442000)[摘要]目的:探究Y⁃box 蛋白5(SOX5)对大鼠成骨细胞(OB)增殖及核因子⁃κB(NF⁃κB)信号通路的影响㊂方法:取新生24h SPF 级SD 乳鼠,应用酶消化法分离大鼠颅骨OB㊂形态学观察和ALP 染色鉴定成骨细胞;取生长良好的第4代OB,分为空白对照组㊁pcDNA3.1组㊁pcDNA⁃SOX5组㊁si⁃NC 组㊁siRNA⁃SOX5组㊂转染48h 后qRT⁃PCR 检测细胞中SOX5mRNA 的表达;MTT 法检测细胞增殖活力;ALP 活性检测试剂盒测量ALP 活性;茜素红染色观察钙结节的形成情况;Western blotting 检测OB 分化及NF⁃κB 信号通路相关蛋白Runt 相关转录因子2(Runx2)㊁Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)㊁NF⁃κB p65及其磷酸化蛋白㊁KB 抑制蛋白激酶α(IκBα)㊁肿瘤坏死因子α(TNF⁃α)的表达㊂结果:与空白对照组相比,pcDNA⁃SOX5组大鼠OB 中SOX5mRNA 水平㊁p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65㊁TNF⁃α蛋白表达显著升高(P <0.05),OB 增殖活力㊁ALP 活性㊁钙化结节数量和面积㊁Runx2㊁Collagen Ⅰ㊁IκBα表达显著降低(P <0.05);siRNA⁃SOX5组大鼠OB 中SOX5mRNA 水平㊁p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65㊁TNF⁃α蛋白表达明显降低(P <0.05),OB 增殖活力㊁ALP 活性㊁钙化结节数量和面积㊁Runx2㊁Collagen Ⅰ㊁IκBα表达明显升高(P <0.05)㊂结论:SOX5具有调控OB 增殖㊁分化的作用,其作用机制可能与调控NF⁃κB 信号通路有关㊂[关键词]骨质疏松;Y⁃box 蛋白5;成骨细胞;核因子⁃κB[中图法分类号]R 681 [文献标志码]A DOI :10.13898/ki.issn.1000⁃2200.2024.02.002Effects of SOX5on rat osteoblast proliferation and NF⁃κB signaling pathwayLENG Dongyue 1,LI Xufeng 2,FANG Xinggang 1(1.Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine ,Taihe Hospital ,Shiyan Hubei 442000;2.Department of Traditional Chinese Medicine ,Shiyan People′s Hospital ,Shiyan Hubei 442000,China )[Abstract ]Objective :To explore the effects of Y⁃box protein 5(SOX5)on rat osteoblasts (OB)proliferation and nuclear factor κB (NF⁃κB)signaling pathway.Methods :The newborn 24h SPF grade SD suckling rats were taken,and the OB of the rat skull was separated by enzyme digestion method.Morphological observation and ALP staining were used to identify osteoblasts.The fourth generation OBs with good growth were divided into blank control group,pcDNA3.1group,pcDNA⁃SOX5group,si⁃NC group,and siRNA⁃SOX5group.After 48h of transfection,qRT⁃PCR was used to detect the expression of SOX5mRNA in the cells;MTT method was used to detect cell proliferation viability;ALP activity detection kit was used to measure ALP activity;alizarin red staining was used to observe the formation of calcium nodules;Western blotting was used to detect OB differentiation and the expression of NF⁃κB signaling pathway⁃related proteins [Runt⁃related transcription factor 2(Runx2),type Ⅰcollagen (collagen Ⅰ),nuclear factor κB p65(NF⁃κB p65)and its phosphorylated protein,KB inhibits protein kinase α(IκBα),tumor necrosis factor α(TNF⁃α)].Results :Compared with the blank control group,the SOX5mRNA level,p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65,and TNF⁃αproteins expression in the OB of rats in the pcDNA⁃SOX5group were significantly increased (P <0.05),the OB proliferation activity,ALP activity,the number and area of calcified nodules,Runx2,collagen Ⅰ,and IκBαexpression were significantly reduced (P <0.05);the SOX5mRNA level,p⁃NF⁃κBp65/NF⁃κB p65,and TNF⁃αproteins expression in the OB of rats in the siRNA⁃SOX5group were significantly reduced (P <0.05),the OB proliferation activity,ALP activity,the number and area of calcified nodules,Runx2,collagen Ⅰ,and IκBαexpression were significantly increased (P <0.05).Conclusions :SOX5can regulate the proliferation and differentiation of OB,and its mechanism may be related to the regulation of NF⁃κB signaling pathway.[Key words ]osteoporosis;Y⁃box protein 5;osteoblasts;nuclear factor⁃κB 骨质疏松症(OP)是一种骨代谢疾病,其特征在于骨量下降,伴随着骨组织和微结构的恶化以及骨矿物质密度的下降[1]㊂在OP 中,骨形成与吸收之间的不平衡最终导致了骨的变性和易骨折[2]㊂成骨细胞(osteoblasts,OB)是一类特殊的具有成骨潜能的细胞,在骨重建及骨稳态维持中都发挥着重要的作用[3];OB活性下降是OP的主要原因[4]㊂Y⁃box蛋白5(SOX5)是SOX家族SoxD组的成员,编码控制细胞命运的各种转录因子并在许多谱系中进行分化,包括神经元㊁软骨细胞和B细胞[5-7]㊂研究[8-9]表明SOX5与类风湿关节炎和软骨形成密切相关,是治疗绝经后OP的有希望的分子靶标㊂已经在卵巢切除小鼠的骨髓细胞中发现了差异表达的SOX5;且与绝经前健康女性的骨髓样本相比,绝经后OP病人骨髓中SOX5的mRNA和蛋白表达水平显著上调;SOX5过表达可抑制人间充质干细胞的成骨分化[10]㊂而SOX5对OB增殖的分子功能及作用机制尚不明确;因此,本研究以大鼠OB为对象,探讨SOX5对OB增殖的影响及其潜在的作用机制,为OP的治疗及药物开发提供参考㊂1 材料与方法1.1 实验材料 出生24h的SPF级SD乳鼠10只,雌雄不限,质量(10±3)g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证为SCXK(京)2019⁃0009㊂饲养温度(20±2)℃,相对湿度为45%~60%㊂胎牛血清㊁胰蛋白酶㊁RPMI1640培养基均购自美国GIBCO公司;TRIzol RNA分离试剂及SYBR®Premix Ex Taq TM 试剂盒均购买于日本TaKaRa公司;Lipofectamine TM 2000转染试剂盒购自美国Thermo公司;pcDNA⁃SOX5和pcDNA3.1载体㊁siRNA⁃SOX5和其阴性对照(si⁃NC)以及PCR引物序列由上海GenePharma 公司设计合成;氯化十六烷基吡啶鎓(美国Sigma⁃Aldrich,货号:C9002);碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)检测试剂盒(P0321S)㊁MTT试剂盒(C0009S)购自碧云天生物科技公司;茜素红染色试剂(北京索莱宝科技有限公司,货号:G8550);兔抗大鼠Runt相关转录因子2(runt⁃related transcription factor2,Runx2)(ab236639)㊁Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)(ab270993)㊁核因子⁃κB p65 (nuclear factor kappa⁃B p65,NF⁃κB p65) (ab16502)㊁p⁃NF⁃κB p65(ab76302)㊁肿瘤坏死因子α(TNF⁃α)(ab205587)㊁KB抑制蛋白激酶α(KB inhibits protein kinaseα,IκBα)(ab109300)㊁山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)㊁β⁃actin(ab8227)均购自英国abcam公司㊂细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司);ABI Prism®7300型荧光定量PCR系统(美国);倒置荧光显微镜(IX73,购自日本Olympus公司);iMark680多功能酶标仪㊁蛋白转膜装置购自美国Bio⁃Rad公司㊂1.2 成骨细胞的分离、鉴定 应用酶消化法分离大鼠颅骨成骨细胞[11]㊂取新生24h内SD乳鼠,处死后,乙醇浸泡5min,在无菌条件下,取出头盖骨,PBS冲洗后切成1mm3的骨颗粒,37℃水浴中用0.1%的胶原酶以1∶10的比例将骨颗粒消化分离20min,然后再次用胶原酶分离约1h㊂将分离获得的悬浮液以1200r/min离心,去上清液,用PBS漂洗3次,并加入含有15%胎牛血清㊁青霉素(100U/mL)和链霉素(100U/mL)的培养液㊂在37℃㊁5%CO2下孵育,1周换液2次,待细胞融合约80%时传代,换用成骨诱导培养基(基础培养基+50μg/mL维生素C+10mmol/Lβ⁃甘油磷酸钠+10nmol/L地塞米松)㊂取第3代细胞通过ALP染色和形态观察行成骨细胞鉴定,取生长良好的第4代细胞用于实验㊂鉴定成骨细胞:(1)形态学观察:在倒置相差显微镜下观察原代和继代培养成骨细胞的生长和形态变化,并在随机选择的视野中拍照㊂(2)ALP染色:将第3代的成骨细胞培养7d,并参照ALP染色试剂盒的说明进行ALP染色㊂去除成骨细胞的培养基,PBS清洗细胞2~3次,并用4%多聚甲醛固定10min㊂清洗后加入300μL显色液,避光于37℃的培养箱中孵育2h,显微镜下观察㊂1.3 分组及转染 取生长良好的第4代成骨细胞,按每孔2×106个接种于24孔板,分成5个处理组:(1)空白对照组,不进行任何转染;(2)pcDNA3.1组,用Lipofectamine2000按照说明书将100nmol/L pcDNA3.1转染至成骨细胞;(3)pcDNA⁃SOX5组,用Lipofectamine2000按照说明书将100nmol/L pcDNA⁃SOX5转染至成骨细胞;(4)si⁃NC组,将si⁃NC转染至成骨细胞;(5)siRNA⁃SOX5组,将siRNA⁃SOX5转染至成骨细胞㊂转染48h后收获细胞以进行后续实验㊂1.4 qRT⁃PCR检测细胞中SOX5mRNA的表达 使用TRIzol试剂提取细胞总RNA,使用分光光度计测量总RNA的浓度㊂按照试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA,进行PCR扩增(见表1)㊂反应体系(20μL):cDNA(200ng/μL)2μL,SYBR®Premix Ex Taq TM(2×)10μL,上下游引物各0.4μL,ddH2O7.2μL㊂循环条件:94℃持续10min,然后在94℃持续10s,60℃持续20s和72℃持续1min进行40个循环㊂用β⁃actin作为对照,相对SOX5mRNA的表达量采用2-ΔΔCt方法计算㊂表1 RT⁃PCR引物序列基因引物序列SOX5F:5′⁃CAG CCA GAG TTA GCA CAA TAG G⁃3′R:5′⁃CTG TTG TTC CCG TCG GAG TT⁃3′β⁃actinF:5′⁃TTG CGT TAC ACC CTT TCT TG⁃3′R:5′⁃TGT CAC CTT CAC CGT TCC A⁃3′1.5 MTT法检测细胞增殖活力 转染48h后将成骨细胞以2×103细胞/孔的浓度接种到96孔板中,继续培养24h,然后每孔中加入20μL的MTT溶液(5mg/mL),于培养箱中孵育4h,吸去上层清液后加入150μL的DMSO, 490nm波长处测定各孔吸光度值(OD),计算细胞增殖率㊂细胞增殖率=(实验组OD值-空白孔OD 值)/(对照组OD值-空白孔OD值)×100%㊂1.6 ALP活性测定 ALP是成骨细胞分化的早期标志㊂将转染的成骨细胞用成骨培养基培养7d㊂然后,除去OM培养基,并使用0.1%TritonX⁃100裂解细胞获得细胞裂解液,然后12000g离心10min,取上清液为样品㊂使用ALP活性检测试剂盒测量上清液中ALP活性㊂于405nm处测定各组OD值,使用对硝基苯酚绘制标准曲线;另用BCA法测定每个样品的总蛋白浓度㊂并将每个样品的ALP活性标准化为相应的总蛋白含量㊂1.7 茜素红染色 采用茜素红染色观察钙结节的形成数量,评估成骨细胞的矿化能力㊂成骨细胞按1.3方法进行分组处理,转染后将细胞培养2周,弃去培养液,细胞用PBS洗涤2次,并在室温下用4%多聚甲醛固定30min㊂弃去多聚甲醛,PBS洗涤后在37℃下用0.1%茜素红染液染色1h㊂倒置光学显微镜下观察图像并拍照,并使用Image⁃Pro Plus6.0软件统计钙化结节染色阳性区域的面积和数量㊂1.8 Western blotting检测成骨细胞NF⁃κB信号通路相关蛋白的表达 使用RIPA裂解液提取细胞中蛋白质㊂使用BCA试剂盒对蛋白质浓度进行定量㊂取等量蛋白质样品上样(每泳道30μg),10%SDS⁃PAGE分离蛋白质,并通过半干转移将其转移到PVDF膜上㊂将膜用5%脱脂牛奶封闭,并在4℃下与一抗(Runx2㊁CollagenⅠ㊁NF⁃κB p65㊁p⁃NF⁃κB p65㊁TNF⁃α㊁IκBα㊁β⁃actin,1∶1000)孵育过夜㊂第2天,将膜与偶联辣根过氧化物酶的二抗孵育(1∶2000)2h,然后使用化学发光试剂盒(ECL)进行显色㊂以β⁃actin为内参,分析结果㊂1.9 统计学方法 以上所有实验均重复3次㊂采用单因素方差分析(One⁃way ANOVA),Tukey的事后检验用于单因素方差分析后的成对比较㊂2 结果2.1 成骨细胞原代培养和鉴定 原代培养第3天,倒置相差显微镜下见成骨细胞从碎骨块周围爬出,呈放射状贴壁生长,形态不规则,呈多边形或三角形,有较多突起,单核卵圆形, 1~2个核仁,胞质丰富清晰,ALP染色呈阳性,蓝黑色颗粒沉积在细胞质及细胞核ALP活性部位(见图1)㊂2.2 各组成骨细胞中SOX5mRNA的表达 与空白对照组相比,pcDNA⁃SOX5组大鼠OB 中SOX5mRNA水平显著升高(P<0.05),siRNA⁃SOX5组大鼠OB中SOX5mRNA水平明显降低(P <0.05)(见表2)㊂表2 各组大鼠OB中SOX5mRNA水平比较(x±s;n i=3)分组SOX5mRNA空白对照组 1.00±0.00 pcDNA3.1组 1.02±0.01 pcDNA⁃SOX5组 4.65±0.37*si⁃NC组 1.01±0.01 siRNA⁃SOX5组0.41±0.05* F315.94 P<0.01 MS组内0.028 q检验:与空白对照组比较*P<0.052.3 各组成骨细胞增殖活力 与空白对照组相比,pcDNA⁃SOX5组大鼠OB增殖活力显著降低(P <0.05),siRNA⁃SOX5组大鼠OB 增殖活力明显升高(P <0.05)(见表3)㊂表3 各组大鼠OB 增殖活力比较(x ±s ;n i =3)分组增殖率/%空白对照组100.00±0.00pcDNA3.1组102.13±10.01pcDNA⁃SOX5组64.75±6.16*si⁃NC 组104.06±9.31siRNA⁃SOX5组137.31±7.42* F144.83 P<0.01 MS 组内55.976 q 检验:与空白对照组比较*P <0.052.4 各组成骨细胞ALP 活性 与空白对照组相比,pcDNA⁃SOX5组大鼠OB中ALP 活性显著降低(P <0.05),siRNA⁃SOX5组大鼠OB 中ALP 活性明显升高(P <0.05)(见表4)㊂表4 各组大鼠OB 中ALP 活性比较(x ±s ;n i =3)分组ALP 活性空白对照组 1.00±0.00pcDNA3.1组 1.03±0.08pcDNA⁃SOX5组0.75±0.05*si⁃NC 组 1.02±0.06siRNA⁃SOX5组1.54±0.09* F 60.49 P<0.01 MS 组内0.004 q 检验:与空白对照组比较*P <0.052.5 各组成骨细胞钙结节形成情况 倒置显微镜下观察可见细胞呈多层重叠生长,各组细胞间均可见橘红色钙化结节;与空白对照组相比,pcDNA⁃SOX5组大鼠OB 钙化结节数量和面积显著降低(P <0.05),siRNA⁃SOX5组大鼠OB 钙化结节数量和面积明显增加(P <0.05)(见图2㊁表5)㊂2.6 各组成骨细胞分化及NF⁃κB 信号通路相关蛋白的表达 与空白对照组相比,pcDNA⁃SOX5组大鼠OB 中p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65㊁TNF⁃α蛋白表达显著升高,Runx2㊁Collagen Ⅰ㊁IκBα表达显著降低(P <0.05),siRNA⁃SOX5组大鼠OB 中p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65㊁TNF⁃α蛋白表达明显降低,Runx2㊁Collagen Ⅰ㊁IκBα表达明显增加(P <0.05)(见图3㊁表6)㊂3 讨论 OB 是骨形成的主要功能单位,负责骨骼重塑过程中骨骼基质的合成㊁分泌和矿化㊂OB 在维持骨量和减少骨质流失中起关键作用㊂刺激OB 增殖并促进其分化成熟是调节骨代谢㊁促进新骨形成㊁修复骨缺损的重要方法[12]㊂MTT 法是检测细胞增殖的指标,可以反映生活细胞的代谢水平㊂本研究采用MTT 法检测SOX5对OB 增殖活性的影响,结果显示SOX5mRNA 过表达后,对体外培养的OB 增殖有明显的抑制作用,而采用siRNA 技术干扰SOX5的表达后,OB 增殖率明显增加;表明沉默SOX5具有促进OB 增殖的作用㊂ OB 的增殖通常通过测量细胞总蛋白㊁ALP 活性和Collagen Ⅰ分泌来评估㊂ALP 是OB 分泌的一组膜结合糖蛋白,是OB 早期分化的特异性标志,ALP 活性的高低,能较客观地反映OB 分化成熟的程度[13]㊂Runx2㊁Collagen Ⅰ是OB 相关的蛋白,在成骨分化活动中起重要的促进作用[4],在增殖阶段,OB 分泌Collagen I 以帮助矿化并减少骨质流失㊂OB 分化成熟后多层重叠生长形成结节样结构,并不断分泌基质和矿物质,形成矿化结节㊂茜素红染色可以评估成骨分化晚期细胞外基质矿化情况钙化结节的形成情况[14]㊂本实验中,将转染的OB 用成骨培养基培养7d 后,通过ALP 活性检测了SOX5对OB 分化的影响,结果显示SOX5过表达后,ALP 活性值较低,OB 钙化结节数量和面积降低,且Runx2㊁Collagen Ⅰ表达减少,分析可能与细胞增殖㊁分化受到抑制有关;而SOX5mRNA 表达下调时,ALP 活性㊁细胞钙化程度及Runx2㊁CollagenⅠ表达增加㊂分析沉默SOX5促进成骨细胞ALP活性的原因可能是:(1)与促进细胞增殖有关,OB数量的增加,分泌的ALP也随之增加;(2)上调ALP mRNA表达水平,促进ALP的分泌,调节OB的分化㊂表5 各组大鼠OB钙结节形成情况(x±s;n i=3)分组钙化结节数量钙化结节面积/mm2空白对照组898.62±51.4360.54±5.71 pcDNA3.1组901.05±72.6161.12±5.63 pcDNA⁃SOX5组616.47±60.54*33.28±4.17* si⁃NC组895.09±58.3062.35±4.24 siRNA⁃SOX5组1174.81±73.42*89.76±6.79* F28.7041.08 P<0.01<0.01 MS组内4074.34729.154 q检验:与空白对照组比较*P<0.05表6 各组大鼠OB分化及NF⁃κB信号通路相关蛋白的表达(x±s;n i=3)分组Runx2CollagenⅠ p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65 IκBαTNF⁃α空白对照组0.98±0.10 1.12±0.11 0.49±0.04 0.89±0.080.32±0.02 pcDNA3.1组 1.01±0.09 1.10±0.10*0.51±0.050.91±0.070.31±0.03 pcDNA⁃SOX5组0.66±0.07*0.74±0.07* 1.28±0.11*0.40±0.05*0.87±0.06* si⁃NC组0.99±0.06 1.08±0.090.52±0.070.88±0.040.34±0.04 siRNA⁃SOX5组 1.25±0.08* 1.31±0.12*0.33±0.04* 1.22±0.06*0.16±0.03* F20.0312.8892.2768.09150.30 P<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01 MS组内0.0070.0100.0050.0040.001 q检验:与空白对照组比较*P<0.05 NF⁃κB控制主要骨骼细胞类型(破骨细胞[15]㊁成骨细胞[16]和软骨细胞[17])的分化或活性㊂生理和病理性骨重塑的刺激都会影响NF⁃κB信号转导[18];NF⁃κB的启动子活性主要是由核移位和NF⁃κB磷酸化引起[19]㊂在静息细胞中,NF⁃κB以NF?κB/IκBα复合物的形式存在于细胞质;在病理条件下,刺激激活核因子抑制剂IκB激酶(IκB kinases, IKKs),该激酶通过靶向将IκBα蛋白降解,释放NF⁃κB并允许其核移位和DNA结合,促进TNF⁃α㊁IL⁃1β等炎性因子的表达,减少骨细胞形成,使OB增殖㊁分化能力降低㊂研究发现NF⁃κB的激活下调OB分化[20];抑制IκBα的降解,稳定NF⁃κB/IκBα复合物,可抑制NF⁃κB的活化,减少炎性因子的释放[21-22]㊂HUANG等[23]发现在人牙槽骨OB分化中,三七皂苷R1可通过抑制NF⁃κB通路,逆转TNF⁃α诱导的钙结节和ALP活性的降低㊂杨青坡等[24]发现姜黄素能降低骨组织中NF⁃κB表达,明显改善OP大鼠骨密度㊂在本研究中,我们通过pcDNA3.1质粒转染构建SOX5过表达OB,发现大鼠OB中磷酸化NF⁃κB p65㊁TNF⁃α蛋白表达升高, IκBα表达降低,说明NF⁃κB信号通路被激活;而沉默SOX5的表达后,IκBα表达增加,磷酸化NF⁃κB p65㊁TNF⁃α表达降低,提示NF⁃κB信号通路被抑制㊂综上所述,沉默SOX5具有促进OB增殖的作用,并可调节OB的分化,其作用机制可能与抑制NF⁃κB信号通路的激活有关,过表达SOX5则发挥相反作用㊂但本研究尚存在一定不足,未对NF⁃κB 信号通路进行干扰从反面进行验证;此外,由于体内外环境的巨大差异,在体内沉默SOX5是否发挥相同的作用,有待进一步研究㊂[参考文献][1] MENG YC,LIN T,JIANG H,et al.miR⁃122exerts inhibitoryeffects on osteoblast proliferation/differentiation in osteoporosis byactivating the PCP4⁃Mediated JNK pathway[J].Mol Ther NucleicAcids,2020,20:345.[2] 杨菁,聂子淮,滕斌,等.基于FRAX风险评估的分层管理在社区老年骨质疏松症病人中的应用研究[J].蚌埠医学院学报,2022,47(2):254.[3] CHOTIYARNWONG P,MCCLOSKEY EV.Pathogenesis ofglucocorticoid⁃induced osteoporosis and options for treatment[J].Nat Rev Endocrinol,2020,16(8):437.[4] HUANG M,LI X,ZHOU C,et al.Noncoding RNA miR⁃205⁃5pmediates osteoporosis pathogenesis and osteoblast differentiationby regulating RUNX2[J].J Cell Biochem,2020,121(10):4196.[5] ZAWERTON A,MIGNOT C,SIGAFOOS A,et al.Widening ofthe genetic and clinical spectrum of lamb⁃shaffer syndrome,aneurodevelopmental disorder due to SOX5haploinsufficiency[J].Genet Med,2020,22(3):524.[6] LIU F,LIU X,YANG Y,et al.NEAT1/miR⁃193a⁃3p/SOX5axisregulates cartilage matrix degradation in human osteoarthritis[J].Cell Biol 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钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在维拉帕米逆转肺腺癌顺铂化疗耐药中的作用
钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在维拉帕米逆转肺腺癌顺铂化疗耐药中的作用刘淼;范平生;张腾跃;黄金;樊高飞;刘亚贝【摘要】目的探讨钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在维拉帕米逆转肺腺癌顺铂化疗耐药中的作用.方法在肺腺癌细胞系(A549)中,采用CCK-8法检测维拉帕米逆转顺铂耐药的能力,采用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测维拉帕米逆转顺铂耐药中凋亡水平的效果,采用Western blotting检测逆转耐药过程中P-CaMKⅡ/CaMKⅡ蛋白表达水平的变化.结果在肺腺癌细胞系(A549)中,单药顺铂组、顺铂联合维拉帕米组的细胞增长抑制率分别为(55.00±2.60)％、(32.30±1.80)％,差异有统计学意义(P＜0.05).凋亡实验表明,单药顺铂组细胞凋亡率为10.30％,顺铂联合维拉帕米组为21.60％,差异有统计学意义(P＜0.05).Western blotting结果显示,在A549细胞中,顺铂联合维拉帕米组P-CaMKⅡ/CaMKⅡ的表达明显低于单药顺铂组.结论在肺腺癌细胞中,CaMKⅡ参与维拉帕米逆转化疗耐药的过程.【期刊名称】《实用临床医药杂志》【年(卷),期】2019(023)010【总页数】4页(P5-8)【关键词】肺腺癌;维拉帕米;顺铂;耐药性;钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ【作者】刘淼;范平生;张腾跃;黄金;樊高飞;刘亚贝【作者单位】安徽省肿瘤医院,中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学生命科学与医学部,安徽合肥,230000;安徽省肿瘤医院,中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学生命科学与医学部,安徽合肥,230000;安徽省肿瘤医院,中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学生命科学与医学部,安徽合肥,230000;安徽省肿瘤医院,中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学生命科学与医学部,安徽合肥,230000;安徽省肿瘤医院,中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学生命科学与医学部,安徽合肥,230000;安徽省肿瘤医院,中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学生命科学与医学部,安徽合肥,230000【正文语种】中文【中图分类】R734.2目前，早期肺癌仍缺乏有效的诊断手段，大多数肺癌患者初诊时已为中、晚期，错过了根治性治疗的机会[1]。
植物蛋白磷酸酶2C结构和功能的研究现状与进展
浙江大学学报（农业与生命科学版）47（1）：11~20，2021Journal of Zhejiang University (Agric.&Life Sci.)http ：///agr E -mail ：zdxbnsb @植物蛋白磷酸酶2C 结构和功能的研究现状与进展陈耘蕊，毛志君，李兆伟，范凯*（福建农林大学农学院，作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室，福州350002）摘要蛋白磷酸酶是蛋白质可逆磷酸化过程中2个关键酶之一，蛋白磷酸酶2C （protein phosphatase 2C,PP2C ）是蛋白磷酸酶的重要成员。
PP2C 是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，可以调控真核生物细胞生命活动。
PP2C 成员主要参与激素信号转导途径，尤其可作为脱落酸信号途径的关键调节因子，能响应各种生物和非生物胁迫，在器官发育和种子萌发等方面也具有重要的促进作用。
在不同的植物中也发现了越来越多的PP2C 成员，该酶在不同的植物、不同的生长环境以及不同的生理活动中均有不同的调控方式，这也是目前及今后对PP2C 成员的研究方向。
本文主要介绍了植物PP2C 家族的结构特点、亚细胞定位及其在生长发育、激素信号转导、逆境胁迫方面的研究现状，以及在提高植物生物产量、促进果实发育等方面的新进展。
关键词蛋白磷酸酶2C ；植物生长发育；激素信号转导；胁迫响应中图分类号Q 945文献标志码AResearch status and progress in structure and function of protein phosphatase 2C in plants.Journal of Zhejiang University (Agric.&Life Sci.),2021,47(1):11-20CHEN Yunrui,MAO Zhijun,LI Zhaowei,FAN Kai *(Key Laboratory of Ministry of Education for Genetics,Breeding and Multiple Utilization of Crops,College of Agriculture,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China )Abstract Protein phosphatase is one of the two key enzymes in the process of protein reversible phosphorylation.Protein phosphatase 2Cs (PP2Cs)are the important members of protein phosphatases.They are attributed to serine/threonine protein phosphatases (STPs)and can regulate the life activities of eukaryotic cells.PP2C members play an important role in hormone signal transduction pathways,especially abscisic acid (ABA)signal pathways;they can respond to various biotic and abiotic stresses,and also regulate organ development and seed germination.Recently,more and more PP2C members are found in plants.The regulation mechanisms of the PP2C members are diverse in different plants,different growth environments,and different physiological activities.The related research is an important topic.This review mainly introduces the structural characteristics,and subcellular localization of PP2C family in plants,and the research progresses in plant growth and development,hormone signal transductions,and stress responses,as well as in aspects of improving plant biological yield and promoting fruit development.Key words protein phosphatase 2C;plant growth and development;hormone signal transduction;stress responseDOI ：10.3785/j.issn.1008-9209.2020.05.291基金项目：国家自然科学基金（31701470）；中国博士后科学基金（2017M610388，2018T110637）；福建农林大学杰出青年科研人才计划（xjq201917）。
CaMKⅡ对心肌细胞影响的研究进展
Ｗｏ ｄＪｕ ｌ ｆｎｅ ｔｄＴａｉｏａ ａ ｄＷｅｔ ｎＭ ｄｃｎ ２ １ ， ｏ ７ Ｎ ． ｒ ｏｍａ ｏ ｔ ｅ ｒｄｔ ｎ１ ｎ ｓ ｒ ｅｉｉｅ ０ ２ Ｖ １ ，ｏ２ ｌ Ｉ ￣ａ ｉ ｅ ．
・１ ７ ・ ７
胞 后 除极 ， 而诱 发 恶 性 室性 心 律 失 常 ， ａ 从 Ｃ ＭＫⅡ是
转 录 因子促 进 心 肌 肥 大 ， 主要 包 括 Ａ Ｐ 活 化 转 录 Ｎ 、
因子 一１ ｃ ＭＰ反 应 元 件 结 合 蛋 白 （ Ａ ｅｐ ｎｅ 、Ａ ｃ ＭＰ ｒｓｏ ｓ ｅ ｍ ｎ ｂｎ ｉｇｐｏ ｉ， Ｒ Ｂ 以及 心肌 细胞增 强 因 ｌ ｅ ｔ ｉｄｎ ｒｔ ｎ Ｃ Ｅ ） ｅ ｅ 子 ２ ｍ ｏｙｅｅｈ ｎ ｅ ￣ｃ ｒ ， ） （ ｙ ｃｔ ｎ ａ ｃｒ ｔ ＭＥ 等 。Ｃ ＭＫ ｏ２ ａ
件 下早 期后 除极 和 尖 端扭 转 型心 动 过 速 的 发 生率 ，
研究 证 明 Ｊ钙 调 蛋 白（ ａ 是 ｃ 信 号 变化 的重 ， Ｃ Ｍ） ａ
要感 受 器 ， 是 Ｃ ｎ调 节蛋 白及 转 录 反应 的重 要效 也 ａ
应器 。钙 调素 依赖 性蛋 白激 酶 Ⅱ（ ａ Ｃ ＭＫⅡ） 调节 能 基 因的转 录表 达 ， 信 号传 导 和调 节 心 脏 功 能 中 的 在 作用 与其 异 构 体 的 亚 细胞 定 位 有 关 。Ｃ ＭＫⅡ的 活 ａ 性 和表 达程 度 在 心 律 失 常 、 肌 肥 厚 、 肌 细 胞 凋 心 心 亡 的发生 中起 着非 常重 要 的作用 。
时， 心律 失 常 的 发 生 率 也 明 显 升 高 。蔡 少 艾 等 、 Ｃ ｂ ｎ ｔ 实验 结果 显示 ， 丙 肾上 腺 素磷 酸化 Ｒ Ｒ ｕ ａ ｌ ０ ３ 异 ｙ２ 所 致 的心律 失常 可 能与 Ｃ ＭＫⅡ系统有 关 。 ａ
生物小综述钙离子第二信使-
Ca2+在信号传导中对植物生理的影响一、摘要本文简要分析Ca2+在信号传导中作为第二信使配合钙调蛋白和钙依赖型蛋白激酶的机制原理，并概述其对植物生长生理的影响。
二、关键词：Ca2+钙调素 CDPK 第二信使三、引言我们知道，矿质元素对植物的生长发育和生理过程起着重要作用，Ca2+就是其中最为重要的离子之一。
Ca2+既是植物细胞壁的重要组成部分，大部分Ca2+在细胞壁中与果胶酸形成果胶酸钙，起支持和加固作用；Ca2+对维持膜结构的稳定性也有一定作用；同时，Ca2+作为第二信使配合钙调蛋白和CDPK在植物生理的信号传导过程中具有重要作用。
四、正文1、钙稳态在静息态的胞质中Ca2+浓度≤0.1μmol/L，而通常在细胞壁、ER、液泡、线粒体中的浓度会高2~5个数量级。
细胞壁是植物细胞的最大钙库[1]。
细胞中各处的钙离子浓度梯度在未受刺激时是保持相对稳定的，当受到刺激时，由于胞外Ca2+浓度高与胞内，此平衡就会被打破。
信号分子与受体结合通常引起跨膜的离子流动，从而引起膜电位的改变。
在质膜上，存在Ca2+通道，类似于水通道，引起Ca2+的内流；同时存在Ca2+泵，是Ca2+外流的通道。
在胞内钙库如液泡、ER等结构的膜上也存在相应的结构，其上的Ca2+通道是从钙库流向胞质的通道，Ca2+泵、Ca2+/nH+反向运输体是Ca2+从胞质流向钙库的通道。
因此细胞质中的游离Ca2+的浓度主要受质膜和内膜系统上的Ca2+通道和Ca2+泵的调节。
任何一种外界刺激或激素所引起的细胞反应通过Ca2+作为第二信使传递的直接证据是细胞质中是否有游离Ca2+的浓度变化。
2、Ca2+的作用方式有两种：第一种是游离Ca2+的浓度直接或间接影响植物的生理过程；第二种是胞质里的Ca2+与钙结合蛋白，如钙调蛋白CaM（也叫钙调素）、钙依赖型蛋白激酶（CDPK）结合而起作用。
3、钙调素3.1 钙调素( Calmodulin, CaM)是一种分布最广，功能最重要的钙依赖性调节蛋白。
咬合干扰大鼠咬肌线粒体钙超载的离子变化特征及其钙调蛋白激酶Ⅱ的调节机制
咬合干扰大鼠咬肌线粒体钙超载的离子变化特征及其钙调蛋白激酶Ⅱ的调节机制曾林;刘静【摘要】目的探明咬合干扰作用下大鼠咬肌组织线粒体钙离子浓度与细胞外钠离子浓度的变化特点,探讨钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMK Ⅱ)对线粒体“钙超载”现象的调控机制.方法在SD大鼠右侧上颌第一磨牙咬合面粘接直径0.6 mm钢丝段,建立咬合干扰大鼠模型,实验组分为3、7、14、21d及去除咬合干扰后3d组,并设立对照组.应用苏木精-伊红(HE)染色法观察咬肌组织形态学的变化;应用荧光分光光度法检测咬肌线粒体钙离子浓度;应用6-氢氧化锑钾直接比浊法检测咬肌肌纤维细胞外钠离子浓度;应用Western blotting技术检测咬肌组织p-CaMK Ⅱ(Thr286)/CaMK Ⅱ表达水平.结果与对照组比较,建模3、7、14和21 d实验组咬合干扰侧咬肌线粒体Ca2+浓度持续升高(P＜0.05),去除咬合干扰后3d组Ca2+浓度显著下降且低于正常对照组(P＜0.05).建模3d组、7d组、14d组及21 d组细胞外Na+浓度持续升高(P＜0.05),去除咬合干扰后3d组Na+浓度显著降低(P＜0.05).建模3d、7d 和14 d实验组咬合干扰侧p-CaMK Ⅱ(Thr286)/CaMK Ⅱ表达水平持续升高(P＜0.05),但其表达水平在建模21d组下降且低于对照组水平(P＜0.05),去除干扰3d 组表达水平显著下降且低于21 d组(P＜0.05).非咬合干扰侧变化趋势同干扰侧趋势一致,但干扰侧变化更显著(P＜0.05).结论咬合干扰可使大鼠咬肌线粒体Ca2+和胞浆Na+浓度升高,引发“钙超载”;线粒体Ca2+浓度升高与CaMK Ⅱ磷酸化水平相关,提示其对线粒体“钙超载”具有负反馈调节作用.【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2018(038)006【总页数】6页(P755-760)【关键词】线粒体钙超载;咬合干扰;咬肌;钙调蛋白激酶2;咀嚼肌功能紊乱【作者】曾林;刘静【作者单位】暨南大学口腔医学院;暨南大学华侨医院口腔科,广东广州510630;暨南大学口腔医学院修复学教研室,广东广州510632【正文语种】中文钙离子是细胞凋亡信号中关键的第二信使，而线粒体凋亡途径是细胞凋亡发生的核心［1］。
从内质网应激研究高脂饮食对小鼠睾丸生精细胞凋亡的影响
网络出版时间：２０２３－１２－０１１６：０３：１９ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｕｒｌｉｄ／３４．１０８６．Ｒ．２０２３１１３０．１３２３．０４８◇生殖药理◇从内质网应激研究高脂饮食对小鼠睾丸生精细胞凋亡的影响周本文１，２，３，张长城１，３，邓 何１，２，陈思敏１，３，常言语１，３，杨焱娜１，２，付国庆１，３，袁 丁１，赵海霞１，２（三峡大学１．国家中医药管理局中药药理科研三级实验室、２．基础医学院、３．健康医学院，湖北宜昌 ４４３００２）收稿日期：２０２３－０６－０５，修回日期：２０２３－０９－１６基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ８２０７４２０５，８２２７４１９１）作者简介：周本文（１９９６－），女，硕士生，研究方向：高脂饮食对雄性生殖功能的影响及药物防治机制，Ｅ ｍａｉｌ：１７５４１９８８４７＠ｑｑ．ｃｏｍ；赵海霞（１９８６－），女，博士，副教授，研究方向：生殖功能障碍的病理生理机制及药物防治机制，鄂产中草药的药理活性及作用机制，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｚｈａｏｈａｉｘｉａ．ｍｍ＠１６３．ｃｏｍ；张长城（１９７３－），男，博士，教授，研究方向：机体衰老的生理病理机制与药物防治机制，生殖与不育的病理机制与药物防治机制，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｇｒｅａｔｗａｌｌ＠ｃｔｇｕ．ｅｄｕ．ｃｎｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２３０４０３２文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）１２－２３４６－０８中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ３２１ １；Ｒ３２２ ６４；Ｒ３２９ ２４；Ｒ３２９ ２５；Ｒ５８９ ２摘要：目的 从内质网应激的角度研究高脂饮食对小鼠睾丸生精细胞凋亡的影响。
方法 将Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性小鼠随机分为正常组和高脂饮食组，每组６只，分别给予普通饲料和高脂饲料持续喂养５个月。
小鼠称体质量，麻醉后处死，取睾丸组织，称质量并计算睾丸指数；取附睾组织进行精液分析；ＨＥ染色检测睾丸组织形态学变化；ＴＵＮＥＬ染色检测生精细胞凋亡；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测睾丸凋亡及内质网应激相关蛋白的表达水平；免疫荧光法检测ＧＲＰ７８蛋白表达和定位的变化。
钙调蛋白依赖性激酶在神经元发育中的调控机制
钙调蛋白依赖性激酶在神经元发育中的调控机制作为一种重要的信号传导分子，钙调蛋白依赖性激酶不仅在细胞的生长、分化和死亡等基础生理过程中起着至关重要的作用，而且在神经元发育过程中的调控机制也备受研究学者关注。
在一系列的实验研究中，科学家们发现，钙调蛋白依赖性激酶参与了神经元的健康发育以及神经退行性疾病的发生，并为疾病的预防与治疗提供了新的思路与途径。
神经元发育过程中的激酶如今，越来越多的研究表明，神经元的发育需要严格的时间表达和空间调控，它们之间的配合令神经元的形态变化、分化过程、突触形成和功能的成熟同步进行。
常见的突触激酶主要包含了钙调蛋白依赖性激酶（CAMK）、蛋白激酶C（PKC）和蛋白激酶A（PKA）等。
在这其中，CAMK是一种与神经元发育密切相关的激酶，它的活性通过钙-/钙调蛋白及其信号通路的调节而被严格限制。
在神经元的发育过程中，CAMK的活性调控可以促进神经元的成长、分化、突触的塑造和功能的成熟。
CAMK在神经元中的分布和调控CAMK的基因在哺乳动物中表达广泛，其亚型亦不止一种。
在神经元中，CAMK主要通过多种表达方式进行调控，如CAMKⅡ的自磷酸化和机械感受器的活性改变等。
此外，神经元中的CAMK活性可以由信号通路中的其他因素调控。
事实上，很多神经递质综合神经元内部的激酶、酶和钙通道等，以促进本身的释放和作用。
CAMK在神经元发育中的作用机制不同类型的CAMK参与到神经元发育过程中的方式也是不同的。
首先，CAMK的活性可以促进神经元的成长（Nikolic等）。
在神经元的过度发育阶段，较高水平的CAMK活性可以促进神经元的生长并帮助形成健康稳定的神经系统。
其次，CAMK对突触的塑造和功能的成熟也具有重要的作用（Wu等）。
神经系统突触的塑造是神经元发育的关键部分，突触的塑造与突触磷酸酶和突触前神经细胞因子合成相关，大多数研究表明CAMK在突触的塑造和成熟方面发挥了极其重要的作用。
同时它还可以促进突触的形成和运转，并对突触的可塑性和动态进行调节。
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钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ和胞外信号调节激酶对高脂血症大鼠
勃起功能障碍影响的实验研究
【摘要】目的探讨钙调素依赖性蛋白激酶ⅱ（cam-pkⅱ）和胞外信号调节激酶（erk1/2）对高脂血症大鼠勃起功能障碍（ed）影响的作用机制。
方法选取30只spf级雄性sd大鼠，体重200±20g，采用随机数字表法分成高脂血症组（15只）和对照组（15只）。
高质血症脂组给予自制高脂饲料喂养，对照组给予普通饲料。
饲养30天时检测各组大鼠血清血脂情况，高脂血症组明显高于对照组（>2倍），造模成功；45天时对各组大鼠行阿朴吗啡诱导阴茎勃起情况。
60天时，应用电生理测压仪（biopac-mp150）测各组大鼠阴茎海绵体内压及勃起情况，然后处死大鼠取标本分别采用elisa方法和激光共聚焦显微镜检测大鼠阴茎海绵内camkⅱ及erk的含量。
结果 45天诱导阴茎勃起次数高脂血症组与对照组相比，差异无统计学意义（p>0.05）；60天时，应用电生理测压仪（biopac-mp150）测各组大鼠阴茎海绵体内压及勃起情况，高脂血症组与对照组差异有明显统计学意义（p<0.05）；elisa方法检查结果：高脂组camkⅱ、erk1/2含量与对照组比较有统计学意义（p<0.05）；激光共聚焦检查结果：高脂血症组海绵体组织内的camkⅱ、erk1/2明显比对照组的表达增多。
结论高脂血症状态下阴茎海绵体中camkⅱ与erk1/2的表达呈正相关；且camkⅱ和erk1/2的表达增加是导致ed的重要机制之一，将为临床治疗勃起功能障碍提供一种新思路和新方法。
【关键词】高脂血症大鼠；勃起功能障碍；camkⅱ；erk1/2
目前，全球约有1亿多ed患者，45-75岁的男性中，约有58%的男性存在不同程度的勃起功能障碍。
ed是影响男性健康的常见疾病。
随着国内、外对勃起功能障碍（ed）的研究的进一步深入，发现众多代谢性疾病直接影响阴茎勃起功能，糖尿病、高脂血症、代谢紊乱、周围神经病变等等，其中以高脂血症最为著。
目前已证明高脂血症与勃起功能障碍的发生密切相关。
因此本课题对高脂血症时camkⅱ和erk1/2含量变化进行研究，从而揭示高脂血症性勃起功能障碍的发病机制。
1 材料与方法
1.1 购自大连医科大学动物实验中心spf级雄性sd大鼠60只，3月龄，体重280±30g，按随机数字法分成2组：高脂血症组和对照组各15只。
1.2 主要试剂及仪器大鼠camkⅱ及erk1/2 elisa试剂盒（上海蓝基生物科技公司）。
自制高脂饲料，基础饲料。
酶标仪：美国宝特800，数显恒温水浴锅：（产地：金坛市医疗仪器厂），离心机：上海安亭科学仪器厂（anke tgl-16g），加样枪：epp。
阿扑吗啡。
激光共聚焦显微镜（olympus，日本），电生理测压仪（biopac-mp150）等等。
1.3 动物模型制备高脂血症组大鼠每天给予高脂饲料（配方：3%胆固醇、18%猪油、0.6%胆酸钠、14%蛋黄粉、54.4%基础饲料）喂养；对照组每天给予标准复合饲料喂养。
饲养30天时，大鼠行内眦采血法进行血清血脂检查，检测均用大型全自动生化分析仪测
定。
高脂血症组血清血脂水平均是对照组大鼠的2倍以上，确认模型成立。
1.4 勃起功能检测饲养45天时，各组大鼠行阴茎勃起情况检查，于大鼠颈部皮下注射阿扑吗啡（apo）100ug/kg进行实验，每只大鼠注射后观察30分钟，记录阴茎勃起次数，勃起标准为阴茎充血及末段阴茎体露出为勃起一次。
饲养60天时，采用电生理测压仪（biopac-mp150）检测阴茎海绵体内压及勃起情况，每只大鼠观察约10-15分钟使其反应基线稳定，记录每次阴茎海绵体内压，进行统计学分析。
1.5 实验取材待60天完成电生理后过量麻药处死大鼠，取阴茎海绵体组织，然后将各组标本标记：一部分行4.0%甲醛固定，另一部分置于-80℃冰箱冷冻，以供后续试验备用。
1.6 用elisa方法大鼠阴茎海绵内camkⅱ及erk1/2的含量大鼠阴茎海绵内camkⅱ及erk的含量：包被、加样、加酶标抗体、加底物液显色、终止反应、结果判定：测od值：在elisa检测仪上，于450nm（若以abts显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔od值，若大于规定的阴性对照od值的
2.1倍，即为阳性。
1.7 激光共聚焦显微镜检测大鼠阴茎海绵内camkⅱ及erk1/2的含量取材组织标本，用丙酮固定，切片机切片，脱蜡染色后甘油与混合液封片，阴凉处晾干，上机检测。
1.8 统计学分析所得资料数据使用spss for windows 11.5统计软件包进行统计，以平均数±标准差表示，两两比较用t检验，
显著性水准为0.05。
2 结果
2.1 于30天时测定两组大鼠血清血脂结果见表1，两组数据差异有统计学意义（p<0.05）。
3 讨论
ed被认为是男人健康的风向标，高脂血症是导致勃起功能障碍的危险因素之一。
早期认为高脂血症是引起动脉管腔狭窄而导致ed
的发生，随着研究进展，阴茎海绵体内皮细胞的功能障碍在ed的发生机制中占主导的地位，尤其是参与勃起的信号通路：ca2+/camk ⅱ及raf/mek/erk1/2是两个重要的信号通路。
ca2+主要通过与钙调节蛋白（cam）结合发挥生理作用，camkⅱ是钙调素依赖蛋白激酶（如：磷酸化酶激酶、mlc激酶、eef-2激酶）的家族一员，作用底物专一。
但钙调素激酶ⅱ底物较多，camk ii参与细胞骨架形成、细胞凋亡、细胞迁移、兴奋-收缩偶联的调节等。
目前认为与勃起功能障碍有关的生理功能主要体现在camkii对内皮型一氧化氮合酶（enos）的影响，研究证实，camk ii可激活ras-raf-erk1/2通路间接或直接的使磷酸化的erk1/2含量在内皮细胞中表达增多。
sommer f等[6]提出勃起功能障碍患者的阴茎海绵平滑肌中磷酸化erk1/2的表达水平显著高于正常同龄男性。
磷酸化的erk1/2可以抑制enos的活性，从而降低阴茎海绵体平滑肌的舒张，而影响勃起功能。
karaboga r等[7]的研究发现长期的高胆固醇血症状态下，平滑肌肌动蛋白水平下降，且此过程不可逆转。
国内的实验证明高
脂血症大鼠阴茎海绵体内vegf含量减少，nos下降[8]。