关于猪卵母细胞孤雌激活技术概述
猪细胞核移植中卵母细胞激活方法的研究进展
～
５ ， 裂 率 为 ２ ％ ） ５ 或 ５ ｍＭ 的 钙 离 子 载 体 ｈ 卵 ６ ； ０
Ａ２ １ ７ ５ ｉ 卵 裂 率 分 别 为 ５ ． ％ 或 ３ ． ％ ， 胚 ３ ８ （ ｒ ｎ， ａ ８１ ０６ 囊 形 成 率 分 别 为 ２ ２ 或 １ ７ ） ．ｍＭ 的 ＳＣ， ．％ ． ％ ；１６ ｒｉ （０ ｎ， 活 率 为 ３ ５ ） ５ ｍＭ 的 离 子 霉 素 （ ｍｉ． ６ ｍｉ 激 ４．％ ； ０ ５ ｎ 卵裂 率 为 ３ ． ％ ， 胚 形 成 率 为 ２３ ）０ １ ３３ 囊 ． ％ ； ．ｍＭ 的 Ｃ Ｃ ２ 直 接 注 射 ， 核 形 成 率 为 ７ ． ％ ， 葚 胚 和 囊 胚 ａ ｉ（ 原 ９４ 桑 形 成 率 为 １ ． ％ ， 分 发 生 孵 化 ） ７ ５或 １ ｍｇ Ｌ 的 ４７ 部 ；． ０ ／ 细 胞 松 弛 素 Ｂ ＣＢ． ～５ ） ： １ １］ （ ３ ｈ 等 ・ ５６ ．
次 电 脉 冲 获 得 了 ７ ％ 的 激 活 率 ， ｒ ｃａ ｋ ５ Ｐ ｏ ｈ ｚａ等 （ ９ ２ １９ ） 用 １次 脉 冲 甚 至 获 得 了 高 达 １ ０ 的 激 活 率 。 Ｎ — ０％ ａ ｇｓ ｉ ａｈｍａ等 （ ９ ２ 发 现 ２次 电 脉 冲 的 卵 母 细 胞 裂 解 率 １９ ） 高 于 １次 的 。 说 明 猪 卵 母 细 胞 激 活 时 ， 用 合 适 的 场 采 强 １次 电 脉 冲 就 足 以 激 活 卵 母 细 胞 ， 加 脉 冲 次 数 并 增
重 要 的 意 义 。 现 就 近 年 来 发 表 的 文 献 对 这 一 方 面 作 一 综述 。
猪孤雌激活胚胎和卵母细胞体外成熟过程中的甲基化检测
2019年32卷3期 Vol. 32 No. 3西"表$%&Southwest China Journal of Agricultural Sciences679文章编号：1001 -4829(2019)3-0679-05D O I：10. 16213/j. c n k i. s c ja s.2019. 3.035猪孤雌激活胚胎和卵母细胞体外成熟过程中的甲基化检测宋尚桥\曾素先2,马围围\王睿敏!，严瑾\孙翠翠!，李鑫!，黎宗强“(1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁530004$2.南宁市江南区沙井街道办事处水产畜牧兽医站，广西南宁530045)摘要：【目的】探索猪孤雌激活胚胎培养过程和猪卵母细胞体外成熟前后的V N A甲基化水平及其变化，为探讨猪孤雌激活胚胎和卵母细胞的发育提供理论依据。
【方法】通过使用间接免疫荧光组化和激光共聚焦显徽镜的荧光相对定量的两种方法来间接检测猪孤雌激活胚胎培养过程中和猪卵母细胞成熟前后的细胞5-甲基胞嘧啶的相对含量，观察其体外发育过程中甲基化水平的变化。
【结果】随着体外培养时间的延长，猪孤雌激活胚胎的甲基化程度在二到桑葚胚时呈逐渐减弱趋势&在猪孤雌激活胚胎发育的过程中，同一个胚胎的不同卵裂球之间的甲基化水平有差异&内细胞团的甲基化水平低于滋养层。
猪卵母细胞成熟前和体外成熟的基因组D N A甲基化水平相比，成熟前卵母细胞基因组D N A甲基化水平低于体外成熟后的卵母细胞基因组D N A甲基化水平；随着体外成熟时间的延长，猪卵母细胞的基因组V N A甲基化水平大致呈上升趋势。
【结论】I V M/PA/I V C对猪卵母细胞及早期胚胎的甲基化模式有一定影响&猪卵母细胞体外培养过程中，猪卵母细胞核基因组的甲基化水平接近于正常体内的卵母细胞。
关键词！孤雌激活&猪卵母细胞&间接免疫荧光组化法;5-甲基胞嘧啶;D N A甲基化中图分类号:S828 文献标识码!APreliminary Study on Methylation Detection in in VitroMaturation of Pij» Parthenogenetic Embryos and OocytesSONGShang-qiao1%ZEN8Su-xian2%M A Sei-w ei1%SA N G R ui-m in1%Y A N Jin1，SUNCui-C ui!(1. College of Animal S cience and Technology，Guangxi University，Guangxi Nanning 530004，China ；2. Shajing Subdistrict Office，Jiangnan District，Nanning City Aquatic Animal Husbandry and Veterinary Station，Guangxi Nanning 530045，China)A b stract:'Objective】To provide a theoretical basis for the development of parthenogenetic activated embryos amethylation level and its changes before and after in vitro maturation of pig oocytes were explored. 'Method]Ind tochemistry and relative fluorescence quantification of laser confocal microscopy were used to indirectly detect the relative content of 5-methyl-cytosine in the cells of porcine parthenogenetic embryo culture and before and after porcine oocyte maturation，and observe its in vitro development and changes of the level of methylation in the process. 'Result]S ith the prolongation of in vitro culture tim e，the degree of methylation of parthenogenetic embryos in pigs was gradually reducing fromthe second to the morula;During the developm ment in pigs，the level of methylation between different blastomeres of the same embryo was different;the level of methylation of the innercell mass was lower than that of the trophoblast;Compared with the genomic DNAmethylation le ration，the genomic DNAmethylation level of pre-mature oocytes was lower than the genomic DNAmethyla maturation;S ith the prolongation of tim e，the genomic DNAmethylation level of porcine oocytes increased ro IV Chad a certain effect on the methylation pattern of porcine oocytes and early embryos;During the in v methylation level of porcine oocyte nuclear genome was close to that of normal oocytes.Key w o rd s:Parthenogenetic activation $Porcine oocyte;Indirect immunofluorescence histochemistry;5-methylcytosine;DNAmethylation【研究意义】D N A甲基化是调节核重编程的众收稿日期:2018 -11-15基金项目：广西科技计划项目（桂科AB16380072)作者简介:宋尚桥（1995 -"，男，安徽滁州人，在读硕士研究生，研究方向为动物繁殖生物学，E-m ail:1157677030@q q•cm，！为通讯作者:黎宗强，副教授，从事动物繁殖生物学特性研究，> m ail:lizq20 @ 163 •com。
猪卵母细胞体外成熟与孤雌激活的研究
猪卵母细胞体外成熟与孤雌激活的研究猪卵母细胞体外成熟与孤雌激活的研究研究了生长激素、胰岛素对猪卵母细胞体外成熟的影响,比较了电激活、乙醇激活、A23187激活3种激活方法对成熟卵母细胞孤雌激活的影响.试验结果表明:在mNCSU-23基础液中添加Insulin对卵母细胞体外成熟呈现双重效应.在mNCSU-23基础液中添加5 μg/mL Insulin 和8 μg/mL Insulin组的卵母细胞成熟率(66.25±1.34)%、(60.64±1.64)%显著高于对照组及0.5、2、10 μg/mL组;添加5 μg/mL Insulin组的卵裂率(61.63±2.92)%显著高于对照组及0.5、2、8、10 μg/mL组(P<0.05); 0.15 μg/mL STH与2 μg/mL Insulin联合添加组成熟率最高(79.37±2.10)%,同其它组相比,差异显著(P<0.05),在此试验中为猪卵母细胞体外成熟的最佳条件.电激活比乙醇激活、A23187激活有更高的卵裂率(67.75±1.03)%和桑椹胚率(13.52±2.05)%,且差异显著(P＜0.05),最佳激活参数为130 V/mm、80 μs、一次脉冲激活.作者：王星罗光彬姜午旗宁方勇刘永肖焕星 WANG Xing LUO Guang-bin JIANG Wu-qi NING Fang-yong LIU Yong XIAO Huan-xing 作者单位：王星,WANG Xing(辽东学院,农学院,辽宁,丹东118003;东北农业大学,动物科学技术学院,哈尔滨150030) 罗光彬,姜午旗,刘永,肖焕星,LUO Guang-bin,JIANG Wu-qi,LIU Yong,XIAO Huan-xing(沈阳农业大学,动物胚胎实验室,沈阳110161) 宁方勇,NING Fang-yong(东北农业大学,动物科学技术学院,哈尔滨150030)刊名：辽东学院学报（自然科学版）英文刊名：JOURNAL OF LIAODONG UNIVERSITY(NATURAL SCIENCES) 年，卷(期)：2009 16(1) 分类号：S828.3 关键词：卵母细胞体外成熟孤雌激活猪。
2008猪早期孤雌激活胚不同发育阶段差异基因2
有研究发现卵母细胞经过激活后所形成的孤雌胚 的发育能力比较差， 其卵裂率和囊胚发育率均低于正
４ ～ ７ ］ 常发育的胚胎 ［ ， 因此， 提高胚胎发育率是现阶段孤 ７～ ９ ］ 雌激活胚胎研究的主要方向之一 ［ ， 而目前有关孤雌
胚发育分子机制的报道还比较少。 为了解猪早期胚 胎 发 育 相 关 基 因 表 达 的 分 子 机 制， 本研究运用单个植入前胚胎的 ｍ Ｒ Ｎ Ａ差异显示技
２ ０ ０ ８ ， ２ ８ （ ８ ）
胡 婕 等： 猪早期孤雌激活胚不同发育阶段差异基因表达的研究
６ ３
０ ． １ ％的透明质酸酶中， 反复吹打去除颗粒细胞， 用冲 卵液清洗 ２～ ３次， 统计排除第一极体的卵母细胞数 ） 。 量， 计算卵母细胞的成熟率（ 图１
８ ］ １ ． １ ． ３ 孤雌胚胎的获得 ［ 将成熟的卵母细胞放入
中图分类号 Ｑ ７ ８ ６ 在哺乳动物发育生物学研究中， 卵母细胞的孤雌 激活是一种重要的研究方式。一方面， 孤雌活化卵只 含有母源的遗传信息， 便于研究雌性基因组在个体发 育过程中的作用， 有助于了解早期胚胎发育的相关基 因和机理； 另一方面， 进行显微受精和细胞核移植研究 时， 卵母细胞所移入的核物质的复制及其一系列相关 的发育启动过程完全依赖于卵母细胞的激活， 因此， 研 究卵母细胞的激活及孤雌胚胎的发育过程有助于完善 细胞核移植以及显微受精技术； 再者可以利用孤雌生 殖产生的特殊单倍体或者纯合的双倍体建立专门的孤
６ ４
中国生物工程杂志 Ｃ ｈ ｉ ｎ ａＢ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ
Ｖ ｏ ｌ ． ２ ８Ｎ ｏ ． ８２ ０ ０ ８
（ １ ０ ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ） ， ０ ． ５ ｌ Ｏ ｌ ｉ ｇ ｏ（ ｄ Ｔ ） ，加双蒸水至 ２ ｌ ， 室 μ μ １ ５ 温放置 ２ ｍ ｉ ｎ 接着 １ ００ ０ ０× ｇ ４ ℃离心 ２ ｍ ｉ ｎ后将其置于 ． ５ ｌ Ｍ Ｍ Ｌ Ｖ， ３ ７ ℃孵育 １ ５ ｍ ｉ ｎ后 ６ ５ ℃ 冰上。加 入 ０ μ 灭活 酶 活 性。将 反 应 混 合 物 １ ００ ０ ０ ｇ４ ℃离心 １ ０ ｍ ｉ ｎ ２ ｍ ｉ ｎ 后 置 于 冰 上。 再 加 入 ４ ．５ ｌＴ ｅ ｒ ｍ ｉ ｎ ａ ｌ μ 反应混合物（ １× Ｔ ｄ Ｔｂ ｕ ｆ ｆ ｅ ｒ ， Ｄ ｅ ｏ ｘ ｙ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｏ ｔ ｉ ｄ ｙ ｌ Ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｅ ｒ ｏ ｓ ｅ １ ． ５ ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌｄ Ａ Ｔ Ｐ ）和 １ ｌＴ ｅ ｒ ｍ ｉ ｎ ａ ｌＤ ｅ ｏ ｘ ｙ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｏ ｔ ｉ ｄ ｙ ｌ μ 。反应物 ３ ７ ℃ 孵育 １ ５ ｍ ｉ ｎ ， ６ ５ ℃１ ０ ｍ ｉ ｎ灭活 Ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｅ ｒ ｏ ｓ ｅ 酶活性， １ ００ ０ ０ ｇ ４ ℃ 离心 ２ ｍ ｉ ｎ 。加入 ４ ０ ｌ 冷的新鲜配 μ
猪孤雌激活胚胎体外培养影响因素的研究的开题报告
猪孤雌激活胚胎体外培养影响因素的研究的开题报告猪孤雌激活胚胎体外培养是一种重要的生殖技术，其可以增加猪的繁殖效率，提高生产力和经济效益。
然而，该技术的应用仍受到许多因素的限制，包括孤雌激活剂的选择、培养条件的优化和体外培养过程中对胚胎的影响等。
因此，本文旨在探究猪孤雌激活胚胎体外培养的影响因素。
首先，孤雌激活剂的选择是影响猪孤雌激活胚胎体外培养的重要因素之一。
研究发现，不同的孤雌激活剂对猪胚胎的激活效果和发育能力有明显差异。
目前，常用的孤雌激活剂包括钙离子离子载体（Ca2+ ionophore）、孤体活化因子（iA）和电脉冲（EP）等。
因此，本文将探究不同孤雌激活剂对猪胚胎体外培养的影响，并寻找最适合的孤雌激活剂。
其次，培养条件也是影响猪孤雌激活胚胎体外培养的重要因素之一。
研究显示，温度、pH值、氧气浓度、培养基成分和培养时间等因素都对猪胚胎的发育能力和生存率产生影响。
因此，本文将探究最适宜的温度、pH值、氧气浓度、培养时间和培养基成分，以提高猪孤雌激活胚胎体外培养的成功率和胚胎品质。
最后，猪孤雌激活胚胎体外培养过程中对胚胎的影响也是本文的研究重点。
研究发现，体外培养会对胚胎的发育产生负面影响，如自发性发育中止、过早细胞分化和细胞凋亡等。
因此，本文将探究如何减少体外培养对胚胎的负面影响，并寻找最佳的体外培养条件，以提高猪胚胎的发育能力和生存率。
综上所述，本文将以猪为研究对象，从孤雌激活剂的选择、培养条件的优化和体外培养过程中对胚胎的影响等方面探究猪孤雌激活胚胎体外培养的影响因素，旨在提高猪的生殖效率和经济效益。
猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活的研究
猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活的研究猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活的研究引言：随着现代生物科技的不断发展，人们对于动物胚胎发育过程的探索也愈发深入。
猪作为一种重要的农业畜牧业动物，其生殖发育研究对于提高繁殖效率和品种改良具有重要意义。
猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活的研究被认为是改善猪生殖效率的关键技术之一，本文将就该研究进行探讨。
一、猪卵母细胞体外成熟的研究进展1.1 体外培养条件的优化猪卵母细胞的体外成熟需要适宜的培养基和环境条件的支持。
过去的研究中发现，添加荷尔蒙和营养因子可以促进卵母细胞的发育，但也有一些不良因素对其生成产生负面影响。
如今，研究人员通过改良培养基成分和添加植物激素等手段，成功地提高了卵母细胞的发育率和质量。
1.2 卵母细胞成熟标志物的鉴定卵母细胞的成熟状态可以通过某些标志物的表达情况进行鉴定。
近年来，研究人员发现，猪卵母细胞的成熟可以通过检测卵母细胞表面的特定蛋白、细胞器的形态及功能等进行判定。
这些标志物的鉴定为猪卵母细胞体外成熟的监测提供了依据。
1.3 卵母细胞体外成熟能力的提高提高猪卵母细胞的体外成熟能力对于提高繁殖效率具有重要意义。
研究人员通过调整培养条件、添加辅助因子等手段已取得了一定的突破。
例如，改善培养基中气相和营养物质的供应，可以促进细胞发育和成熟率的提高。
此外，添加某些荷尔蒙如促黄体生成素、卵泡刺激素等也能够提高卵母细胞的体外成熟能力。
二、孤雌激活的研究现状2.1 孤雌激活的意义孤雌激活是指在缺乏精子参与的情况下，卵母细胞可以自主地发育和分裂，从而获得新生命。
这种现象在动物界被广泛研究并被认为是生殖发展领域的一个热点。
对孤雌激活机制的深入研究不仅可以理解胚胎发育的基本过程，还有助于解决某些生殖障碍的问题。
2.2 孤雌激活的机制目前，孤雌激活的机制尚不完全清楚，但有一些重要的研究和理论已经提出。
研究发现，内质网钙离子释放和细胞质内信号通路的活化是孤雌激活的重要因素。
亚胺环己酮对猪卵母细胞人工孤雌激活作用的研究
7期
李光鹏等： 亚胺环己酮对猪卵母细胞人工孤雌激活作用的研究
D * ;
／ ） 平衡’! ， 然后移至间距为*! 进行电脉冲刺激 （美国 + ! " # $% & % # ( ) ! 的电极间， , - 公司生 ’ 产的 . 。电刺激之后， 静置 * ， 将卵母细胞吸至基础培养液洗涤 % / ’ 0 0 *型电融合仪） ! ’! ( ) 数次并在其中继续培养’ 。对照组除不经电刺激外， 其他处理同试验组。 01 激活： 随机吸取卵母细胞进行下述处理： （ ） 在0 、 、 ／ * 2 ’ 2 3 4 5 % # * * 2 6 7 2 0和* 0 2 0! ! " # $ 的4 5 8 ’ ［ ］ ; 激活液 （用无钙 / 李光鹏等， ） 中作用 6 ， 洗涤后转入基础培养液培养 % # * 6配制， * 9 9 : 0! ( ) ’ （ ； ） 先经* ／ 激活液分别作用 0 、 、 、 、 ， 再转入含或不含 * ’ 01 ’ 2 6! ! " # $4 5 % # 0 2 7 * 2 0 ’ 2 0 3 2 01 0 ’ ／ 的 中培养 。 # % = - , % / 8 * 9 9 ’ 01 <! " （ ） 固定液中固定 ; 再经 ! " # 激活鉴定 培养结束后进行压片并在乙醇冰醋酸 3 > * ’1 以上， ， 在相差显微镜下观察激活情况。判断卵母细胞激活的标准 * ?的醋酸地衣红染色* ! ’! ( ) 是形成一个原核 （ 、 两个原核 （ 或出现两个极体 （ ） 。 * @ A） ’ @ A） ’ @ B ! " $ 数据分析 利用C 检验及方差分析对数据做统计学分析。 8
亚胺环己酮对猪卵母细胞人工 孤雌激活作用的研究
用乙醇激活与电激活研究猪卵母细胞孤雌激活
用乙醇激活与电激活研究猪卵母细胞孤雌激活作者：肖红卫，郑新民，刘西梅，等来源：《湖北农业科学》 2012年第24期肖红卫，郑新民，刘西梅，乔宪凤，李莉，张立苹，华文君，毕延震，华再东（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所／动物胚胎工程与分子育种湖北省重点实验室，武汉４３００６４）摘要：以猪的体外成熟卵母细胞为实验材料，研究了乙醇激活、电激活对猪成熟卵母细胞体外孤雌发育的影响。
结果表明，２个１．６ｋＶ／ｃｍ的６０μｓ的电激活法卵裂率高（８８．６８％，９４／１０６）；使用８％乙醇处理１０ｍｉｎ的卵裂率为８４．２１％（６４／７６）。
２个１．６ｋＶ／ｃｍ的６０μｓ的电激活法可以获得更高的卵裂率，为下一步研究奠定基础。
关键词：猪；卵母细胞；孤雌激活；乙醇激活；电激活中图分类号：Ｓ８１４．４文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）24－5724-03ＰａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｎＰｏｒｃｉｎｅＯｏｃｙｔｅｓｂｙＥｔｈａｎｏｌＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎａｎｄＥｌｅｃｔｒｉｃａｌＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎＸＩＡＯＨｏｎｇ－ｗｅｉ，ＺＨＥＮＧＸｉｎ－ｍｉｎ，ＬＩＵＸｉ－ｍｅｉ，ＱＩＡＯＸｉａｎ－ｆｅｎｇ，ＬＩＬｉ，ＺＨＡＮＧＬｉ－ｐｉｎｇ，ＨＵＡＷｅｎ－ｊｕｎ，ＢＩＹａｎ－ｚｈｅｎ，ＨＵＡＺａｉ－ｄｏｎｇ（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｃｉｅｎｃｅ / ＨｕｂｅｉＫｅｙＬａｂｏｆＡｎｉｍａｌＥｍｂｒｙｏａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｒｅｅｄｉｎｇ，ＨｕｂｅｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，Ｗｕｈａｎ４３００６４，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｍａｔｕｒｅｄｐｏｒｃｉｎｅｏｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅａｃｔｉｖａｔｅｄｂｙｅｔｈａｎｏｌｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎａｎｄｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄ that the cleavage of electrical stimulation with two １．６ｋＶ／ｃｍ and ６０μｓ was higher （８８．６８％，９４／１０６）， and the cleavage rate of ethanol stimulation with 8% and １０ｍｉｎ was ８４．２１％（６４／７６）. The method of electrical stimulation with two １．６ｋＶ／ｃｍａｎｄ６０μｓ had higher cleavage rate， and laid the foundation for further study.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｏｒｃｉｎｅ；ｏｏｃｙｔｅｓ；ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃａｃｔｉｖａｔｉｏｎ；ｅｔｈａｎｏｌｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ；ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ精子进入ＭⅡ期卵母细胞并激活卵母细胞的发育是一个复杂的生物过程，孤雌生殖和体细胞核移植都不能够完全重现这一过程。
猪体外成熟卵母细胞孤雌激活的研究
猪体外成熟卵母细胞孤雌激活的研究作者：贾佩，肖红卫，刘西梅，郑新民，许生成，张立苹来源：《湖北农业科学》2014年第23期摘要：试验比较了几种不同化学激活方法[试验Ⅰ：不同浓度乙醇溶液作用不同时间+2 mmol/L 6-二甲基氨基嘌呤溶液（6-DMAP）作用4 h对猪体外成熟卵母细胞进行激活处理;试验Ⅱ：不同浓度离子霉素作用不同时间+2 mmol/L 6-DMAP作用4 h对猪体外成熟卵母细胞进行激活处理]对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活效率的影响。
结果表明，10%的乙醇溶液作用10 min+2 mmol/L 6-DMAP作用4 h及10 μmol/L的离子霉素作用10 min+2 mmol/L 6-DMAP作用4 h可获得较高的囊胚率，其囊胚率分别为16.09%、13.24%。
关键词：猪;卵母细胞;孤雌激活中图分类号：S828.3 ; ; ; ;文献标识码：A ; ; ; ;文章编号：0439-8114（2014）23-5802-03DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2014.23.045卵母细胞的人工激活是核移植供体细胞核基因组重新编程，启动核移植胚正常发育的重要环节[1]，同时也是提高胞质内单精注射效果的重要措施[2]。
卵母细胞的激活方法有很多种，一般可分为物理激活法（电脉冲、机械刺激、温度变化等）和化学激活法（钙离子载体A23187、离子霉素、氯化锶、乙醇、放线菌酮、蛋白合成抑制剂等）。
孤雌激活方法对激活效率的影响较大，离子霉素和乙醇是常用的人工激活剂，用于哺乳动物体外成熟卵母细胞的孤雌激活。
本研究着重探讨了离子霉素和乙醇结合蛋白激酶抑制剂6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）对体外成熟卵母细胞孤雌激活的影响，以期获得在本实验室条件下较优的化学孤雌激活方法，为胚胎培养体系的建立和体细胞核移植技术的研究提供必要的方法和手段。
1 ;材料与方法1.1 ;成熟培养液基础液配制及各种试剂来源成熟培养液的基础液成分如下：TCM-199（Gibco）添加3.05 mmol/L葡萄糖、0.91 mmol/L丙酮酸钠、0.57 mmol/L L-半胱氨酸、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL的硫酸链霉素、10%（V/V）卵泡液、10 IU/mL孕马血清促性腺激素（PMSG）和10 IU/mL人绒毛膜促性腺激素（hCG）;DPBS购自Gibco公司。
猪卵母细胞不同孤雌激活方法的研究
猪卵母细胞不同孤雌激活方法的研究摘要:通过对不同电激活参数的摸索,电激活和化学激活联合的研究,以确定适合于猪卵母细胞孤雌激活的最佳方案｡结果表明,体外成熟猪卵母细胞在电场时程60 μs,1次直流脉冲的条件下,电场强度1.6 kV/cm时其卵裂率(88.68%)和桑葚胚率(81.13%)较其他各组高｡在电场强度为1.6 kV/cm,1次直流脉冲的条件下,脉冲时程20 μs时,卵母细胞卵裂率仅为75.38%,桑葚胚率为64.62%;40和80 μs时,卵裂率分别是84.62%和77.17%;100 μs时,卵母细胞的卵裂率和桑葚胚率都明显下降｡在电场强度为1.6 kV/cm,电场时程为60 μs的条件下,2次电脉冲激活卵母细胞的卵裂率(87.50%)､桑葚胚率(81.25%)和1次电脉冲的卵裂率(88.68%)､桑葚胚率(80.13%)之间无显著性差异(P﹥0.05),但两者均显著高于3次电脉冲的卵裂率(72.50%)和桑葚胚率(70.27%)｡成熟卵母细胞经电刺激(ES)后,分别用CB(7.5 μg/mL)､CHX(10 μg/mL)､6-DMAP(2 mmol/L)､CB(7.5 μg/mL)+CHX(10μg/mL)､CB(7.5 μg/mL)+6-DMAP(2 mmol/L)各自处理 4 h,ES+CB+CHX和ES+CB+6-DMAP组卵裂率显著高于其他3组,但其桑葚胚率差异不显著｡结果显示,电场强度为1.6 kV/cm,电场时程60 μs,1次脉冲的电刺激对体外成熟的猪卵母细胞(IVM)孤雌激活效果最好;1次或2次电脉冲就足以激活猪卵母细胞,过高脉冲对细胞反而有伤害作用;电激活和化学激活联合应用可提高猪卵母细胞的卵裂率｡关键词:卵母细胞;体外培养;孤雌激活;猪Different Parthenogenetic Activation Method for Porcine OocytesAbstract: In the present study, the parameters of electrical activation and the combined treatments of electrical activation and chemical activation on parthenogenetic activation for in vitro matured porcine oocytes were investigated to find the best program. The results showed that the rates of cleavage and morula of the oocytes using one DC-pulse of 1.6 kV/cm for 60 μs (88.68% and 81.13%) were significantly higher than that in the other treatment groups. The comparison study of different electrical activation parametes indicated that the rates of cleavage in one, double and three DC-pulse of 1.6 kV/cm for 60 μs were 88.68%, 87.50% and 72.50%, respectively. And the rates of morula were 80.13%, 81.25%, 65.00% respectively. The rates of cleavage and morula of the oocytes using one DC-pulse of 1.6kV/cm for 20 μs were 75.38%, 64.62% respectively, while for 40 and 80 μs, the rates of cleavage were 84.62% and 77.17% respectively. For 100 μs, the rates of cleavage and morula decreased remarkably. It showed that double DC-pulse treatment groups were no significant higher than those of one DC-pulse treatment groups(P>0.05), but both were significant higher than three DC-pulse treatment groups, the morula rate of them were also significant higher than the three DC-pulse treatment groups. After electrical activation the oocytes were treated with CB(7.5 μg/mL), CHX(10 μg/mL), 6-DMAP(2 mmol/L), CB(7.5 μg/mL)+CHX(10 μg/mL) and CB(7.5μg/mL)+6-DMAP(2 mmol/L) 4 hours respectively. The results showed that the effect of electrical activation with one DC-pulse of 1.6 kV/cm for 60μs was the best. One or double activation was enough to activate the porcine oocytes. Too much electrical activation might hurt the oocytes. The combined application of electrical activation and chemical activation could improve the rate of cleavage of oocytes.Key words: oocytes; in vitro culture; activation; pigs在大多哺乳动物中,排出的卵母细胞都停留在MⅡ期直至被精子受精激活或人工诱导激活才完成第二次成熟分裂｡精子进入MⅡ期,卵母细胞启动继续发育的过程称为卵母细胞激活｡它包括一系列级联发生形态和生理变化等激活事件｡尽管细胞核移植技术的开展在牛､羊､小鼠､猪等动物上获得成功,但总效率仍很低,而猪的体细胞核移植效率更低,出生活仔数与移植胚的比率仅为1%左右[1-3]｡很多因素影响核移植胚的发育,其中一重要因素是受体卵母细胞的激活率低,这可能是导致猪体细胞克隆胚的囊胚发育率很低的主要原因之一｡猪卵母细胞的激活方法很多,常用的有直流电脉冲､钙离子载体､6-二甲氨基嘌呤､乙基汞硫代水杨酸钠､细胞松弛素B､放线菌酮等｡这些物质相互配合使用,激活效率更高｡有关电脉冲､钙离子载体与其他因素相互结合用于激活猪卵子的研究报道较多[4-6],但不同实验室在组合使用上各有不同,使用剂量､浓度和方式上差别也很大｡本试验的目的是通过对不同电激活参数的摸索,电激活和化学激活联合激活的研究,确定适合于猪卵母细胞孤雌激活的最佳方案,为将来进行转基因克隆重构胚的激活积累经验｡1材料与方法1.1材料口吸管(自制),5孔细胞培养板(Biogenics bioQad);DPBS购自Gibco公司;孕马血清促性腺激素(PMSG)､人绒毛膜促性腺激素(HCG)为宁波激素制品厂生产,其他试剂如未特别注明,均购自Sigma公司(St. Louse,MO,USA)｡试验中需要的溶液配制方法如下:1)改良组织培养液-199(mTCM-199)｡添加0.055 0 g 葡萄糖,0.010 0 g 丙酮酸钠,0.006 9 gp3)猪卵母细胞体外成熟液｡mTCM-199+10 IU/mLPMSG+10 IU/mL HCG+10% pFF,培养卵母细胞前培养基至少要在CO2箱内平衡4 h｡4)胚胎培养液｡胚胎培养液为北卡罗林纳州大学23培养液(NCSU-23)添加4 mg/mL牛血清白蛋白(BSA)｡5)脱卵丘液｡取30 mL杜氏磷酸缓冲液(DPBS),取100 mg/mL透明质酸酶,缓慢搅拌,使之溶解并用DPBS定容至50 mL,然后以0.22 μm 针头滤器在超净工作台内过滤,分装到1.5 mL离心管内于4 ℃保存备用｡6)细胞松弛素B(CB)｡加2.5 mL二甲基亚砜(DMSO)溶解5 mg的CB,分装到1.5 mL离心管,没管0.1 mL,工作浓度为5~7.5 μg/mL,-20 ℃冻存｡7)放线菌酮(CHX)｡CHX原装浓度100 mg/mL;取100 μL,用DMSO稀释到1 mL,则浓度为10 mg/mL,-20 ℃冻存｡如果工作浓度为10 μg/mL,则每毫升溶液中加储存液1 μL｡8)6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)｡100×的储存液:用3.06 mL DMSO溶解100 mg的6-DMAP,分装于1.5 mL离心管中,-20 ℃冻存｡使用时每毫升胚胎培养液中加10 μL｡1.2方法1)猪卵母细胞的孤雌激活与体外培养｡体外培养42~44 h的猪卵母细胞,用0.1%透明质酸酶脱去卵丘颗粒细胞,用激活液洗涤3遍｡再将其转移到铺满激活液､电极宽度为1 mm的融合槽(BTX ECM2001电融合仪配套电激活槽)中｡2)试验设计｡试验一:体外成熟猪卵母细胞在电场时程为60 μs,1次直流脉冲(DC)的条件下,分别用1.2 ､1.4 ､1.6､1.8和2.0 kV/cm的电场强度激活｡试验二:在当电场强度为1.6 kV/cm,1DC的条件下,分4组分别采用20､40､80､100 μs的电场时程激活成熟的猪卵母细胞｡试验三:在电场强度为1.6 kV/cm,电场时程为60 μs的条件下,分2组分别采用2DC和3DC激活猪卵母细胞｡试验四:采用电刺激(1.6 kV/cm,60 μs,1DC)猪体外成熟卵母细胞后,分别用CB(7.5 μg/mL)､CHX(10 μg/mL)､6-DMAP(2 mmol/L)､CB(7.5 μg/mL)+CHX(10 μg/mL)､CB(7.5 μg/mL)+6-DMAP(2 mmol/L)各自处理 4 h｡激活处理之后用NCSU-23+4 mg/mL BSA的胚胎培养液洗涤卵母细胞3~5遍,洗涤后将卵母细胞转移到NCSU-23+4 mg/mL BSA液滴内,39 ℃､5%CO2､100%湿度的培养箱中48 h 观察细胞发育的卵裂情况｡1.3数据分析试验数据采用卡方(χ2)检验｡2结果与分析2.1不同电场强度对猪卵母细胞孤雌激活的影响由表1可见,在电场时程60 μs,1DC的条件下,场强在一定范围内增大,卵母细胞的卵裂率逐渐提高,但各组之间差异不显著｡电场强度为1.6 kV/cm时猪卵母细胞的卵裂率(88.68%)和桑葚胚率(81.13%)较其他各组高;当场强继续增大时,其卵裂率和桑葚胚率均下降｡表明过高的脉冲强度不仅不会促进其激活效果,反而对细胞有损伤作用｡2.2不同电场时程对猪卵母细胞孤雌激活的影响由表2可见,在当电场强度为1.6 kV/cm,1DC的条件下,脉冲时程20 μs时,猪卵母细胞卵裂率仅为75.38%,桑葚胚率为64.62%;当脉冲时程达到40和80 μs时,其卵裂率分别是84.62%和77.17%;当达到100 μs时,猪卵母细胞的卵裂率和桑葚胚率都明显下降,分别为65.06%和60.00%｡由此可见,脉冲时程过长会影响猪卵母细胞的发育能力｡2.3不同电脉冲次数对猪卵母细胞孤雌激活的影响在电场强度为1.6 kV/cm,电场时程为60 μs的条件下,由表3可见,2DC激活猪卵母细胞的卵裂率(87.50%)､桑葚胚率(81.25%)和1DC的卵裂率(88.68%)､桑葚胚率(81.13%)之间无显著差异(P>0.05),但两者均显著高于3DC的卵裂率(72.50%)和桑葚胚率(70.27%)｡2.4ES+CB､ES+CHX､ES+6-DMAP､ES+CB+CHX､ES+CB+6-DMAP处理对猪卵母细胞激活的影响由表4可见,猪成熟卵母细胞经电刺激(Electrical stimulation,ES)后,分别用CB(7.5 μg/mL)､CHX(10 μg/mL)､6-DMAP(2 mmol/L)､CB(7.5 μg/mL)+CHX(10 μg/mL)､CB(7.5 μg/mL)+6-DMAP(2 mmol/L)各自处理4 h｡结果表明,ES+CB+CHX 和ES+CB+6-DMAP组卵裂率显著高于其他3组,但其桑葚胚率没有显著差异,以ES+CB+CHX组效果略好于其他组｡3讨论体外成熟猪卵母细胞在电场时程60 μs,1DC的条件下,电场强度为1.6kV/cm 时,卵母细胞的卵裂率为88.68%,桑葚胚率为81.13%,较其他各组高,当场强继续增大时,其卵裂率和桑葚胚率均下降｡表明在一定场强范围内,随着场强的增加,激活猪卵母细胞的分裂率也相应增加,但电场强度过高则会导致卵母细胞受到损伤,死亡率也相应增多,此结果与谭景和等[7]和陈乃清等[8]的研究结果一致｡对各组进行比较,在电场强度为1.6 kV/cm,60 μs,1DC的电刺激可以对体外成熟的猪卵母细胞取得较好的激活效果｡在当电场强度为1.6 kV/cm,1DC的条件下,脉冲时程20 μs时,猪卵母细胞卵裂率仅为75.38%,桑葚胚率为64.62%;当脉冲时程达到40和80 μs时,其卵裂率分别为84.62%和77.17%;当达到100 μs时,猪卵母细胞的卵裂率和桑葚胚率都明显下降,分别为65.06%和60.00%｡由此可见,脉冲时程过长,会影响猪卵母细胞的发育能力｡在电场强度为1.6 kV/cm,电场时程为60 μs的条件下,2DC激活猪卵母细胞的卵裂率(87.50%)､桑葚胚率(81.25%)和1DC的卵裂率(88.68%)､桑葚胚率(81.13%)之间无显著差异(P﹥0.05),但两者均显著高于3DC的卵裂率(72.50%)和桑葚胚率(70.27%)｡表明1次或2次电脉冲就足以激活猪卵母细胞,过高脉冲对细胞反而有伤害作用｡Lyon等[9]报道,一次脉冲只能引起卵子中Ca2+浓度一次升高,多次脉冲可诱导卵子中Ca2+浓度多次升高｡本研究在电场强度为1.6 kV/cm,电场时程为60 μs的情况下,2DC激活猪卵母细胞的卵裂率､桑葚胚率和1DC的卵裂率､桑葚胚率无显著差异(P>0.05),但两者均显著高于3DC的卵裂率(72.50%)和桑葚胚率(70.27%)｡在电脉冲作用下,卵母细胞的细胞膜会形成很多可恢复的微孔,使细胞外介质中的Ca2+进入细胞,使胞内Ca2+浓度升高,从而激活卵母细胞｡多次电刺激可诱导卵母细胞中Ca2+浓度多次升高[10]｡但对猪卵母细胞激活而言,越来越多的研究表明,随着脉冲次数增多,卵母细胞激活率并不显著升高,并且随着脉冲次数增加,卵母细胞裂解率也增加[2]｡本试验中使用1次脉冲和2次脉冲均取得了较好效果｡猪成熟卵母细胞经电激活(1.6 kV/cm,60 μs,1DC)后,分别用CB(7.5 μg/mL)､CHX(10 μg/mL)､6-DMAP(2 mmol/L)､CB(7.5 μg/mL)+CHX(10 μg/mL)､CB(7.5 μg/mL)+6-DMAP(2 mmol/L)各自处理4 h｡ES+CB+CHX和ES+CB+6-DMAP组卵裂率显著高于其他3组,但其桑葚胚率没有显著差异,以ES+CB+CHX组效果最好｡在孤雌激活研究中,一般采用单纯电刺激激活的卵母细胞孤雌胚大多为单倍体,影响其发育[11]｡因此,为了提高孤雌激活胚胎的发育率,常常将电刺激与化学激活联合起来进行激活[12]｡Wakayama等[13]研究发现电激活后再用化学激活能显著提高克隆胚的发育｡试验结果表明,电激活和化学激活联合激活卵母细胞的激活率高于单纯电刺激激活的激活率｡究其原因可能激活率会随着电场强度的升高而升高,但是其卵裂解率也呈上升趋势｡在适当的电激活后,再用离子霉素处理有可能弥补细胞内Ca2+浓度不够和用高的电场强度造成的损害,使其激活率高于单纯电激活的激活率｡参考文献:[1] BETTHAUSER J, FORSBERG E, AUGENSTEIN M, et al. 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关于猪卵母细胞孤雌激活技术概述摘要：孤雌激活随着近年来体细胞克隆技术的兴起而成为了又一研究热点，而猪由于其生理结构与人的相似性，所以其卵母细胞的孤雌激活更具有特别的研究价值，文章就孤雌激活的概念、机理、方法、影响因素等方面全面论述了猪卵母细胞孤雌激活的研究概况。
关键词：猪；卵母细胞；孤雌激活孤雌生殖(parthenogenesis)作为一种生殖方式在无脊椎动物和低等脊椎动物中较为常见，在鱼类、两栖类、爬行类和鸟类等脊椎动物中也存在孤雌生殖的现象，但哺乳动物在自然状态下则未见有孤雌生殖现象。
孤雌生殖的关键是提高卵母细胞的激活率，通过人工模拟自然条件下卵母细胞的自然激活机理(卵母细胞的自发激活和精子穿入引起卵母细的激活)创造更多更好的激活方法，从而进一步提高卵母细胞的孤雌激活率，一直是孤雌生殖研究的重点内容，具有重要的研究价值。
一方面可把卵子活化的各个过程(如皮质反应、减数分裂的恢复和发育到第l次卵裂过程)分开来研究，对于阐明哺乳动物卵激活过程的信号偶联过程、细胞周期阻滞的恢复、受精机制和发育机理具有重要意义。
另一方面，卵母细胞激活是细胞核移植和胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)的关键环节，卵母细胞的激活率的高低直接关系到ICSl技术的效率，目前，卵母细胞激活率很低是核移植和胞质内单精子注射成功率低的重要原因之一。
同时，由于猪的生理结构与人的诸多相似，被医学界认为是人类器官移植的最佳提供者，且猪的数量充足，妊娠周期短，产仔多，容易饲养，取材容易，充分满足临床需要，未来在生物医学方面有潜在的重要应用前景，这使猪的孤雌激活技术成为近年来的研究热点，这对于畜牧业和生物医学具有重大理论和实践意义。
1. 卵母细胞孤雌激活的概念孤雌生殖是指无雄性配子的任何作用，由雌性配子产生个体的繁殖[1]。
孤雌生殖的关键是提高卵母细胞的激活率，而卵子在自然条件下的激活是由精子穿入刺激引起的，即由于精子的进入启动M Ⅱ期卵母细胞继续发育，这一过程称为卵母细胞的激活。
卵母细胞的激活分为3种，即为自发激活(常见于行孤雌生殖的动物和老化卵母细胞)、精子激活(自然条件下有性生殖动物的精卵结合)和人工激活。
通过人工模拟自然条件下卵母细胞的激活机理，在体外也可以通过各种理化刺激使处于MⅡ期的卵母细胞激活，即为卵母细胞的人工孤雌激活。
2. 卵母细胞孤雌激活的机理自然条件下，受精引起卵母细胞激活后的主要事件包括细胞质内游离Ca2+浓度的升高、皮质颗粒胞吐和阻止多精受精、减数分裂的恢复和第二极体(PB2)释放、雌性染色体转化为雌原核、精子去致密转化为雄原核、雌雄原核内DNA 复制、雌雄原核在卵子中央部位相互靠近、核膜破裂及染色质混合等。
钙离子振荡和钙波是激活过程的初始信号，随后引起包括皮质颗粒(CG)释放、细胞内pH 改变、母源mRNA的补充等一系列激活反应，最终导致原核形成、DNA合成起始和卵裂。
卵母细胞MⅡ期的维持与高水平的成熟促进因子(MPF)活性有关[2]。
MPF的活性是由对Ca2+非常敏感的细胞静止因子(CSF)来维持的，CSF的作用是抑制停滞于MⅡ期卵母细胞内的CyclinB的降解。
卵母细胞受精或人工激活后，细胞内Ca2+浓度迅速增加，使CSF的活性消失，cyclinB被降解，从而引起MPF 的活性降低或消失，细胞离开M期，完成减数分裂并进行卵裂。
不论是受精激活或人工激活MⅡ期卵母细胞都会发生的Ca2+顺时性升高，也就是说Ca2+的震荡引发的Ca2+是卵母细胞激活的特征性事件，由此通过相关信号转导路径并最终引发相关蛋白质的磷酸化和去磷酸化反应，从而启动发育。
3. 常见卵母细胞孤雌激活的方法卵母细胞孤雌激活方法可归纳为物理刺激、化学刺激和物化联合处理3类。
物理刺激包括机械刺激、温度刺激以及电刺激处理等；化学刺激包括酶刺激、离子载体处理、麻醉剂处理以及蛋白磷酸化抑制剂处理等；物化联合处理有电刺激联合A23187(Ca2+载体)；乙醇(EH)联合放线菌酮(CHX)、离子霉素(Ion)联合6-DMAP(6-二甲氨基嘌呤)等。
目前，电刺激是应用最广泛的卵母细胞激活方法，此外乙醇、钙离子载体、6-DMAP、CHX(放线菌酮)等也用于卵母细胞激活。
对于猪卵母细胞的激活而言，有使用化学试剂激活卵母细胞的报道，但大多学者仍倾向于使用电激活，并认为电激活足以使猪卵母细胞充分激活。
但是采用单纯电刺激激活的卵母细胞孤雌胚大多为单倍体，影响其发育。
因此，为了提高孤雌激活胚胎的发育率，常常将电刺激与化学激活联合起来，使得孤雌激活胚胎为二倍体。
3.1 物理激活物理激活方法中，机械刺激和温度刺激，因其操作繁琐，稳定性和重复性差，且孤雌激活率偏低，较少被人们采用。
相对而言，电刺激激活方法因简便易行、稳定性、重复性较好，且集激活和融合为一体，而被广泛应用。
其原理是卵母细胞在短暂高压直流电脉冲的作用下，膜的磷酸二酯双分子结构的稳定性发生改变，细胞膜上形成很多可恢复的微小孔洞．使细胞内外（介质)中Ca2+进入细胞，并使胞质内Ca2+浓度升高，从而引起卵母细胞的激活。
电脉冲引起的微孔大小受电脉冲强度、脉冲宽度、电脉冲次数、电激液类型等条件的影响。
Vitullo等[3]提出，控制电脉冲参数，模拟出正常受精过程中Ca2+浓度节律性脉冲升高，可复制出正常受精过程中的一系列变化。
据张德福等[4]报道，在猪卵母细胞激活过程中，进行一次电脉冲，其激活率和激活后孤雌胚发育效果均高于施以多次电脉冲刺激。
Sin等[5]则发现通过培养液调节Ca2+浓度水平比通过改变电脉冲强度和持续时间更有效。
吴中红等[6]通过用电激活得出其最佳场强和脉冲时程为130V/mm，作用80us的情况下，其囊胚发育率为(20．12±8.18)％，而且发现多次脉冲并不比单次脉冲的激活效果好。
李光鹏等[7]以体外成熟的猪卵母细胞为材料，以乙醇、电脉冲和氯化锶为人工刺激条件，研究了蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX)对猪卵母细胞的孤雌激活效果的影响。
结果表明，乙醇、电脉冲和SrCl2，均可使猪母细胞激活，而电脉冲的激活效果最好。
当分别与CHX联合使用时，激活率显著高于单独的乙醇、电脉冲或SrCl2刺激。
说明，CHX与乙醇、电脉冲及SrCl2，联合使用对猪IVM卵母细胞激活具有显著的协同促进作用。
3.2 化学激活乙醇是发现较早的一种化学激活剂，其机理在于乙醇可以改变卵母细胞膜的稳定性，使钙库的Ca2+释放出来，同时增加细胞外Ca2+的渗入，从而胞质内Ca2+浓度升高引起卵子活化。
乙醇对卵母细胞的激活主要是引起细胞膜IP3的形成，通过IP3受体介导Ca2+释放。
目前经过大量的实验己经证实：乙醇激活卵母细胞一般采用了7％～8％的培养液作用5～7 min可取得较好的激活效果，长时间处理会降低激活率[8-9]。
大量研究表明，单纯的乙醇刺激激活率较低，只有联合其他激活方法后，激活率才会有所提高。
离子霉素(Ionmycin,Ion)近年来发现的一种高效Ca2+载体，已被广泛地应用于哺乳动物卵母细胞的激活中。
Ion与钙离子载体A23187不同的是，Ion并不直接引起Ca2+的跨膜转运，而是动员细胞内的Ca2+，依次触发Ca2+内流，引起细胞内Ca2+升高，从而造成卵母细胞的激活，与乙醇相比，由于它仅动用钙库内的Ca2+，所以引起的Ca2+波动较为平缓，因而效率更高。
Sr2+与Ca2+属于同族的二价阳离子，是目前已知唯一能引起胞内Ca2+多重升高的二价阳离子，Sr2+能诱发胞质内一系列Ca2+浓度的升高，并且能使激活的卵子达到原核阶段。
Sr2+对卵母细胞的激活作用可能是通过细胞膜上的Ca2+通道进入细胞内，并进入钙库(内质网和线粒体)，置换出内源Ca2+释放入胞质中，使胞内游离的Ca2+浓度增加，进而介导了依赖Ca2+多重升高的皮质反应[0-11]。
另外，蛋白质合成抑制剂CHX(放线菌酮)和蛋白质磷酸化抑制剂6-DMAP(6一二甲氨基嘌呤)也用于卵母细胞的孤雌激活，CHX主要抑制卵母细胞维持在MⅡ期所需要的MPF和CSF的合成，进而使卵母细胞内MPF活性迅速下降，卵母细胞脱离M Il期，完成第2次减数分裂导致卵母细胞激活。
CHX可使小鼠和牛卵母细胞发生激活，但单独使用CHX不能使猪IVM卵母细胞活化，说明猪卵母细胞对CHX 不敏感，只有与其他刺激因素联合使用时才能起协同促进作用。
由于在卵母细胞成熟和受精过程中涉及到多种蛋白质的磷酸化和去磷酸化，所以，作为一种重要的蛋白质磷酸化抑制剂6-DMAP常用于卵母细胞的激活中，它通过抑制β34蛋白第l61位酪氨酸的磷酸化和cyclinB的磷酸化使MPF活性下降。
细胞分裂由M II 中期向末期II发展。
同时6-DMAP还抑制纺锤体形成时微管蛋白的磷酸化进而抑制了极体的排出，但对DNA的合成没有抑制作用[12-13]。
此外，细胞松弛素B(CB)、透明质酸酶、乙基汞硫代水杨酸钠(thimerosal，THI)和二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)等其他激活剂对卵母细胞也有一定的激活作用，但效率较低，须与其他激活剂联合使用才能提高激活率和发育率。
3.3 理化联合激活单一的激活剂或激活方式产生的激活率和发育率往往比较低，因此，目前不少学者普遍采用复合激活法来激活卵母细胞，但有关复合激活卵母细胞的效果比较的研究还比较少，不过还是取得了一定的进展，现已知道联合激活比单一激活的激活率和孤雌胚发育率都要高。
李光鹏等报道，单独使用乙醇、电脉冲和氯化锶激活猪卵母细胞，其激活率分别为11.9％，61.3％，41.9％，而将它们与放线菌酮(CHX)联合使用，则其激活率分别升高到27.8％，81.1％，74.5％。
吴中红等[14]报道，离子霉素和乙基汞硫代水杨酸钠激活体外成熟的猪卵母细胞，其卵裂率和囊胚发育率分别为58.43％，l2.26％和61.60％，5.12％，而离子霉素与6-DMAP 联合使用以及乙基汞硫代水杨酸钠与二硫苏糖醇(DTT)联合使用，则其卵裂率和囊胚发育率分别为68.81％，21.28％和86.67％，l9％。
不同组合方式其激活效果也不同。
在孤雌激活研究中，一般采用单纯电刺激激活的卵母细胞孤雌胚大多为单倍体，影响其发育，因此，为了提高孤雌激活胚胎的发育率，常常将电刺激与化学激活联合起来进行激活。
由此可见，几种激活方法的联合使用，特别是能够诱发胞内钙波的激活方法与蛋白质磷酸化抑制剂联合使用，不但可以提高卵母细胞的激活率，而且还能促进原核的形成和孤雌胚胎的发育率。
4. 影响卵母细胞孤雌激活效率的因素哺乳动物卵母细胞孤雌激活受多个方面因素的影响，最主要的是受激活方法和激活剂的控制，不同的激活方法和激活剂的选择，对卵母细胞的孤雌激活率、卵裂率级囊赔率均有较大程度的影响。