卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟影响的

燕山大学课程设计说明书卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟影响的设计学院（系）：年级专业：0学号：学生姓名：指导教师：教师职称：燕山大学课程设计（论文）任务书说明：学生、指导教师、基层教学单位各一份。

年月日2010-2011 秋季学期生物工程专业课程设计结题论文卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟影响的设计学院（系）：年级专业：学号：学生姓名：指导教师：教师职称：摘要卵丘细胞是影响卵母细胞成熟的重要因素，尤其是包裹在卵母细胞周围的卵丘细胞。

本设计主要探讨卵丘细胞对牛卵母细胞体外成熟的影响。

设计内容主要分为两部分：卵丘细胞存在对猪卵母细胞体外成熟影响的设计；卵丘细胞层数对猪卵母细胞体外成熟影响的设计。

第一部分设计拟定探索出卵丘细胞的存在能够提高卵母细胞体外培养成熟；第二部分设计是在第一部分的基础上分析卵丘细胞层数对母细胞成熟的影响。

通过本次设计，拟定探讨卵丘细胞的存在和不同形态对猪卵母细胞的成熟率的影响。

为提高卵母细胞的质量，使体外受精、细胞核移植、转基因及胚胎干细胞等技术研究的顺利进行，而作为这些研究基础环节的卵母细胞体外成熟技术尤为重要。

关键词：卵丘细胞；猪卵母细胞；体外成熟目录第一部分文献综述 (1)1.哺乳动物卵母细胞体外成熟研究进展 (1)1.1卵母细胞体内成熟的生理机理 (1)1.2卵母细胞体外成熟的机理 (1)2. 影响猪卵母细胞体外成熟的因素 (2)2.1影响猪卵母细胞体外成熟的生理性因素 (2)2.1.1 卵巢来源猪的年龄、品种及健康状况 (2)2.1.2所采集卵巢所处的性周期 (2)2.1.3采集卵巢离体时间及保存温度 (3)2.1.4采集卵母细胞的方法 (3)2.2影响猪卵母细胞体外成熟的物理性因素 (3)2.2.1 体外成熟培养条件 (4)2.2.2体外成熟培养时间 (4)2.2.3体外成熟培养方式 (4)2.3影响猪卵母细胞体外成熟的化学性因素 (4)2.3.1成熟培养基 (4)2.3.2激素 (5)2.3.3血清 (5)2.3.4卵泡液 (6)2.3.5细胞生长因子 (6)3.卵丘细胞与卵母细胞关系的研究进展 (7)3.1卵丘细胞与卵母细胞在卵母细胞成熟过程中的结构与功能联系 (7)3.2卵丘扩展对卵母细胞体外成熟的影响 (8)3.3卵丘细胞层数对卵母细胞体外成熟的影响 (9)3.4去除卵丘细胞的卵母细胞在体外成熟过程中的超微结构变化 (10)第二部分课程设计部分 (11)1.实验材料 (11)1.1 卵巢 (11)1.2 实验用的仪器 (11)1.3 实验试剂 (12)2.方法 (12)2.1 卵丘-卵母细胞复合体（COCs）的收集 (12)2.2猪卵母细胞的分级 (12)2.3卵母细胞的成熟培养 (13)2.4各组卵母细胞的成熟观察 (13)3. 设计 (13)3.1卵丘细胞存在对卵母细胞体外成熟的影响 (13)3.2卵丘细胞层数对卵母细胞体外成熟的影响 (13)4.分析与总结 (14)4.1卵丘细胞存在对卵母细胞体外成熟的影响 (14)4.2卵丘细胞层数对卵母细胞体外成熟的影响 (14)5.设计体会 (15)参考文献 (16)第一部分文献综述1.哺乳动物卵母细胞体外成熟研究进展1.1卵母细胞体内成熟的生理机理卵母细胞成熟是指卵母细胞恢复和完成第一次减数分裂，进入并停滞于第二次减数分裂中期，此间伴随着胞浆成熟，即卵母细胞的成熟包括其核成熟和胞浆成熟两个方面[v]。

核成熟是核膜破裂，同源染色体分离和排出第一极体；胞浆成熟是胞浆内各种蛋白组成达到一定水平及线粒体的有效重排。

1.2卵母细胞体外成熟的机理卵母细胞体外成熟（IVM）是指在体外人工给定的条件下，哺乳动物次级卵母细胞经过一系列的生长发育最终形成有受精能力的成熟卵母细胞的过程。

卵母细胞的体外成熟包括细胞核的成熟、细胞质的成熟、卵丘细胞的成熟、透明带的成熟以及其卵丘-卵母细胞复合体的发育成熟等一系列复杂的变化过程，主要表现在细胞核成熟和细胞质成熟两个方面。

在形态学方面表现为纺锤体形成，核仁致密化，染色质高度浓缩成染色体，第一极体释放，细胞器重组，卵丘细胞扩展、膨胀和透明带软化等一系列生理变化[vii]。

细胞核成熟即卵母细胞恢复减数分裂，发生生发泡破裂(genninal vesiclebreakdown，GVBD)并发育到第一次减数分裂中期；与此同时，卵母细胞进一步跨越第一次减数分裂中期，排出第一极体(第一极体含有极微量的细胞质，不久就退化)并停止于第二次减数分裂的中期，直到受精(或激活)后才完成第二次减数分裂并排出第二极体。

细胞质的成熟包括细胞器的变化和细胞基质的变化，皮质颗粒在胞质合成后，逐渐迁移到质膜下的皮质区。

高尔基复合体最初位于核的周围，成熟过程中移向皮质，皮质颗粒完全形成后，高尔复合体在皮质中消失。

发育早期的线粒体为圆形或椭圆形等，主要分布于皮质部，卵母细胞成熟后，线粒体又移向核周围，形成幼稚型线粒体。

随着卵母细胞的成熟，粗面内质网减少，而滑面内质网增多，到成熟晚期，滑面内质网变得很少。

胞质成熟一个非常重要的特点是积累一些稳定的mRNA，并在卵母细胞成熟到一定阶段进行蛋白质翻译。

有些细胞质成熟过程依赖于细胞核成熟。

透明带软化也是卵母细胞成熟的标志。

透明带是一层糖蛋白膜，受精时可以结合并诱导精子发生顶体反应，并阻止多精受精。

在卵母细胞的成熟过程中，有很多化学物质及因子参与反应，因此，只有当体外成熟条件与体内卵母细胞发育所需要的环境非常接近时，才能获得较高的成熟率，从而为进一步的科研工作提供优质大量成熟的卵母细胞。

2. 影响猪卵母细胞体外成熟的因素2.1影响猪卵母细胞体外成熟的生理性因素2.1.1 卵巢来源猪的年龄、品种及健康状况同一种动物在不同年龄段其卵母细胞在体外成熟的情况也有所不同。

从初情期前的青年母猪卵巢中获得的猪卵母细胞经过体外成熟培养后可得到IVP 后代，但是，成功的效率不如经产母猪卵巢体外成熟的卵母细胞。

不同的国家和地区之间，猪的品种必定存在着遗传因素、饲养环境和气候条件等等的因素而带来品质上的差异，从而影响猪卵母细胞的质量进而对体外成熟培养也产生一定的影响。

而即使是从同一品种和统一地区的猪种所获得的卵母细胞进行体外培养，其培养效果也会因猪的健康情况和卵巢质量等的影响而有很大的不同，比如，处在育龄盛期的健康母猪，其卵巢的体积大，表面卵泡多而且直径在3-6mm 的卵泡相对比例就会较高，抽得的卵母细胞形态完好，裸卵少，相对体外成熟培养效果也好。

反之，取自仔猪、处女猪、老母猪及老弱病残猪的卵母细胞的体外成熟培养效果则较差。

2.1.2所采集卵巢所处的性周期所采集的卵巢所处的性周期同样影响卵母细胞体外成熟培养结果，根据采集卵巢所处的性周期，将其分为卵泡期和黄体期，再将黄体期卵巢分为有黄体期卵巢和无黄体期卵巢。

无黄体期卵巢上的卵母细胞比黄体期卵巢上卵母细胞成熟效果要好。

崔亚利等认为猪卵泡期卵母细胞的培养效果要高于黄体期，但差异不显著。

彭辉等研究表明，在牛卵母细胞的体外成熟培养中，有着同样的结果，即卵泡期卵母细胞的体外成熟培养结果要高于黄体期[xxvi]。

因此，卵巢所处性周期不同，卵泡内的能量物质、激素浓度等也会随之而发生变化，进而影响了体外成熟培养的结果。

2.1.3采集卵巢离体时间及保存温度一般而言，卵巢离体的时间要求在2~4h 内，时间越短，所获得的卵母细胞的质量越好，体外成熟培养的效果也越好。

文国艺等[xxvii]研究认为，猪卵巢离体时间越短，其卵母细胞的卵裂率越高，并且随着离体时间的延长而降低。

相对于其他哺乳动物而言，猪卵母细胞对温度的敏感度较高，较高或较低都会直接影响到体外成熟的效果，一般来讲，猪卵巢的保存温度在28~35℃，文国艺等研究表明，当卵巢的保存温度低于25℃，猪卵母细胞体外成熟收到明显的影响并进而影响到受精的结果。

2.1.4卵泡的大小及卵丘细胞目前，普遍认为进行体外培养的猪卵母细胞在3~8mm，培养效果较好。

Yoon等研究发现来自3~8mm直径卵泡的卵母细胞成熟率显著高于小于3mm的卵泡卵母细胞(91%vs 58%)。

韩毅冰等也证明小直径卵泡卵母细胞(<1~2 mm)成熟率不如大直径卵泡卵母细胞（2~6mm）。

但在特别大的卵泡中有些卵母细胞有严重退化的现象。

大多数哺乳动物的卵母细胞被卵丘细胞包裹形成COCs）。

排卵之前，卵丘细胞扩展，合成大量胞外基质，并富含透明质酸（Hyaluronic：HA），有利于排卵后进入输卵管，同时保证了卵母细胞正常的受精和胚胎发育潜力，所以，卵丘细胞的扩张对卵母细胞成熟，特别是卵母细胞胞质成熟起着重要作用。

根据卵母细胞外面包裹的卵丘细胞的层数将其分成三级。

A 级：卵丘细胞在3 层或3层以上。

B 级：卵丘细胞为1~2 层；或卵丘细胞虽在3 层或3 层以上，但是不完整，部分为1~2 层。

C 级：裸卵或卵丘细胞虽为1~2 层或多层，但是不完整，部分裸露。

A 级卵母细胞的培养效果要优于B 级和C 级。

2.1.4采集卵母细胞的方法目前，常用的采集猪卵母细胞的方法有三种即抽吸法、切割法和刺破法，相对于刺破法和切割法而言，抽吸法较为常用，但是所获得的卵母细胞质量较差，甚至出现较多的裸卵，进而间接地影响了体外培养的效果。

2.2影响猪卵母细胞体外成熟的物理性因素2.2.1 体外成熟培养条件温度不同动物的卵母细胞所需要的体外成熟培养温度因动物种类的不同而不同，猪所需要的温度一般为38℃~39℃较为适宜，过高或过低都不利于细胞的发育。

湿度在IVM 时一般采用的是饱和湿度，目的是减少培养基内的水分蒸发，从而维持培养基中卵母细胞所需要的各种物质的浓度及保持渗透压。

通常在培养基上面覆盖一层石蜡油或矿物油，以使在培养箱内或离箱操作时维持培养基的气相、湿度与pH 值。

此外，培养箱所用的水的纯度和高度无菌也是培养成功的关键性因素。

气相环境目前卵母细胞常用的培养气相有两种即是5%CO2、5%O2、90%N2和5%CO2、95%的空气[xxxii]。

在这两种气相中，CO2的含量很关键。

多数培养基在配制前都已将pH 值调好，并具有一定的缓冲能力，因此，5%CO2 则刚好是维持pH 所必需。

另外，要保证所用气体的无毒。

2.2.2体外成熟培养时间不同动物的卵母细胞所需要的体外成熟培养时间因动物种类的不同而有所不同，大多数哺乳动物所需要的体外培养时间为22~24h，但是对猪而言，却需要更长的时间，一般，猪卵母细胞体外成熟培养的时间为44h。

Sosnowki 等研究发现培养40~48 h 与30~36 h 对猪卵母细胞体外成熟率差异显著，但是分析染色体核型发现，随着体外培养时间的延长，染色体异常率会随之增加。

2.2.3体外成熟培养方式目前，常用的猪卵母细胞体外成熟培养方式有微滴培养法、套皿培养法及普通的单皿培养法。