猪卵母细胞的体外成熟研究
猪卵母细胞体外培养质量评价指标
生长因子是一类促进细胞生长和分化的蛋白质，在猪卵母细胞体外培养过程中， 如胰岛素、表皮生长因子等对卵母细胞的发育和成熟也有重要作用。
能量物质和代谢物质含量
能量物质
猪卵母细胞在体外培养过程中需要消耗大量的能量物质，如葡萄糖、氨基酸、维生素等。这些物质含量的变化会 影响卵母细胞的发育和成熟。
代谢物质
通过检测培养液中生长因子的含量，如 IGF-1、EGF等，评估卵母细胞的生长和 发育潜力。
能量物质和代谢物质检测
检测糖分
通过检测培养液中的糖分 含量，评估卵母细胞的能 量代谢状况。
检测乳酸
通过检测培养液中的乳酸 含量，评估卵母细胞的代 谢状况和细胞活性。
检测氨氮
通过检测培养液中的氨氮 含量，评估卵母细胞的蛋 白质代谢状况。
用。
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培养液中各种营养物质的含量 和比例对卵母细胞的发育和质
量有重要影响。
激素的作用
一些激素如促性腺激素等对卵 母细胞的发育和成熟具有重要
作用。
环境因素
温度、湿度、氧气浓度等环境 因素对卵母细胞的体外培养也
有重要影响。
CHAPTER 03
猪卵母细胞体外培养质量评 价指标
卵母细胞形态与成熟度
卵母细胞形态
CHAPTER 02
猪卵母细胞体外培养概述
猪卵母细胞的生物学特性
猪卵母细胞的形态
呈圆形或卵圆形，具有一个大的卵黄和透明带。
猪卵母细胞的发育阶段
猪卵母细胞在不同的发育阶段，其形态和大小也会有所不同。
猪卵母细胞体外培养技术
01
02
03
卵母细胞的采集
通常从猪卵巢中采集未成 熟的卵母细胞，然后进行 体外培养。
培养介质、卵丘细胞和卵泡直径对猪卵母细胞体外成熟的影响
胞 归 于死亡 或退 化 。
中 图分 类 号 ：８ ８ ３ Ｓ２ ．
意 大 利 科 学 家 Ｍａ ｉ （９ ９ 最 先 进 行 猪 卵 母 细 胞 的 体 外 ｔｏ １８ ） ｔｌ
培 养 研 究 Ｊ 并 且 体 外 成 熟 的 卵 母 细 胞 与 精 子 体 外 受 精 ， 得 ， 获
维普资讯
实
验
研
究
一
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王 海 ， 申 明 ， 士 恩 ， 中红 ， 忠诚 曾 朱 吴 张
（ 国农 业 大 学 动 物 科 技 学 院 ， 京 １０９ ） 中 北 ００４
摘要： Ａ类 卵母细 胞在 ｍ Ｃ ．９ 、 Ｃ Ｕ ３和 Ｎ Ｓ ３ Ｔ Ｍ １９ Ｎ Ｓ ２ Ｃ Ｕ ７体 系 中培 养 ４ ５ ４ ２小 时后 ， 熟 率 分 别 为 ７ ． ％ 、８ １ 成 ６ １ ７ ． ％和 ６ ． ５
下 三种 体 系进行 成熟 培养 ： （ ）ｍ Ｃ １９： Ｏ ｓ先 在 Ｔ Ｍ１９ 含 Ｅ ｒ １ Ｔ Ｍ一９ Ｃ Ｃ Ｃ ９（ ａｌ ， ＩＣ ） ｅ盐 ＧＢ Ｏ 添 加 ０ ５９ ｇＬ葡 萄 糖 ， ．１６ ／ ．４ ６ ／ ０ ３ ８ ｇＬ乳 酸 钙 ， １０ Ｌ丙 酮 酸 钠 ， ０．０ １ ２ １６ ｇＬ山 梨 醇 ，Ｏ ｇｍ Ｅ Ｆ １Ｉ／ ｌｅ Ｇ（ｎｅｖｔ ， ＯＵ ｍ ．８ ４／ ｌｎ ／ ｌＧ ，０Ｕ ｍ Ｃ Ｉｔ ｅ） ｌ Ｉ／ ｌ ｒ ｈ Ｇ Ｉｔ ｖｔ和 １ ％猪 卵 泡 液 （ Ｆ ，／） 培 养 ２ Ｃ （ｎ ｒｅ） ０ ｅ Ｐ Ｆ ｖｖ 中 ４小 时 ， 后 然
猪卵母细胞体外成熟及电激活后发育能力的研究
１ 材 料 与 方 法
１ １ 卵母 细胞 的采 集 和体 外培 养 ．
猪 卵 巢保 存 在 含 有 青 、链 霉 素 的 生 理 盐 水 中 ， 运 输 温 度 ３ —３ ℃ ，３ｈ内 运 回 实 验 室 ． 用 加 青 、 ３ ８ 链 霉 素 的生理 盐水 冲 洗卵 巢 ３ ５次 ，然后 抽 取 ２ — —
激 素（ Ｃ ＋促 卵 泡素 （ Ｓ 组卵 母细胞 成 熟率 略高 于 Ｆ Ｈ＋促黄 体 素（ Ｈ） ，两者 卵母细 胞 成 ｈ Ｇ） Ｆ Ｈ） Ｓ Ｌ 组 熟 率极 显著 高 于尿促 性腺 激素（ ＭＧ） ｈ 组．（ ）含 胎牛 血 清（ Ｂ ） ３ Ｆ Ｓ ，猪 卵泡 液（ Ｆ ） Ｐ Ｆ ，表 皮 生长 因子 （ ＧＦ 的培 养 液较 对 照组 在 卵 母 细胞 成 熟 率上 无 显著 差 异 ，但 均 能 显著 提 高 电激 活 后 的 卵 裂 率． Ｅ ） 添加 Ｅ ＧＦ组 桑囊 率 明显高 于不 添加 组． 但 分 别 添加 Ｆ Ｓ和 Ｐ Ｆ组 较对 照组 在 桑 囊 率上 均 无 显著 Ｂ Ｆ 差异．（ ） 卵 丘细胞 扩 散 与卵母 细胞 第 一极体 排 出之 间无直 接 相关 性 ，但扩 散 程度好 能提 高 电激活 ４
后的 卵裂 率．
关键 词
猪 卵母细胞 体外成熟 电激活
相 对体 内成熟 的卵 母 细胞 来 说 ，猪 体 外 成 熟 的 卵母 细 胞来 源 丰 富 ，价 格低 廉 ，因 而 已成 为 体 外 受 精 、核 移植 研 究 的 主 流．但 目前 ，猪 卵母 细 胞 体外 成 熟 系统还 不 太 完善 ，体外 成 熟 培 养 时 间较 长 ，许 多 理 化 因 素会 直 接或 间接地 影 响 到 卵母 细胞 的体 外 成 熟 及后 来 的 发 育 能 力 ． 在 克 隆 胚 的发 育 能 力 上 ， 体 内成熟 的 卵 母 细 胞 要 好 于 体 外 成 熟 的 卵母 细 胞 ， 能提 高克 隆 猪 的成 功 率 ］ ．如 何 优 化 猪 卵 母 细 胞 体外 成熟 系 统 ，使 得 卵母 细 胞 核 、质 同步 成 熟 ，以 便 获 得 较 强 的 发 育 能 力 ，为 当 今 亟 需 解 决 的 问 题Ｌ ．至今 还很 少 见 到 有 关 猪 卵母 细 胞 体 外 成 熟 及 ４ ］ 电激 活后 发 育 能 力 系 统 比较 的研 究报 道 ．本 实 验 比 较 了不 同培养 液成 分 对猪 卵 母 细胞 体 外 成熟 及 电激 活后 发 育 能力 的影 响 ， 旨在 筛 选 出 一种 较 为 适 宜 的 猪 卵母 细胞 体外 成 熟 培 养 系统 ，为 进行 猪 体 细 胞 核
采用真空泵法快速获取猪卵母细胞
采用真空泵法快速获取猪卵母细胞摘要：试验比较了真空泵法与传统的手动抽吸法对猪卵母细胞成熟效果的影响，结果表明，真空泵法在平均使用时间、卵母细胞的收集效率及Ａ、Ｂ级卵母细胞所占的比例方面均优于手动抽吸法，在卵母细胞的成熟率方面稍低于手动抽吸法。
表明真空泵法是一种有效的猪卵母细胞采集方法。
关键词：猪卵母细胞；体外成熟；真空泵法；手动抽吸法Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｗａｓａｉｍｅｄｔｏｓｅｔｕｐａｎｅｗｓｗｉｎｅｏｏｃｙｔｅｓｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗｉｔｈｖａｃｕｕｍｐｕｍｐｔｏsubstitute for ｔｈｅｏｌｄｍａｎｕａｌａｓｐｉｒａｔｉｏｎａｎｄｒａｉｓｅｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｔｈｅｓｗｉｎｅｏｏｃｙｔｅｓｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｖａｃｕｕｍｐｕｍｐｗａｓｓｕｐｅｒｉｏｒｔｏｍａｎｕａｌａｓｐｉｒａｔｉｏｎａｔａｖｅｒａｇｅｕｓａｇｅｔｉｍｅ，ｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｔｈｅｏｏｃｙｔｅｓｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｒａｔｅｏｆA，B ｑｕａｌｉｔｙｏｏｃｙｔｅｓ，ｂｕｔｉｎｆｅｒｉｏｒａｔｔｈｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｃｕｌｔｕｒｅ．Ｉｔｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎof ｏｏｃｙｔｅｗｉｔｈｖａｃｕｕｍｐｕｍｐｗａｓａｎｅｗａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｍｅｔｈｏｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｗｉｎｅｏｏｃｙｔｅｓ；ｉｎｖｉｔｒｏｍａｔｕｒａｔｉｏｎ；collection method ｗｉｔｈｖａｃｃｕｍｐｕｍｐ；manual aspiration method自１９８９年Ｍａｔｔｉｏｌｉａ等［１］用体外成熟的卵母细胞获得试管猪以来，卵母细胞的体外成熟培养已经取得了较大的进展［２］。
而从屠宰场废弃卵巢中抽取卵母细胞已为大多研究者所接受。
但对于优良的种畜禽、珍稀野生动物以及人而言，通常所用的抽吸法会浪费掉许多小卵泡内的卵母细胞，对卵母细胞上卵丘细胞的完整性也有一定的影响。
猪卵母细胞体外成熟技术研究进展
安徽农业科学。ｏｒａ ｏ Ａ ｈｉ ｍ ． ｃ．０６ ３ （１ ：５６ ５８ ５６ Ｊｕｎｌ ｆ ｎｕ Ａ ｉ Ｓｉ ０ ，４ ２ ）５５ —５５ ，５０ ２
责任 编辑
孙红忠
责任校对
孙 红忠
猪 卵母 细 胞体 外成 熟技 术研 究 进展
项智锋， 李艳， 清华 （南 技 院 物 学 院河 新 ４０） 王 河 科 学 动 科 学 ，南 乡 ５０ ３ ３
摘要 猪 卵母 细胞体 外成熟 （ ） ⅣＭ 为猪胚胎 的体 外 生产及 相关胚胎 工程技 术如 胚胎 细胞和 体 细胞核 移植 、 转基 因和性 别控 制提供 了廉 价原料 ， 是现代 胚胎 工程技 术 的研 究热点之 一。 多年 来科研 人 员为 了进 一步提 高卵母 细胞体 外培养 成熟率 以及 更深入 地 了解 卵母 细胞 成 熟机 制 ， 对影响 卵母 细胞体 外成熟的 因素进 行 了大量的研 究。综述 了影 响猪 卵母 细胞体 外成 熟的相关 因素。 关键词 体外成 熟； 卵母 细胞 ； 胚胎 工程 中图分 类号 ￥ １． ８４６ 文 献标识码 Ａ 文章编号 ０１ — ６１２０）１ ５５ — ３ ５７ ６１（０６２ — ５６ ０
５ 卵母细胞 采集方法
卯母细胞的采集方法有抽吸法和切剖法。在从离体卵
巢 上 采集 卵母细 胞 时 ， 因采集 方法 不 同 ， 得 卵母 细胞 体外 所
近几年 的研 究发现 ， 经产母猪 卵母细胞 在成熟 率及胚 胎 发育能力方面 明显 优于 青 年母 猪＿ 。处 于不 同的发 育 阶段 ｌ Ｊ
１ 猪的品种
存温度及贮存 时间影 响卵母 细胞 的体外成 熟。Ｗａｅ 和 ｌｒ ｔ
Ｇａ ｓ ｒ ｅ研究 了不 同保存 温 度 （、６２ 、 ｙ ５１、５３ ０和 ３ ） 不 同贮 ７ｑ 及 ｃ 存时 间（，、 、 ２６ １ １ ２ 对猪 卵母 细胞 体外成熟 的影 响 ， ０ ４和 ６ ） ｈ 发 现不 管 采用 哪种 温度 ， 随着贮存 时间 的延长 ， 细 胞 的成 卵母
不同月份猪卵母细胞体外成熟效果比较
不同月份猪卵母细胞体外成熟效果比较许惠艳;胡林林;归婧;杨小淦;卢克焕【摘要】[目的]分析卵母细胞发育与不同季节(月份)的相关性,为提高猪卵母细胞的体外成熟效率奠定基础.[方法]2012年2～6月从南宁市某屠宰场收集猪卵巢采集卵母细胞,经体外成熟(IVM)40～44 h,然后随机挑出成熟后的卵母细胞进行地衣红染色,相差显微镜下观察、记录卵母细胞发育成熟的各个时期,并分析卵母细胞发育时期与不同月份温度、湿度的相关性.[结果]随着月份的增加,GV期和GVBD期卵母细胞所占比例整体上呈下降趋势,AT期所占比例呈上升趋势,除5月外,MⅡ期所占比例整体上也呈上升趋势,6月MⅡ期所占比例最高,为42.31％.2、3、4月的GVBD期所占比例显著高于6月所占比例(4.40％)(P＜0.05).从卵母细胞发育时期与不同月份温度、湿度的相关性分析结果可知,GV期、GVBD期、MⅠ期3个时期与温度变化呈负相关,与湿度变化呈正相关；而AT期、MⅡ期与温度变化呈正相关,与湿度变化呈负相关.[结论]不同月份猪卵母细胞的IVM效果存在一定差异.在高湿低温月份,GV期和GVBD期的卵母细胞所占比例较大,MⅡ期所占比例较小；而在低湿高温月份,GV期和GVBD期所占比例较小,MⅡ期所占比例较大.【期刊名称】《南方农业学报》【年(卷),期】2013(044)004【总页数】5页(P676-680)【关键词】猪;卵母细胞;体外成熟;不同月份;发育;地衣红染色【作者】许惠艳;胡林林;归婧;杨小淦;卢克焕【作者单位】广西亚热带生物资源保护利用重点实验室;广西大学动物科学技术学院,南宁530005;广西亚热带生物资源保护利用重点实验室;广西大学动物科学技术学院,南宁530005;广西亚热带生物资源保护利用重点实验室;广西大学动物科学技术学院,南宁530005;广西亚热带生物资源保护利用重点实验室;广西大学动物科学技术学院,南宁530005;广西亚热带生物资源保护利用重点实验室;广西大学动物科学技术学院,南宁530005【正文语种】中文【中图分类】S828.350 引言【研究意义】卵母细胞体外成熟（In vitro maturation，IVM）作为胚胎工程的基础环节，其成熟效果直接影响到体外受精、核移植、转基因等后续相关研究的开展。
猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活的研究
猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活的研究猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活的研究引言：随着现代生物科技的不断发展，人们对于动物胚胎发育过程的探索也愈发深入。
猪作为一种重要的农业畜牧业动物，其生殖发育研究对于提高繁殖效率和品种改良具有重要意义。
猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活的研究被认为是改善猪生殖效率的关键技术之一，本文将就该研究进行探讨。
一、猪卵母细胞体外成熟的研究进展1.1 体外培养条件的优化猪卵母细胞的体外成熟需要适宜的培养基和环境条件的支持。
过去的研究中发现，添加荷尔蒙和营养因子可以促进卵母细胞的发育，但也有一些不良因素对其生成产生负面影响。
如今，研究人员通过改良培养基成分和添加植物激素等手段，成功地提高了卵母细胞的发育率和质量。
1.2 卵母细胞成熟标志物的鉴定卵母细胞的成熟状态可以通过某些标志物的表达情况进行鉴定。
近年来，研究人员发现，猪卵母细胞的成熟可以通过检测卵母细胞表面的特定蛋白、细胞器的形态及功能等进行判定。
这些标志物的鉴定为猪卵母细胞体外成熟的监测提供了依据。
1.3 卵母细胞体外成熟能力的提高提高猪卵母细胞的体外成熟能力对于提高繁殖效率具有重要意义。
研究人员通过调整培养条件、添加辅助因子等手段已取得了一定的突破。
例如，改善培养基中气相和营养物质的供应，可以促进细胞发育和成熟率的提高。
此外，添加某些荷尔蒙如促黄体生成素、卵泡刺激素等也能够提高卵母细胞的体外成熟能力。
二、孤雌激活的研究现状2.1 孤雌激活的意义孤雌激活是指在缺乏精子参与的情况下，卵母细胞可以自主地发育和分裂，从而获得新生命。
这种现象在动物界被广泛研究并被认为是生殖发展领域的一个热点。
对孤雌激活机制的深入研究不仅可以理解胚胎发育的基本过程，还有助于解决某些生殖障碍的问题。
2.2 孤雌激活的机制目前，孤雌激活的机制尚不完全清楚，但有一些重要的研究和理论已经提出。
研究发现，内质网钙离子释放和细胞质内信号通路的活化是孤雌激活的重要因素。
哺乳动物卵母细胞体外成熟的研究进展
成熟分裂的核网期 、 Ａ Ｉ ＴＩ Ｍ Ｉ、 、 和第 ２次成熟分 们将处于这一时期的卵母细胞称为前期停滞 的卵母
裂 的 间期 而达 到 ＭⅡ。 着卵母 细胞 的发育 ， 随 生发 泡 细胞 （ｒｐａｅｂｏｋｄｏｃｔｓ， ｐｏｈｓ— ｌ ｅ ｏｙｅ） 自卵巢 表 面 卵泡 中 ｃ
增大 ， 由中央移 向质膜 ， 紧靠 脂膜 下 。核膜 打褶 而 抽 取 的卵 母 细 胞 就 处 于 这 个 时 期 （ 发 泡 期 ， Ｖ 并 生 Ｇ
达 ９ ％以上 。 ０ 然而 ， 体外成 熟 卵母 细胞 的质量 和 发育 空泡 ， 线粒 体 由小 嵴 、 圆形或 椭 圆形转 变 为带 帽线 粒 潜 能 与体 内成 熟 的卵母 细胞 相 比仍 有 较 大 差距 ， 这 体 ， 是卵母 细胞 成熟 的另一 重要 标志 。 粒体 先移 这 线
到完全 成熟 。 此后 ， 卵母 细胞 的体外 成熟培 养得 到 了 中皮质 颗粒排 列 到质膜 下 被认 为是 哺乳 动物 卵母 细 迅 速发 展 。目前 ， 卵母 细胞 的体 外成 熟技术 己被 广泛 胞成 熟 的一个 重要 标志 ｝ １ ｊ 。随着 卵母 细胞 的退 化 ， 皮 应 用 于科 学研 究 、 畜牧 生 产 和 医学 生殖 工 程 中 ， 、 质颗粒 则成 堆分 布 ， 牛 并有 许 多排到 卵周 隙 中。 电镜 在 羊 未成 熟卵母 细 胞经 体外 培养 ，排 出第 １ 体率 可 下 ， 极 线粒 体 由近核 区移 向皮 质膜 下 区 ， 一端 出现大 在
不完 全成熟 是 造成体 外 受精胚 胎 生产效 率低 的主要 断定 的 。卵 丘细 胞扩展 常 用作 判 断卵母 细 胞体 外成
原 因。
熟 的特 征 。
２ 卵母 细胞 的成 熟 过程 卵母 细胞成 熟是 指 充分生 长 卵母 细胞 向成 熟 卵
卵母细胞成熟过程中添加MG132促进了体细胞核移植之后的胚胎发育且改变了卵母细胞和胚胎的
MG132 Treatment During Oocyte Maturation Improves Embryonic DevelopmentAfter Somatic Cell Nuclear Transfer and Alters Oocyte and Embryo TranscriptAbundance in Pigs卵母细胞成熟过程中添加MG132促进了体细胞核移植之后的胚胎发育且改变了卵母细胞和胚胎的基因表达水平摘要本研究的目的是在卵母细胞体外成熟（IVM）过程中添加一种蛋白酶体抑制剂MG132，检测其对卵母细胞成熟和胚胎发育的影响。
在一系列的实验过程中。
来源于中等卵泡（直径3-8mm）的卵母细胞在IVM过程中用MG132处理，分别为0-22小时（M0-22）,30-42小时（M30-42）,以及不添加MG132的对照组（MCO）。
结果，在核成熟和胞质成熟上没有显著影响（通过评估细胞内谷胱甘肽和P34cdc2激酶的活性），然而，在孤雌激活（PA）和体细胞核移植(SCNT)后囊胚的形成上，实验组显著高与对照组，具体为：M30-42组PA 为65.2%，SCNT 为27.7%；M0-22组PA45.3%，SCNT19.5%；MCO组PA 42.6% ，SCNT 13.6%. 基因的表达上，M30-42组IVM 卵母细胞PCNA,ERK2表达增加，而4-cell SCNT 胚胎POUF51、DNMT1、FGFR2、PCNA表达增加。
来源小型卵泡（直径<3mm）的卵母细胞在IVM过程中用MG132处理，分别为0-22小时（S0-22）,30-42小时（S30-42）, 0-22小时MG132处理后再30-42小时IVM（S0–22/30–42）以及不添加MG132的对照组（SCO）。
结果，SCNT 后在囊胚的形成上，S30-42为16.5%和S0–22/30–42为20.8%，高于SCO为8.7%和S0–22为8.8%；在基因表达上，S30-42和S0–22/30–42组，POU5F1、DNMT1、FGFR2和PCNA都高于SCO和S0–22组。
猪卵母细胞体外成熟培养的研究
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ Ｔ ｈ ｅ ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｃ ｏ ｍｐ ａ ｒ ｅ ｄ ｔ ｈ ｅ ｅ ｆ ｅ ｃ ｔ ｏ ｆ ｄ ｉ ｆ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ｃ ｏ ｎ ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｐ ｏ ｒ ｃ ｉ ｎ ｅ ｆ ｏ ｌ ｌ ｉ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ ｌ ｆ ｕ ｉ ｄ（ Ｐ Ｆ Ｆ ） ，ｄ ｉ ｆ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ｋ ｉ ｎ ｄ ｓ ｏ ｆ ｈ ｏ ｒ ｍ ｏ ｎ ｅ 。 ｄ ｉ ｆ －
（ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ａｎ ｉ ｍａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ／ Ｋ ｅ ｙ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｏ ｆ Ｔ ａ ｒ ｉ ｍ Ａｎ ｉ ｍａ ｌ Ｈｕ ｓ ｂ ａ ｎ ｄ ｙ ｒ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ＆ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ
Ｋｅ ｙ Ｗ ｏｒ ｄｓ Ｐｏ ｒ ｃ ｉ ｎ ｅ；Ｏｏ ｃ ｙ ｔ ｅ ｓ；Ｉ ＶＭ
随着 胚 胎 工 程 技 术 的研 究 与 应 用 ， 卵母 细 胞 作
猪 卵 母 细胞 体 外 成 熟培 养 的研 究
王艳 萍 曾维斌 杨顺邦 贺 昌萍
（ 塔里木大学动物科学学院／ 新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室 ， 新疆 阿拉尔 ８ ４ ３ ３ ０ ０ ）
摘要 本研究对 比了不 同浓 度的猪卵泡液 、 激素 、 卵 泡直径 对猪 卵母 细胞 体外 成熟 培养 的影 响。结果 表 明 ： ①在 Ｔ Ｃ Ｍ１ ９ ９＋
Ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｏ ｎ Ｐｏ ｒ ｃ ｉ ｎ ｅ Ｏｏ ｃ ｙ ｔ ｅ ｓ ｉ ｎ Ｖｉ ｔ ｒ ｏ Ｍａ ｔ ｕ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ
Ｗａ ｎ ｇ Ｙａ ｎ ｐ ｉ ｎ ｇ Ｚｅ ｎ ｇ Ｗｅ ｉ ｂ ｉ ｎ Ｙａ ｎ ｇ Ｓ ｈ ｕ ｎ ｂ ａ ｎ ｇ Ｈｅ Ｃｈ ａ ｎｇ ｐ ｉ ｎ ｇ
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农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2005,13(5):644~648*基金项目：国家重点基础发展规划(973)项目(No.G199********)和国家高技术研究与发展计划(863)项目(No.2002AA216161)资助。
胡军和：男,1979年生,硕士研究生。
E-mail:<hjh797813@>. **通讯作者。
Author for correspondence.E-mail<douzhongying@>. 收稿日期：2004-07-20接受日期：2004-09-01·研究论文· 猪卵母细胞在不同条件下的体外成熟培养*胡军和1,2杨春荣1窦忠英1**(1.西北农林科技大学国家干细胞工程研究中心陕西分中心，杨凌712100;2.榆林学院生命科学学院，榆林719000)摘要：研究了不同时间段添加外源激素及不同基础培养液和血清有无对猪卵母细胞体外成熟的影响。
实验包括(1)猪卵母细胞以TCM199+10%FBS+10IU/mL pregnant mare serum gonadotrophin (PMSG)+10IU/mL human chorion gonadotrophin(hCG)+2.5IU/mL follicle stimulate hormone (FSH)为成熟培养液体外培养44h,前22h 在培养液中加激素,后22h 不加激素及前22h 不加激素,后22h 添加激素和添加激素连续培养44h ；(2)以实验(1)中激素添加的方案在体外添加激素连续培养44h ，对不同基础培养液(TCM199粉剂、TCM199原液和改良TCM199(mM199))对猪卵母细胞体外成熟进行了研究;(3)以实验(2)中筛选出的mM199组为成熟培养液对比血清有无对猪卵母细胞体外成熟的影响。
结果表明，实验(1)中3种激素添加不同时间段其成熟率分别为45.67%、45.29%和46.07%，对猪卵母细胞体外成熟无显著影响(>0.05)；实验(2)中，mM199组的成熟率(54.10%)高于TCM199粉剂组的成熟率(46.16%)及TCM199原液组的成熟率(47.14%)，但差异不显著(>0.05)；实验(3)中无血清组的成熟率(67.10%)高于有血清清组的成熟率(52.22%),差异显著(<0.05)。
由此表明，mM199+10IU/mL PMSG+10IU/mL hCG+2.5IU/mL FSH 是一种适合于猪卵母细胞体外成熟的培养液，体外成熟率达67.10%。
关键词：猪；卵母细胞；体外成熟；改良TCM199Porcine Occyte Maturation Culture on Different ConditionsHU Jun-He 1,2YANG Chun-Rong 1DOU Zhong-Ying 1**The effects of different hormone requirements in different stages of porcine oocytes,different basic mature mediumand with or without serum in mature medium on porcine oocyte maturationwere studied.The experiments included,(1)Porcine oocytes were cultured in TCM199+10%fetal bovine serum(FBS)+10IU/mL pregnant mare serum gonadotrophin(PMSG)+10IU/mL human chorion gonadotrophin(hCG)+2.5IU/mL follicle stimulate hormone (FSH)for 44h,removal of hormone sup-plement from mature at 22h after culture,culture for 22h in the medium without hormone supplement and subsequent supplement hormone for another 22h and culture for 44h in medium with hormone supplement;(2)porcine oocytes cultured for 44h in three dif-ferent basic medium (TCM199powder,TCM199medium and modified TCM199)with the ways of hormone supplement in experi-ment (1);(3)porcine oocytes cultured in modified TCM199of experiment(2)with or without serum.The results showed,(1)three dif-ferent stages ’hormone supplement was not significant difference (＞0.05)in the rate of maturation 45.67%,45.29%and 46.07%respectively ;(2)the rate of maturation of the group of modified M199(54.01%)was higher than that of the group of TC M199pow-der (46,16%)and TCM 199medium (47,14%),but it has no significant difference (＞0.05);(3)the rate of maturation of the group of free-serum(67.10%)was higher than that of the group with serum(52.22%)and it had significant difference(＜0.05).Therefore,the group of mM199+10IU/mL pMSG+10IU/mL hCG+2.5IU/mL FSH was adapted to culture porcine oocytes for 44h,and therate of maturation was to 67.10%.第5期胡军和等:猪卵母细胞在不同条件下的体外成熟培养卵母细胞是胚胎工程技术研究中最为重要的一种实验材料，随着胚胎工程技术迅速发展，对卵母细胞的需求量也越来越大。
早期研究中，人们主要通过超数排卵技术采用体内成熟的卵母细胞，但获得的体内成熟卵母细胞数量少，而且所需费用较高。
哺乳动物卵巢上有大量卵母细胞，研究和建立卵母细胞体外成熟培养方法，可以充分利用屠宰动物的卵巢资源，为体外胚胎生产和核移植研究提供大量卵母细胞。
经过许多学者的深入研究，已经可以获得牛、绵羊、猪、山羊等各种动物的体外成熟卵母细胞，并且经过进一步研究，体外成熟卵母细胞可以代替体内成熟卵母细胞应用于胚胎工程技术的各个领域。
Mattioli 等(1988)进行了猪卵母细胞的体外成熟培养的研究。
尽管经过多年的发展，猪的卵母细胞的体外成熟培养(IVM)系统得到了较大的的改进和提高，但刘红林等(1994)研究发现还存在卵裂率低，发育易阻滞等缺陷。
本实验对不同激素添加时间、不同基础成熟培养液、有无血清添加等因素对猪卵母细胞体外成熟的影响进行研究，以获得更多数量和更优质的猪卵母细胞用于IVF 和核移植研究。
1材料和方法1.1试剂与用品本研究中所用试剂除特别指明外，均购自Sig-ma 公司。
TCM199粉剂及TCM199原液购自Gibco 公司；fetal bovine serum (FBS)购自Hyclone 公司；pregnant mare serum gonadotrophin (PMSG)、human chorion gonadotrophin(hCG)和follicle stimulate hor-mone(FSH)购自宁波激素制品厂；猪卵泡液(pFF)用常规血清制备法自制；洗卵液为添加10%NBS 的PBS(自配)。
1.2猪卵巢的采集及运输猪卵巢采集于兴平某屠宰场，采集卵巢个体的年龄、遗传背景、妊娠与否不详。
采集卵巢置于30~39℃加双抗的生理盐水中，于4h 内运回实验室。
1.3卵母细胞的采集与体外成熟培养用抽吸法采集卵巢卵母细胞。
去除卵巢上附着的输卵管等组织，用加双抗生理盐水清洗3次后，用带有12#针头的10mL 注射器抽吸卵巢表面2~8mm 卵泡的卵泡液，在体视显微镜下检出卵母细胞。
检卵时按卵丘细胞多少及胞质明暗分为3类：A 类卵母细胞含有5层以上卵丘细胞，胞质均匀较暗(图1,A)；B 类卵母细胞包有1~4层卵丘细胞(图1,B)；C 类为胞质不均或只有少许卵丘细胞的畸型卵、裸卵和半裸卵。
选择A 、B 类卵母细胞，用洗卵液和成熟培养液分别清洗3次后进行体外成熟培养。
培养条件为39℃、5%CO 2和饱和湿度。
培养44h 后用0.3%透明质酸酶(无Ca 2+、Mg 2+的PBS 液配制)37℃消化3~5min ，辅以适当口径玻璃管反复吹打去除卵丘细胞判定成熟情况。
卵母细胞成熟以排出第1极体为标准，并结合成熟卵形态学进行评价。
1.4实验设计实验1：本实验目的是对报道中培养液添加外源激素添加时间对猪卵母细胞体外成熟的影响进行比较，以确定最佳外源激素添加时间。
实验分3组进行猪卵母细胞体外成熟培养：A 组,TCM199粉剂+10%FBS+10IU/mL PMSG+10IU/mL hCG+2.5IU/mL FSH 培养44h 。
B 组,TCM199粉剂+10%FBS+10IU/mL PMSG+10IU/mL hCG+2.5IU/mL FSH 培养20~22h 换液后转入无激素培养液中继续培养22~24h 。
C 组，TCM199粉剂+10%FBS 中先培养20~22h ，然后转入M199+10%FBS+10IU/mL PMSG+10IU/mL hCG+2.5IU/mL FSH 中继续培养22~24h 。
实验2：以实验1中A 组外源激素添加时间比较TCM199粉剂、TCM199原液与改良TCM1999粉剂(添加0.1%PVA ，0.57mol/L 半胱氨酸，3.05mmol/L 葡萄糖和0.91mmol/L 丙酸酸钠)对猪卵母细胞体外成熟的影响。