疟原虫的镜检技术.

熟练工作者的推片姿势
厚血膜的制作
• 厚血膜 用推片的左下角，从取血部位刮取①约 4～5微升血量（相当于火柴头大小），使血滴 与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋 转，转2～4圈，涂成②直径0.8～1cm大小圆形 厚血膜(厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到 5～10个自细胞为宜)，③厚血膜的位置，位于 玻片右1/3处[中央偏右（或6等份中的与贴标签 的1、2份相邻的第3份中部）] 。④厚血膜外观： 圆形厚薄均匀，无划痕。过厚易于脱落，过薄 达不到检出率的要求，以油镜视野5-10个WBC 为宜。
我们主要用吉氏染液，它具有方便，染色效 果稳定，便于长期保存的优点。瑞氏染色，染色 时间短，但染色效果不如吉氏稳定，主要在门诊 量大的门诊实验室使用。
染液的种类及染色原理
注意：蛋白质和氨基酸都是两性电解质，要求染液 的pH值7.0-7.2较好。
染液偏酸时，所带的正电荷增加，易于伊红结合，使 红细胞和疟原虫的核染成鲜红色，而淋巴细胞和原虫的胞 浆着色较差；反之，当染液偏碱时，红细胞和嗜伊红白细 胞的颗粒等被染成紫蓝色，不易观察。
★ 快速诊断试纸条可与镜检 疟原虫相互补充。
疟原虫抗原检测
• （一）原理
• 快速检测试剂是通过在硝酸纤维素膜（NC）试纸条上产 生可见的条带来检测抗原的一种“免疫-层析”试剂。染 色标记抗体与疟原虫抗原结合，复合物由试剂条检测线上 的抗体捕获后，形成一条可见的条带（检测线）。 • 检测的第一步是将溶血剂与血液混合，破坏血红细胞释放 疟原虫蛋白，便于与标记抗体靶蛋白结合；然后将血液与 标记抗体的混合液置于硝酸纤维试纸条上，并通过毛细管 作用和缓冲液/清洗剂推力，使混合液在试纸条上移动并 通过检测线与对照线。
血膜的制作（取血操作）
在采集标本、制作血片前，首先要核 对患者的姓名、年龄和住址。 • 采血部位和方法：采血部位一般人为耳 垂，指头；一人一针，常规消毒、采血。
取血部位和血量
采血部位和取血方法：
耳垂或无名指（婴幼儿母 趾或足跟），通常在耳垂 取血，先用75%酒精棉球消 毒取血部位，待酒精干后， 用左手拇指和食指紧捏耳 垂上方或无名指指尖，右 手持消毒针迅速刺入皮肤， 不宜过深或过浅。然后用 右手中指轻轻挤压出血。 厚血膜血量约一粒大米 （即火柴头）大小。
标签
标本片
发热病人血片
薄血膜的制作
• 薄血膜 用推片一端边缘的中点从取血部分①取约 1～1.5微升的血量（相当于1/4火柴头大小），使血 滴与平置的载玻片接触，并形成25～350夹角，待血 液向两侧扩展约② 2cm～2.5cm宽时，均匀而迅速 地从右向左推成舌状薄血膜（约2.5cm长）。推制时 速度要均匀，血滴大小、推片与载玻片之间夹角大 小及展开血膜的速度快慢等常影响血膜的厚薄。制 成的薄血膜应在玻片上形成平铺的血细胞，细胞之 间互相接触而不相互重叠。③薄血膜外观：舌状厚 薄均匀，无划痕，④位于玻片1/2～1/3处【左半部 分（或第4—6份）】 。
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血膜的制作（取血时间）
• 采血时间 现症病人和流调普查时可不考虑取血时机。但在 诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。 • 疟疾典型的临床表现分前驱期、发冷（寒战）期、发热期、 出汗期和间歇期五期。 • 间日疟在前驱期相当于肝内期疟原虫发育，因原虫密度太低， 镜检多为阴性。发冷（寒战）期相当于红内期成熟裂殖体涨 破红细胞期，镜检多为裂殖体和环状体。 • 发热期，外周血中以环状体（小滋养体）为主，也可见到裂 殖体；出汗期因原虫密度太低，镜检多为阴性。发作后数小 时（h），间歇期外周血中以大滋养体为主，形态较易辩认， 为诊断的有利时机；发作36-48h，可检出裂殖体；发作1-2次 后，配子体出现较多。 • 恶性疟较理想的取血时间是在发作后至20h内取血，初发患者 退热后常查不到原虫。 末梢血血检到恶性疟原虫配子体，是在末梢血出现环状 体之后的10天左右。
标准的疟疾厚薄血膜位置
各种不同的疟疾血片涂制法：
标准血片（1人）
门诊发热病人血片（1人）
居民普查血片（2人）
血膜的制作
血膜编号 血膜制成后，立即在玻片面上写 上受检者的号码，以防差错；待薄 血膜干后再用铅笔于薄血膜中写上 血片种类的代号和受检者的个人编 号，依次顺序ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ入标本盒内。
染液的种类
染液种类：疟原虫的染色，目前临床 上应用最广泛的是瑞氏（Wright stain） 和吉氏染液（Giemsa stain）。这些染液 中的主要染剂都包含美蓝、伊红和由美蓝 氧化所成的天青，所以称多色性染剂。
疟原虫的RDT检测 及镜检技术
丰城市疾病预防控制中心
检验科：黄曾
2014-7-15
疟疾的实验室诊断
1.病原学诊断：显微镜血涂片检查结果阳性；这种镜检确 诊最可靠。 2. 免疫学诊断：（ 1）循环抗原的检测 （ 2 ）循环抗体的 检测 3.分子生物学技术：PCR和DNA探针已应用与疟疾的诊断。 分子生物学、血清学技术发展迅猛，但是确诊疟疾 的“金标准” 仍然是病原学诊断显微镜检查疟原虫。
姬氏染液母液配置方法
取姬氏粉 0.5 克置于研钵中，加 25ml 甘油充分研磨，倒入 60 或 100ml带有玻塞的有色玻瓶中。在研钵中加少量甲醇，洗去甘油浓液混 入瓶内，至25ml甲醇洗净钵中甘油染液为止，塞紧瓶塞，充分摇匀， 置于55—60℃水浴中或温箱内24h或室温内3—5天，多加摇动，即成原 液。姬氏染液是目前较优良的血膜染剂，即使在炎热天气中，亦可经 久不变。 材料： 1、姬氏粉0.5克 2、甘油25ml 3、甲醇25ml
血膜的制作
用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将 血液涂呈薄膜状，称薄血膜；一种是血液涂 成圆盘，称厚血膜。无特殊要求的可厚薄血 膜分载玻片涂制。
发热病人血片
标本片
血膜的制作（涂片操作）
• 涂制厚、薄血膜的位置 通常将厚、薄血膜涂在一张 载玻片上。方法是将载片分为 6 等分，第 1 、 2格备贴 标签及编号用；厚血膜涂在第 3 格中央，薄血膜涂在 第4格前缘至第6格中部。作为标本的血片每张玻片涂 厚、薄血膜各1个；门诊和发热病人血片每片1人，涂 2个厚血膜1个薄血膜， 以防血膜脱落而影响检查；