人羊膜上皮细胞侧脑室移植治疗脑出血大鼠实验研究

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惠国桢
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郭礼和
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（ 1 苏州大学附属第一医院神经内科 ，
神经外科，江苏 苏州 215006 ；
中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所 ，上
海 200031 ） 摘要 目的 探讨人羊膜上皮细胞（ hAECs） 侧脑室移植对脑出血（ ICH ） 大鼠脑水肿与神经功能 分离培养 hAECs， 用 Hoechst33258 和增强绿色荧光蛋白 （ EGFP ） 标记 hAECs， 将 移植 hAECs 沿大鼠侧脑室壁生长， 细胞存活 4 w 以上。巢蛋白（ nestin） 与波形蛋 hAECs 移植到 ICH 大鼠侧脑室可存活， 表达神经元特 大鼠； A 移植
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［1 ］ 50% ， 存活患者大多留有严重残疾 。ICH 目前尚缺
乏有效的治疗手段。 干细胞移植在神经组织的修复 ［2 ］ 与再生中的作用日益引起关注 ， 大量研究表明， 细 胞移植治疗安全有效， 并能改善动物卒中后神经功 能。目前移植细胞的来源主要包括： 神经干细胞、 胚 胎干细胞、 骨髓基质细胞、 脐血干细胞等
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Department of Neurology，2 Department of Neurosurgery， First Affiliated Hospital of Soochow University，Suzhou
215006； 3 Institute of Biochemistry and Cell Biology， Shanghai Institutes for Biological Sciences， Chinese Academy of Sciences， Shanghai 200031， China Abstract Objective To explore the effect of intraventricular transplantation of human amniotic epithelial cells （ hAECs） on brain edema and neurological functional recovery of intracerebral hemorrhage （ ICH） model in rat． Methods hAECs were isolated from human term placenta and seeded for primary culture． hAECs labeled with Hoechst33258 and transfected with enhanced green fluorescent protein （ EGFP） gene using lentiviral vectors were delivered into lateral ventricle of ICH rat models． The behaviors of the animals and brain edema were observed in 28 d and the brain sections were made for morphological and immunohistochemical analyses with fluorescence microscopy． Results Transplanted hAECs could survive along the lateral wall for at least 4 weeks， some of which were stained with human specific antibody to nestin and vimentin （ vim） ． Around the injury site， activated miroglia stained with OX42 were decreased． The water content in rat brain was decreased，and the behavior test scores were improved in treatment group compared with control groups． Conclusion transplantation can reduce brain edema and improve the motor function of ICH rats． Key words Human amniotic epithelial cells； Intracerebral hemorrhage； Rat； Transplantation The hAECs can survive in the lateral ventricle of ICH rats after transplantation and express nestin and vim． hAECs
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中华神经外科疾病研究杂志 （ Chin J Neurosurg Dis Res） 2011 ； 10 （ 2 ）
文章编号：1671 － 2897 （ 2011 ） 10 － 168 － 05
· 论著 ·
人羊膜上皮细胞侧脑室移植 治 疗 脑 出 血 大 鼠实验研究
陈海云
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董万利
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薛寿儒
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。 但由于
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
中华神经外科疾病研究杂志 （ Chin J Neurosurg Dis Res） 2011 ； 10 （ 2 ）
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神经干细胞、 胚胎干细胞存在来源困难、 伦理道德争 议等问题限制了其临床应用， 因此寻找新的移植细胞 来源有着重要意义。 人羊膜上皮细胞（ human amniotic epithelial cells， hAECs） 具有多向分化潜能， 不表达端粒酶， 无致瘤 性， 低免疫原性， 来源丰富， 且无伦理道德争议， 有治 ［4 ］ 疗神经系统疾病的潜能 。 本研究旨在观察 hAECs 移植到 ICH 大鼠模型侧脑室后存活与分化情况， 以 及对神经功能恢复的影响， 进而为其在脑出血治疗中 的应用奠定基础。 材料与方法 hAECs 的制备及动物试验 一、 材料、 人 特 异 性 波 形 蛋 白 （ vimentin， vim ） 抗 体 （ sigma ） 、 人 特 异 性 巢 蛋 白 （ nestin ） 单 克 隆 抗 体 （ Chemicon ） 、小 鼠 抗 大 鼠 OX42 单 克 隆 抗 体 （ Chemicon） 。脑立体定位仪（ Narishige SR6N 型，日 185 140000 型，德国 ） 、 本） 、 荧光显微镜 （ Leica 301冰冻切片机（ Leica CM1900 ，德国） 。 hAECs 的分离、 培养和荧光标记同文献
脑出血（ intracerebral hemorrhage，ICH） 占急性脑 血管病 的 15% ～ 20% ， 急 性 期 的 病 死 率 达 30% ～
基金项目： 国家 973 创新基金资助项目（ 2005CB522604 ） Email： 作者 简 介： 陈 海 云， 硕 士 研 究 生， 电 话： 15074118499 ， laoshang3@ 126． com 通讯作者： 董万利， 教授， 硕士生导师， 电话： （ 0512 ） 67780307 ， Email： dwlsz@ 163． com
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人工计数每高倍视 显微镜下随机选取血肿周围组织， 42 染色阳性的小胶质细胞数量。 野（ × 400 ） 下 OX三、 统计学分析 所有数据以均值 ± 标准差表示， 采用 SPSS 13． 0 P ＜ 0． 05 统计软件包进行单因素方差分析和 t 检验， 认为差异有统计学意义。 结 果
一、 移植细胞 HE 染色及荧光显微镜观察 hAECs 一般簇性生长， 胞浆中含有特征性的空泡 状脂肪 滴。 细 胞 经 HE 染 色 后， 可见贴壁生长的 hAECs 呈圆形、 多角形， 核较大， 深染， 有的可达到细 胞直径的一半。 Hoechst33258 标记的 hAEC 在荧光显微镜下细胞核 呈蓝色， 胞质不显色， 分布在大鼠侧脑室内， 细胞呈圆形、 多角形， 与宿主整合良好， 无异常增生。在移植后 2 w 左 右， 标记细胞数目较多， 此后随时间的延长， 标记细胞数 细胞相互分散。焦油紫染色见 hAECs 位于侧脑 目递减， 室下区， 细胞呈圆形、 多角形， 核深染， 呈紫蓝色（ 图 1A， B） 。增强绿色荧光蛋白（ enhanced green fluorescent protein， EGFP） 转染的 hAECs 沿侧脑室壁生长， 细胞轮廓 D） 。 清晰， 荧光表达较强（ 图 1C， 二、 运动功能评分 大鼠成模后对侧肢体瘫痪， 运动功能障碍评分增 1 w 后神经功 高。1 w 内大鼠运动功能恢复较缓慢， 能迅速恢复。移植组 Menzies 评分第 3 d 起、 平衡木 行走试验第 2 d 起与假移植组相比有显著性差异 （ P ＜ 0． 05 ） （ 表 1 ， 2） ， 提示移植组运动功能恢复优于假 Menzies 评分 移植组。正常对照组无运动功能障碍， 和平衡木行走试验评分各时间点均为 0 分。 三、 大鼠脑水含量测定 3、 7 d 脑水含量明显低于假 移植组大鼠在第 2 、 移植组（ P ＜ 0． 05 ） ， 差异有统计学意义（ 表 3 ） 。 四、 免疫组织化学观察 大鼠脑组织冰冻切片免疫组织化学检测显示 ， 移 nestin 染色呈阳性 （ 图 植组大鼠侧脑室中 hAECs vim、 2A，B ） ， hAECs 移植于 ICH 脑内后大量存 由此表明， 活， 并表达神经元特异性抗原。 大鼠脑出血后第 3 d OX42 染色深， 激活的小胶质细胞增多， 细胞呈分枝 D ） 。 大鼠出血部位周围每高倍视野 （ × 状（ 图 2C ， 400 ） 下 OX42 染色阳性的小胶质细胞数量分别为正 常对照组（ 4 ± 2． 25 ） 个， 移植组 （ 23 ± 1． 34 ） 个， 假移 三组间两两比较有显著性差异 植组（ 36 ± 2． 48 ） 个， （ P ＜ 0． 05 ） 。