微生物检验实验室沙门菌属标准操作规程
SMP-QC0028微生物鉴定管理规程
SMP-QC0028微⽣物鉴定管理规程⼀、⽬的：规范菌种以及控制菌检查中疑似菌的鉴定程序，以减少菌种污染和⽣长特性的改变，确保实验室安全和实验结果可靠。
⼆、范围：适⽤于实验室所⽤标准储备菌株和控制菌检查中疑似菌的鉴定。
三、职责：品质部：确保使⽤的菌株是可靠的，准确鉴别样品中控制菌，保证实验结果可靠。
四、内容：1、试验菌株:⼤肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]⾦黄⾊葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]⽩⾊念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98001]⿊曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104]沙门菌（Salmonella）[CMCC(B)50094]2、菌种确认试验的主要内容：2.1 菌种的纯度确认。
2.1.1 试验内容。
①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同⼀平板上的单菌落的⼤⼩、形状、颜⾊、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
②镜检特征：对数⽣长期的培养物⾰兰⽒染⾊反应应呈现⼀致性；细胞形状、⼤⼩、荚膜、芽孢等特征应相似。
2.1.2 菌种的特性确认。
⽣化试验：各种微⽣物具有各⾃的独特的酶系统，因⽽在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物⼜具有不同的⽣化特征。
根据此特征，利⽤⽣物化学⽅法来鉴定不同的微⽣物的试验即为微⽣物的⽣化试验。
2.1.3 菌种的确定⽅法。
⽤⽆菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。
培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单⼀纯菌落，进⾏⾰兰⽒染⾊、镜检，观察其染⾊特性及菌形。
沙门氏菌检验详细流程图
1 mL+SC10 mL 36 ℃±1 ℃，18 h～24 h
BS
XLD（或HE、科玛嘉显色培养基）
36 ℃±1 ℃，40 h～48 h
36 ℃±1 ℃，18 h～24 h
挑取可疑菌落
TSI，赖氨酸，NA， 靛基质， 尿素 (pH 7.2)， KCN
商 品 化 生 化 H2S+靛基质- 尿素- H2S+靛基质+ 尿 H2S-靛基质-尿素 反应结果与左
为了最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用 两种以上选择性分离培养基。
进口-SS 进口-SS 国产-SS 进口-HE 国产-HE 进口-XLD 国产-XLD 进口-BS 国产-BS CHRO显色 国产-DHL 国产-WS TSA（对照）
65.3 81.0 52.0 83.2 80.0 83.0 86.2 106.6 77.7 68.4 98.4 71.6 100.0
初筛微生 物
沙门氏菌
柠檬酸杆 菌属
变形杆菌
菌落颜色
紫色(直径约 1mm)
蓝色(直径约 1mm)
无色或被抑 制
特异性 灵敏度
89％ 100%
---
---
(铜绿假单胞菌也呈紫红色， 可以通过前增菌排除。所以推 荐在检测中的前增菌用TTB。 粉红色、深红色、干燥菌落、 边缘锯齿状等 均非沙门氏菌菌 落。）
被分成2500多个血清型。
Vi抗原 O抗原 H抗原
沙门氏菌命名与书写方式
目前的命名方法规定：
肠道沙门菌肠道亚种（亚种Ⅰ）给予专用名，并采用 标本分离地址的地名。菌名的第一个字母需大写，且 亚种Ⅰ的所用菌名不能用斜体。例如：肠道沙门菌鼠 伤寒血清型应书写为Salmonella enterica subsp.enterica serotype Typhimurium，但在实际工作中，可简写为S. Typhimurium。
微生物限度检查法标准操作规程完整
范围成品、辅料、内包装袋及纯化水的检验。
责任微生物限度检验人员内容本检验操作规程依据中国药典2015年版四部《通则1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》和《通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》进行检查。
微生物计数法一、计数方法1、微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
2、计数方法本法包括平皿法、薄膜过滤法。
3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。
4、菌种及菌液的制备试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋），并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。
计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验。
菌液制备按规定培养各试验菌株。
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含%（ml/ml）聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含%（ml/ml）聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2-8℃，在验证过的贮存期内使用。
阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
培养基适用性检查按照表规定，接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置规定的条件下培养。
每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。
同时用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。
沙门氏菌检验标准操作规程
1目的P URPOSE规范888物料、产品的沙门氏菌检验操作，确保检验结果的可靠性。
2范围SCOPE适用于888物料、产品的沙门氏菌检验工作。
3责任RESPONSIBILITY微生物检验员严格执行本规程，品质部负责人监督执行。
4程序PROCEDURE定义和原理沙门氏菌广泛存在于动物的肠道和内脏，以及被粪便污染的水和土壤中，是细菌性食物中毒的主要病因。
本方法利用沙门氏菌呈辛酸酯酶阳性，而氧化酶和脂肪酶均呈阴性的特性，对物料、产品进行沙门氏菌检验。
材料和设备紫外灯：波长366nm，功率不小于6W。
放大镜：3至4倍。
毛细滴管。
LX-B35L压力蒸汽灭菌锅。
无菌的培养皿。
无菌的接种环。
培养基和试剂SCDLP液体培养基：按《化妆品卫生规范》（2007版）或使用商品培养基干粉配制。
四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：按—2010附录配制或使用商品试剂。
SS琼脂培养基（含1%蔗糖）：牛肉浸膏(或牛肉粉)，蛋白胨，乳糖，蔗糖，胆盐，柠檬酸钠，硫代硫酸钠，柠檬酸铁，煌绿，中性红，琼脂，蒸馏水1000mL。
HE琼脂培养基：按—2010附录或使用商品培养基干粉配制。
玉米油维多利亚蓝琼脂培养基：灭菌后的基础培养基冷却至50℃左右，边摇边加入玉米油乳化液。
倾注平皿，制成平板。
基础培养基及玉米油乳化液配方如下：a）基础培养基：蛋白胨5g，酵母浸粉3g，氯化钠5g，琼脂13g，水900mL，。
将各成分加入水中，加热溶解。
调节，116℃15min高压灭菌。
b）玉米油乳化液：玉米油100mL，%维多利亚蓝水溶液100mL，%琼脂溶液80mL，吐温801mL。
玉米油加维多利亚蓝水溶液混合，边振动边在沸水中加热溶化。
然后，放入分液漏斗中，弃去蓝色水部分，再将着色的脂肪用水洗1-2次。
将着色脂肪20mL加入810mL琼脂溶液中，再加1mL吐温80，116℃15min高压灭菌。
冷却后用超声波乳化。
MUCAP试剂：取MUCAP 100mg，加纤维溶解剂溶解，再加Triton X-100 ，贮存于4℃冰箱。
微生物检测系列之沙门氏菌检验技巧及详解
微生物检测系列之沙门氏菌检测过程详解及注意事项
严烨
沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，其病原沙门氏菌属肠道细 菌科，包括那些引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。它们除可感染人外，还 可感染很多动物包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。人畜感染后可呈无症状带菌 状态，也可表现为有临床症状的致死疾，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生 产力。
所以将沙门氏菌检验规定为食品致病性菌种检验中的重要项目，它的检测过程一般包括 样品前增菌、选择性增菌、选择性平板分离划线、初步生化鉴定（确定可疑菌）、生化鉴定、 血清学鉴定及血清学分型（选做）共计 7 个步骤。整个步骤完全完成至少需要 7 天时间。下 面以样品检测示例对整个检测过程进行分析梳理。
微生物-沙门氏菌
沙门氏菌Ⅲ （即亚利桑那菌） 黑色有金属光泽
乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与沙门氏菌Ⅰ、 Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同；乳糖阳性的菌株为 粉红色，中心带黑色。 乳糖阳性的菌株为黄色，中心黑色或几乎 全黑色；乳糖迟缓阳性或阴性的菌株为蓝 绿色或蓝色，中心黑色或几乎全黑色。 乳糖迟缓阳性或阴性的菌株，与沙门氏菌 Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同；乳糖阳性的菌 株为粉红色，中心黑色，但中心无黑色形 成时与大肠艾希氏菌不能区分.
培养基全黄色
制好的培 养基
斜面、 底部黄 色，并 产生H2S
对照管
斜面红色，底部黄 色，产生H2S
底面黄色，并产生CO2
食品安全检验技术（微生物部分） 沙门氏菌检验
（1）斜面碱性（红色-）底部酸性（黄色+）产气或不 产气（产气时会造成琼脂裂开）：表示仅葡萄糖发酵。 因微生物优先分解葡萄糖产酸，使培养基变黄，但因 葡萄糖含量低，于斜面产生之微量酸立即氧化而呈碱 性反应，同时培养基中的蛋白质也随之利用而产碱， 培养基底部则因氧张力较小，且微生物生长较慢，故 仍维持酸性反应。 （2）斜面酸性（黄色+）底部酸性（黄色+）产气或不 产气：表示除了葡萄糖发酵外，乳糖与（或）蔗糖也 发酵。由于乳糖与蔗糖浓度高，经继续发酵，可维持 培养基斜面与底部保持酸性反应。
10mL＋MM （或TTB）100mL
42 ℃ 18h～24h
10mL＋SC100mL
36 ℃ ± 1 ℃ 18h～24h
直接增菌法 25g＋灭菌生理盐水25mL
检样匀液25mL ＋MM （或TTB）100mL
42 ℃ 18h～24h
检样匀液25mL
＋SC100mL
36 ℃ ± 1 ℃ 18h～24h
（二）分离培养
临床微生物学检验：第五节 沙门菌属
抗原成份
2. H抗原：
▪ Vi抗原位于菌体的最表层，包围了O抗原，可阻碍 O抗原的血清学凝集试验。
▪ 破坏Vi抗原：100 ℃ 10min ▪ 含有Vi 抗原的沙门菌：
伤寒沙门菌、丙型副伤寒沙门菌、都柏林沙门菌
变异性
• S-R变异： 光滑型-粗糙型 • H-O变异： 有鞭毛-无鞭毛 • 位相变异：双相型-单相型 • V-W变异： 失去Vi抗原
橼
名
糖
氢
红
酸
盐
甲型副伤寒沙门菌 + + — — —/+ — + — —
乙型副伤寒沙门菌 + + — — +++ — + — ±
鼠伤寒沙门菌
+ + — — +++ — + — +
丙型副伤寒沙门菌 + + — — + — + — +
猪霍乱沙门菌
+ + — — +/— — + — +
伤寒沙门菌
+ + — — —/+ — + — —
去氧胆酸钠、酚红指示剂等
伤寒沙门菌菌落特征 （血平板）
伤寒沙门菌菌落特征 （SS平板）
不产H2S的沙门菌落特征：无色、 半透明、小菌落（MAC平板）
XLD平板：不发酵乳糖的沙门菌志贺菌（红色菌落）； 产生硫化氢的沙门菌（黑色菌落）； 发酵糖类产酸的大肠杆菌（黄色菌落）
微生物限度检查简易操作规程
微生物限度检查简易操作规程1.1微生物限度检查法中细菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为23～28℃，控制菌培养温度为30～35℃。
1.2 称取供试品10g，置PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml中，用匀浆仪或其它适宜方法混匀后，作为供试液。
在制备过程中，必要时可加吐温80，并适当加温，但不宜超过45℃。
1.2.1细菌计数用营养琼脂培养基，霉菌、酵母菌计数用虎红琼脂培养基。
取供试验用的稀释剂各1ml，置4个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板、培养、检查，不得长菌。
取均匀供试液，进一步稀释成1：102、1：103等适宜的稀释度。
分别取连续三级10倍稀释的供试液各1ml，置直径约90mm 的平皿中，再注入约45℃的培养基约15～20ml，混匀，待凝固后，倒置培养，每稀释度应作2～3个平皿。
1.2.2大肠埃希菌（Escherichia Coli）[CMCC (B)44 102] 取供试品10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2）,直接或处理后接种至适量（不少于100 ml）的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时，必要可延长至48小时。
取上述培养物0.2ml, 接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm 紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。
若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。
观察后沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈现本色，为靛基质阴性。
本底对照应为MUG阴性。
1.2.3大肠菌群（Coliform）取含适量（不少于10ml）的胆盐乳糖培养基管3支，分别加入1：10的供试品1ml（含供试品0.1g或0.1ml）、1:100的供试品1ml（含供试品0.01g或0.01 ml）1：1000的供试品1ml（含供试品0.001g 或0.001m l）另取1支胆盐乳糖发酵培养基管加入稀释液1ml作为阴性对照管。
沙门氏菌检验详细流程
新的血清型名称的批准必须有巴斯德研究所、德国汉 堡卫生研究所及美国CDC 3个实验室的一致同意。
精品课件
沙门氏菌检验程序
精品课件
前增菌
目的：修复损伤的细菌细胞； 方法：25 g（mL）样品＋225 mL BPW的无菌均
57个O抗原 116个H抗原 Vi抗原
被分成2500多个血清型 。
Vi抗原 O抗原 H抗原
精品课件
沙门氏菌命名与书写方式
目前的命名方法规定：
肠道沙门菌肠道亚种（亚种Ⅰ）给予专用名，并采用 标本分离地址的地名。菌名的第一个字母需大写，且 亚种Ⅰ的所用菌名不能用斜体。例如：肠道沙门菌鼠 伤寒血清型应书写为Salmonella enterica subsp.enterica serotype Typhimurium，但在实际工 作中，可简写为S. Typhimurium。
精品课件
血清学鉴定时的注意要点：
做血清凝集时，同时应用生理盐水做对照。 O血清不凝集时，可将菌株转接于琼脂量较高(如
2.5%-3%)的斜面上，再做凝集。 如果由于Vi抗原的存在而阻止了O抗原的凝集反应
时，应挑取菌苔于1mL生理盐水中做成菌悬液。煮 沸后再检查。(常见于伤寒沙门菌)。 有极少数的二相沙门菌会同时出现2相H抗原，也 有一些沙门氏菌在培养过程中H抗原会出现第1项 和第2项之间的转变，所以血清诱导实验要用新鲜 的培养物进行诱导。
GB 4789.4-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验
精品课件
沙门菌概况
沙门菌是1885年由Salmon氏等在猪霍乱流行 时，分离出的猪霍乱沙门菌，由于Salmon氏 对本属细菌的发现贡献卓越，故定名为沙门 菌属。
沙门氏菌实验标准操作程序
5、HE琼脂（HE）：称取75.7g HE琼脂溶于1000mL蒸馏水中，加热煮沸灭菌，冷却至55℃左右摇匀，倾注平板备用。
6、生化鉴定试剂盒
设备和材料
微生物实验室常规灭菌及培养设备
2、亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）：称取23g亚硒酸盐胱氨酸增菌液溶于1000mL蒸馏水中，加热煮沸灭菌，不要过度加热，定量分装备用，勿需高压灭菌。
3、四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）：称取93.5g四硫磺酸钠煌绿增菌液溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌20min,临用前按每100ML加入碘液一支和P-73 0.1%煌绿一支，混匀后分装。现配先用，不宜久留。
沙门氏菌实验标准操作程序岗位名称检验员执行人员检验员技能要求掌握实验技能监控人员检验员监控频率实验过程检验方法对照试验作业条件在无菌室内操作作业步骤1超净工作台与无菌室紫外灯照射半小时通风半小时后进入无菌室操作
沙门氏菌实验标准操作程序
岗位名称
检验员
执行人员
检验员
技能要求
掌握实验技能
监控人员
检验员
监控频率
恒温培养箱，冰箱，电炉，天平，均质器，灭菌枪头，移液枪，无菌培养皿，精密Ph试纸，接种针。
关键控制点
1、操作台的卫生；
2、操作时房间风扇的开关，超净台的风扇开微风。
3、操作过程中注意无菌操作，冲枪后连枪头带里面的液体一并打入垃圾桶，并用酒精棉球清洗移液器枪口，切勿将液体打回原试管或三角瓶中。
注意事项
无菌操作将样品转至500 mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养8 h～18h。
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微生物检验实验室沙门菌属标准操作规程
1.概述
沙门菌属是一大群寄生于人和动物肠道中的形态、培养特性、生化反应和抗原构造相似的革兰阴性杆菌，其血清型别繁多、抗原复杂的肠道病原菌，分为6个亚属、2200种以上的血清型。
伤寒沙门菌属亚属I，多价O抗血清D群，是临床上最为重要的沙门菌。
2.标本类型
粪便、血液等额标本。
3.鉴定
3.1 形态与染色：革兰阴性杆菌，菌体细长，大小为（0.7~1.5um）×（2~5um）。
有周鞭毛，无芽胞，无荚膜。
3.2 培养特性：在麦康凯琼脂平板上形成无色、透明的菌落；SS琼脂平板上呈无色、透明，但大部分菌落中央呈黑色（产H2S）；在XLD琼脂平板上也产生中央黑色的菌落（产H2S）；HE琼脂平板上菌落呈蓝绿色。
CHROMagar显色培养基上呈紫色菌落。
半固体琼脂中均匀混浊生长，无穿刺线。
3.3 生化反应：氧化酶试验阴性，TSI为K/A；发酵葡萄糖，不发酵乳糖；IMViC-+--或-+-+，H2S试验阳性或阴性，动力、赖氨酸脱羧酶和硝酸盐还原试验阳性，鸟氨酸脱羧酶、尿素酶试验阴性，氰化钾（KCN）培养基不生长。
3.4 鉴别要点：
3.4.1 本菌特征：鉴别平板上无色透胆或半透明的菌落，TSI为K/A，H2S阳性或阴性，有动力，IMViC-+--或-+-+，尿素酶试验阴性。
符合上述特性者，可通过血清凝集试验）作出诊断。
3.4.2 与志贺菌属的鉴别：少数伤寒沙门菌在TSI上H2S阴性，动力不明显，易与志贺菌属混淆，可用血清凝集反应相鉴别。
3.5 操作步骤
3.5.1 观察菌落特征，挑取可疑菌落，做TSI试验。
参见细菌鉴定标准操作构规程。
3.5.2 血清学鉴定参见沙门菌血清学检测标准操作规程。
3.5.3 鉴定从SS琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化法进行细菌鉴定。
4. 药敏
参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSI M100-S20最新版本文件。
5. 质量控制
参见质量管理程序。
6.检验结果解释与分析
沙门菌的鉴定依赖于传统或商品化系统生化反应和血清学两种方法。
若生化反应符合沙门菌，但A-F多价血清不
凝集，首先考虑是否存在表面抗原（Vi抗原），若有应将细菌制成菌悬疑，放入沸水中加热15-30分钟，冷却后再次做凝集试验。
若去除Vi抗原后仍不凝集，应考虑是否为A-F 以外的菌群，应送专业实验室进行鉴定。
7.临床意义
主要通过污染食品和水源经口感染，引起人类和动物的沙门菌病，主要有3种类型。
（1）胃肠炎：此型最为常见，引起轻型和暴发型腹泻，伴有发热、恶心和呕吐。
（2）菌血症和败血症：多发生于儿童和免疫力低下的老年人，可经血流到达组织，导致脑膜炎、心内膜炎、胆囊炎、骨髓炎等。
往往出现血培养阳性而粪便阴性。
（3）肠热症：表现为发热，血培养或肥达氏反应阳性。
8.鉴定流程
参考文献
[1] 中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL23:2008医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明.2008
编写人：AAA、BBB 操作人：本室操作人员
批准人：。