3-1核酸分离

5、将上层清液转入新的eppendorf管，加等体积的氯仿，混匀 后13000rpm离心3min，除去苯酚。
6、小心吸出上清液转入新的eppendorf管，用预冷的两倍体积 的无水乙醇沉淀，放置－20℃冰箱30min，然后13000rpm离心 15min，可见白色丝状沉淀物。 7、小心吸出液体，弃上清液，用预冷的400µ l 70％乙醇洗涤2 次，室温干燥后，用50µ lTE （含20µ g/ml的Rnase）溶解DNA， －20℃冰箱放置备用。
重新沉淀DNA，让 酒精充分挥发
增加70％乙醇洗涤 的次数（2-3次）
3.
3.
DNA提取常见问题
问题二：DNA降解
原 因
1. 2.
1.
3.
4. 5.
材料不新鲜或反复冻 融 未很好抑制内源核酸 酶的活性 提取过程操作过于剧 烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融
2.
对 策
3.
4. 5.
6.

核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用 于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂， 去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸 释放出来； 3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。
如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺 酸钠、三异丙基萘磺酸钠
pH值为8.0，可防止DNA发生酸解
DNA提取常见问题 问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。
原 因
1.
DNA中含有蛋白、 多糖、多酚类杂质 DNA在溶解前，有 酒精残留，酒精抑 制后续酶解反应 DNA中残留有金属 离子
1.
重新纯化DNA，去 除蛋白、多糖、多酚 等杂质
2.
对 策
2.
材料、设备及试剂
菌种 ：DBT降解菌 设备 ：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式 高速离心机， 涡旋振荡器 试剂：LB液体培养基 、裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸 钠,1mMEDTA,1%SDS,pH8.0）、5M NaCl 、Tris-饱和酚、氯仿、 RNA酶 、无水乙醇
操作步骤
1、1.5ml菌液（每组两管）4 ℃ 12000rpm离心30sec， 弃去上清，倒置试管于吸水纸上吸干。 2、每管加入400µ l裂解液，用移液枪枪头反复抽吸辅 助裂解，37 ℃水浴30min。 3、每管加入132µ l的5M NaCl溶液，颠倒试管，充分混 匀后，13000rpm离心15min。用粗口的枪头（用剪刀剪 去1ml枪头的尖端）小心取出上清液转倒两支新的 eppendorf管中。 4、加入等体积的饱和苯酚，充分混匀后，12000rpm离 心3min，离心后的水层如混浊则说明仍含有蛋白质， 则需将上清液转入新的试管，重复上述步骤直到水层透 明，水层和酚层之间不再白色沉淀物为止（约2次）。

核酸酶的抑制和抑制剂 DNase抑制
①加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA 或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 ②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使 DNase失活。

核酸酶的抑制和抑制剂 RNase抑制 ①操作要带手套 ②所有器皿要严格消毒 ③试剂处理 ④低温操作 ⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂
注意事项——材料准备
最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融
组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解
含病毒的液体材料DNA含量较少，提过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低
针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： • 植物材料－－液氮研磨 • 动物组织－－匀浆或液氮研磨 • 组培细胞－－蛋白酶K • 细菌－－溶菌酶破壁 • 酵母－－破壁酶或玻璃珠
1.
原 因
1. 2. 3. 4.
2.
实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 沉淀不完全
3.
对 策
4. 5. 6.
洗涤时DNA丢失
尽量选用新鲜（幼嫩）的材 料 动植物要匀浆研磨充分；G＋ 菌、酵母裂解前先用生物酶 或机械方式破壁 高温裂解时，时间适当延长 （对于动物细胞、细菌可增 加PK的用量） 低温沉淀，延长沉淀时间 加辅助物，促进沉淀 洗涤时，最好用枪头将洗涤 液吸出，勿倾倒
2. 核酸的分离纯化步骤
其关键步骤是去蛋白质，通常用酚/氯仿。 用酚、氯仿抽提：这两种有机溶剂合用，比 单独用酚抽提的除蛋白效果更佳。继而用氯仿 抽提则可除去核酸制品中的痕量酚。
操作步骤：
①核酸样品置有盖小离心管中，加入等体 积的酚/氯仿。 ②旋涡混匀管内容物，使呈乳状。 ③12000×g室温离心15秒。 ④水相移入另一离心管，弃去两相界面和 有机相。 ⑤重复步骤①－④步操作，直至两相界面 上见不到蛋白质为止。
染色体DNA分离
如要从细胞裂解液等复杂的分子混合物中纯 化核酸，则要先用某些蛋白水解酶（这些广谱 的蛋白酶包括链霉蛋白酶及蛋白酶K等，它们 对多种天然蛋白均有活性）消化大部分蛋白质 后，再用有机溶剂抽提。
3. 核酸组分的分离纯化方法
核酸用化学方法或酶方法降解可得到核碱、核 苷和核苷酸，要分离纯化：

核酸提取的一般过程
1）破碎细胞（防止核酸酶的作用） 微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。 酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。 动物：液氮处理后用匀浆器破碎。 细胞器DNA：首先纯化细胞器。
以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂
核酸提取的一般过程 2）破碎抽提核酸除去杂质 1．首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与 其它成分分离 2．使核酸与蛋白质分离 3．除去脂类 4．多糖的除去

核酸制备时应注意的事项: ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解。 ③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解。

二、核酸及其组分的分离纯化
在细胞内DNA、RNA都以核蛋白形式存在， 且二者在提取过程中常混在一起；
细胞内还有许多其它“杂质”，如蛋白质、 糖、脂质等； 核酸本身很不稳定，容易受多种因素的影 响而变性或降解。
尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材经高 温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中，避免 反复冻融
DNA提取常见问题 问题三：DNA提取量少
核酸制备的一般方法和原理

核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶 活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当 然，几个条件并用更好。 对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械 张力拉断则更重要。 对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断， 但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制 RNase更重要。
1.分离核酸的一般原则
（一）防止核酸酶的降解
细胞内凡有核酸存在的部位，几乎就有降解此酸的酶存 在。通常加入核酸酶的抑制剂或去激活剂如柠檬酸钠、 EDTA（己二胺四乙酸）来防止。 （二）防止化学因素的降解
提取过程中常常用到酸碱，注意强酸强碱的降解作用；
（三）防止物理因素的降解
高温、机械作用力等均可以破坏核酸分子的完整性。提 取过程低温、避免剧烈搅拌。
当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀， 沉淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利 于充分沉淀 沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解
• •
TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase
高温温浴时，定时轻柔振荡
注意事项——核酸分离纯化过程
采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓 冲体系 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质 的方法
注意事项——核酸沉淀、溶解
第三章 核酸分离与制备
生物大分子分离与表征 shaoyunwang@
一、分离纯化核酸的一般原则
分离纯化核酸总的原则： ①应保证核酸一级结构的完整性； ②排除其它分子的污染。 核酸纯化应达到的要求： ①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高 浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。

核酸制备中常用的蛋白质变性剂
蛋白质变性剂的作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造 成蛋白污染。 2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。
如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC

核酸制备中常用的酶 DNase RNase 蛋白酶K 溶菌酶
离子交换色谱（解离常数、带电荷性质不同）
凝胶色谱（分子量不同）
高效液相色谱
4. 核酸样品的保存
核酸保存的主要条件是温度和介质 温度： 4℃（5℃）最佳和最简单 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存 保存介质： TE缓冲溶液(最常用) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0


核酸提取的一般过程 3）核酸的纯化 根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污 染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂 等）杂质，最后得到均一的核酸样品。

核酸分离的步骤：
I.材料准备
破碎细胞 II.破碎细胞或包膜－内容物释放