酶工程论文

酶分子定向进化的研究进展及应用郭黄英材料与化工学院生物工程摘要：酶分子定向进化史模拟自然进化过程，具有适应面广、目的性强、效果显著等特点，可以在较短的时间内获得具有新的催化特性的酶突变体。

定向进化可以显著提高酶活力，增强酶的稳定性，改变酶的底物专一性等，已经成为一种快速有效的改进酶的催化特性的手段。

本文详细综述了酶分子定向进化的概念、过程、基本策略和核心技术，并列举了该技术在现实中的应用实例。

关键词：酶，定向进化，生物催化，应用酶分子定向进化（enzyme molecular directed evolution）简称为酶定向进化，是模拟自然进化过程（随即突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。

酶定向进化的基本过程包括随机突变、构建突变基因文库、定向选择等步骤酶的定向进化技术在一定程度上弥补了定点突变技术的不足，极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业、食品业、环境保护和药物开发等领域逐渐显示其生命力。

1.酶分子定向进化的研究背景酶作为催化剂，已在生产精细化学品、手性药物、食品添加剂等方面得到广泛应用。

但随着酶催化应用范围的不断扩大和研究的逐步深入，研究者发现，酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求，而且天然酶的稳定性差、活性低等缺陷使得酶催化效率很低，还缺乏有商业价值的催化功能。

因此对天然酶分子的改造显得十分重要。

1993年，美国科学家Arnold F H L3首先提出酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶的改造和构建新的非天然酶。

酶分子定向进化技术在一定程度上弥补了定点突变技术的不足，在过去几十年，定向进化已经成为作为生物催化剂的天然酶克服限制的重要工具，其对潜在的经济、环境、社会和医疗的影响是不可预计的，并且酶产品未来发展前景是无限的。

2. 酶分子定向进化的主要方法2.1 易错PCR技术易错PCR(error—prone PCR)技术是从酶的单一基因出发，在改变反应条件的情况下进行聚合酶链式反应（PCR），是扩增得到的基因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。

在进行PCR扩增目的基因时，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变，导致目的基因发生随机突变。

通过构建突变库，筛选出所需的突变体；经一次突变的基因很难获得满意的结果，由此发展出连续易错PCR，即将一次PCR扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机突变，使每一次获得的小突变累积进而产生重要的有益突变。

在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部，属于无性进化，但使用该方法易出现同型碱基转换。

易错PCR使原始蛋白质中仅有较小的序列空间发生突变，当片段超过800bp 时，其突变率会下降。

2.2 DNA重排技术DNA重排技术(DNA shufling)，又称DNA改组技术，是从正突变基因文库中分离得到的同源DNA，用酶切成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。

DNA重排技术是由Stemmer等于1994年创建的。

他们通过该技术对β-内酰胺酶进行了定向化研究，是该酶的催化效率提高了32000倍。

该技术将存在于两种或多种不同的基因中的正突变结合在一起，通过DNA碱基序列的重新排布，形成新的突变基因，属于有性生殖。

2.3 交错延伸PCR技术交错延伸PCR(staggered extension process，SEP)技术：即在同一反应体系中以两个或多个相关的DNA片段为模板进行PCR反应，把PCR反应中常规的退火和延伸合并为一步，并且大大缩短了反应时间（55℃,5s）。

在反应过程中，引物先与一个模板结合，进行延伸，随之进行多次变性和短时的退火——延伸反应循环，在每个循环中，不同长度的延伸片段在变形时与原先的模板分开，退火时与另一个模板结合，再进行延伸。

通过在不同的模板上交替延伸，所合成的DNA片段中包含有不同模板上的信息，直到获得全长的突变基因为止。

采用交错延伸PCR技术进行酶的有性进化，可以省去DNA重拍技术中DNase Ⅰ切割这一步骤，具有简便、快速的特点2.4 随机引物体外重组技术随机引物体外重组技术(random-priming in vitro recombination，RPR)是采用单链DNA为模板，配合若干条随机序列的引物进行PCR反应，产生若干个与模板不同部分的序列互补的短DNA片段，然后除去模板，这些DNA小片段互为模板和引物进行扩增，通过碱基序列的重新排布而获得全长突变基因。

RPR具有以下特点：①可用单链DNA或mRNA为模板。

对模板量要求少，减少了亲本组分的干扰；②克服了DNA shuffling中DNaseⅠ所具有的序列偏爱性，保证了子代全长基因中突变和交叉的随机性；③片段组装体系与片段合成体系缓冲系统可兼容，无需中间的纯化步骤。

2.5 过渡模板随机嵌合生长技术过渡模板随机嵌合生长技术(random chimeragenesis on transient templates，RACHITT)是基于DNA同源重组原理而实现的随机突变技术，是将随机切割的基因片段杂交到另一个相同家族的DNA临时模板上进行排序、修剪、空隙填补和连接，消化掉DNA临时模板，复制出新生的DNA链分子，从而建立高度重组的突变体文库的过程。

2.6 随机插入／删除链的交换突变技术Murakami等创建了随机插入／删除链的交换突变技术(random insertion／deletion strand exchange mutagenesis，RAISE)。

其主要步骤是：①用DNaseⅠ切割目的基因并回收100—300 bp小片段；②用末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)在小片段的3端随机添加／删除几个核苷酸；③自引物PCR重组小片段直至扩增出全长基因。

特点是简便并且可以通过控制插入或删除的核苷酸长度来调整突变程度。

利用此法对一内酰胺酶进行进化，显著提高了对头孢他啶(cefiazidime)的降解能力，其最小抑制浓度提高了5 000倍。

2.7 易错滚环扩增法技术Fujii等将DNA滚环扩增的原理应用于易错PCR技术，创建了易错滚环扩增法(error—prone rol1ing circle amplification，EP—RCA)。

其主要步骤：①随机引物六聚体(经硫代磷酸化修饰)杂交到环状DNA上，在φ29 DNA聚合酶(并加入Mn2+提高突变)的作用下多位点同时扩增延伸；②利用φ29 DNA聚合酶具有高的链置换活性的特点，以环状DNA为模板不问断扩增释放产生具有多重模板序列的DNA分子；③以线性DNA为模板继续扩增形成长短不一的线性产物，可直接用于转化，利用首尾重复序列在宿主内同源重组重新环化。

该法省去了酶切、连接等步骤，甚至不需要特定引物和PCR仪等设备(常温扩增)。

不仅简化了进化过程，也使得随机突变技术的应用变得更为普遍。

Fujii等利用EP—RCA法对pUC19质粒上的β-内酰胺酶(头孢氨苄抗性)进行改造，经一轮进化获得7个水解头孢他啶的突变体，改变了β-内酰胺酶的底物选择性，具有较高的突变率与突变谱。

2.8 复合自组装基因组工程复合自组装基因组工程(multiplex automated genome engineering，MAGE)是以整个染色体DNA为模板，在体外设计并合成一系列的小分子DNA片段，通过转化的方法不断导入细胞内，随着染色体DNA的复制来构建突变库的方法。

其主要原理：①在细胞生长对数期诱导细胞体内的β-蛋白表达(防止寡核苷酸降解)，制备细胞悬液；②针对特定代谢途径的相关基因设计一组约90 bp左右的单链小片段DNA；③通过电转化的方法把在体外合成的单链小片段DNA导入细胞中；④单链DNA可作为随机引物渗人染色体复制，造成基因的突变，细胞再生后可进行下一轮循环或筛选。

该方法的优点是效率高，既可以对细胞的整个代谢途径进行突变，也可以通过小片段DNA的设计重点突变基因组中的某些代谢途径。

3．酶分子定向进化的应用通过定向进化对酶进行改造，在研究酶的构效关系，提高酶热、酶活性、或有机溶剂的稳定性，改变底物特异性等方面得到了广泛应用。

如张建云等利用易错PCR技术对OL淀粉酶基因进行了改造，通过多轮诱变，获得的5株新菌株的酶活分别为出发菌株的5～15倍。

Nakazawa等通过易错PCR和活性筛选的方法得到β-l，4 -葡聚糖酶突变体2R4，其表达量比野生型提高了130倍， (最适条件下1 mol底物1 S内转化的酶量)提高了1.4倍，值提高2倍，并且比野生型具有更大的pH稳定性，在55℃保温30 min可保留全部活性，而野生型活性完全丧失。

Kim等对栖热菌(Thermus sp．)IM6501菌株中具有热稳定性的麦芽糖淀粉酶进行了DNA 改组，经过4轮改组和筛选，得到了具有高耐热性的麦芽糖淀粉酶。

Ness等针对同源性在56％～99％之间的26个枯草芽孢杆菌蛋白酶基因进行了改组，获得了热稳定性提高3～15倍的克隆子。

Morawski等通过DNA改组获得1株辣根过氧化物酶突变体，该突变体能耐受较高浓度的双氧水、CTAB和其他盐类。

但一般情况下通过单个定向进化技术构建的突变体库中包含的有益突变的比例较小，不利于后续的筛选和鉴定，目前已很少单独使用单一方法进行定向进化。

一般的方法是将多种技术结合起来，从而得到更好的效果。

Miyazaki等利用随机突变、饱和突变和DNA shuffling相结合的方法对Bacillus subtilis 家族的木聚糖酶进行改造，改造后的木聚糖酶半衰期失活温度及最适反应温度比野生型提高了10℃，60保温2h仍保留全部活性，而野生型在6O℃保温5min就完全失活。

Shi等通过易错PCR和DNA shuffling的结合创建突变体库，筛选到一琼脂糖酶突变体s2，s2的值提高了4.6倍，在40℃时的半衰期为350min，比野生型提高了18.4倍。

Song等利用随机突变和重组的方法筛选得到的3株磷脂酶A1突变体，其稳定性和活性都得到了较大的提高。

此外，作为定向进化的延伸，基因组改组也已成为了菌种选育的有力工具。

4．酶分子定向进化的展望酶的定向进化已经成为改进酶工程的重要方法。

它从多个角度改进酶，比如酶的稳定性、特应性、反应活性、溶解性和异源表达等，使酶的应用更加广泛。

而随着基因工程技术、蛋白质工程技术以及高通量筛选技术的迅速发展，酶的定向进化的方法也在不断完善。