_L_鼠李糖苷酶发酵过程放大研究_从5L到30L发酵罐

α-L-鼠李糖苷酶酶活力单位定义（U）： 45 ℃， pH4.5 条 件 下 每 分 钟 消 耗 1 μg 柚 皮 苷 所 需 要 的 酶量为 1 U。
2 结果与讨论
2.1 通气量放大准则
5 L 发 酵 罐 的 装 料 系 数 为 0.6， 最 佳 通 气 量
Q=1.5 L/min，最佳通气比=Q/V=0.5 VVM，
进行放大
在发酵罐中， P0 VL
∝
2Np ρn3D5 D3
其 中 P0—搅 拌 功 率 （kW）；VL—发 酵 液 体 积 （L）；Np—功 率 系 数 ；ρ—发 酵 液 密 度 （kg/m3）；n—
则 30 L 发酵罐 0～36 h 搅拌桨叶尖线速度 V=
1.88 m/s，计算可得搅拌转速 n= V =409 r/min； πD
36～120 h 搅拌桨叶尖线速度 V=1.26 m/s， 计算可
得搅拌转速 n= V =273 r/min。 πD
（2）按 单 位 体 积 发 酵 液 搅 拌 功 率 P0=VL 相 等
Key words：Aspergillus niger; α-L-rhamnosidase; fermentation amplification; stirring blade
基 金 项 目 ：科 技 部 科 技 型 中 小 企 业 技 术 创 新 基 金 （12C26213302753 ）；浙 江 省 自 然 科 学 基 金 （LY12B06010 ）
第 42 卷第 4 期
发酵科技通讯
2013 年 10 月
α-L-鼠李糖苷酶发酵过程放大研究
— ——从 5 L 到 30 L 发酵罐
张雪铭 1，马 骏 2，魏 春 3，应向贤 3，汪 钊 3 （1.浙江省天正设计工程有限公司，浙江 杭州 310012；2.浙江海正药业股份有限公司，浙江 台州 318000；
3.浙江工业大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310014）
摘 要：以产 α-L-鼠李糖苷酶（α-L-1,2-鼠李糖苷酶和 α-L-1,6-鼠李糖苷酶）的黑曲霉 Aspergillus niger WZ001 为考察对象， 研究了从 5 L 发酵罐到 30 L 发酵罐的通气量和搅拌转速的 放大工艺。 通气量按三种准则、搅拌转速按两种准则放大。 通过实验验证，优选得到最佳放大准 则为：通气量按 1.5 倍空气表观线速度进行放大、搅拌转速按搅拌桨叶尖线速度放大。 在该优化 的放大工艺条件下，30 L 发酵罐中 α-L-1,2-鼠李糖苷酶和 α-L-1,6-鼠李糖苷酶的产量分别为 2 515 U/mL 和 3 612 U/mL，达到 5 L 发酵罐的水平。 关键词：黑曲霉；α-L-鼠李糖苷酶；发酵放大；搅拌桨
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5 L 和 30 L 发酵罐培养条件：温度 30 ℃，初始 pH5.5，搅拌转速 200～600 r/min，通气量 0.1～1.5 vvm。 1.4 α-L-鼠李糖苷酶的检测方法[11]
样品预处理：将发酵液于 8 000 r/min 离心 10 min， 上清粗酶液用于测定 α-L-鼠李糖苷酶酶活 力，菌体沉淀用于测定菌丝体活力。 4 ℃下保存、 备用。
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发酵科技通讯
第 42 卷
α-L-鼠李糖苷酶 （EC3.2.1.40） 是一种水解 酶。可广泛应用于食品和药品行业中，用于橘汁脱 苦、葡萄酒风味改良、生产功能饮料、生产甜味剂 以及生产胃药和固醇类药物的前体 。 [1-3] 鉴于其广 阔的工业用途，以发酵法规模化生产 α-L-鼠李糖 苷酶具有重要意义。设计和建立规模化的 α-L-鼠 李糖苷酶发酵工厂首先需要确立规模化生产的工 艺流程，但是目前 α-L-鼠李糖苷酶发酵技术多停 留在实验室研究阶段 ， [4-6] 应用到工厂生产工艺尚 需要一个发酵放大的过程。 因此，本研究以产 αL-鼠李糖苷酶（α-L-1,2-鼠李糖苷酶和 α-L-1,6鼠 李 糖 苷 酶 ） 的 黑 曲 霉 Aspergillus niger WZ001 为研究对象，考察了从 5 L 发酵罐到 30 L 发酵罐 的过程控制工艺的放大技术。
于5 L 发酵罐的通气比：0.5 VVM
则 30 L 发 酵 罐 的 通 气 量 Q=0.5×30 ×0.6=9
L/min。
计算可得其空气表ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ线速度
μs=Q/（
π 4
D2） =
19.9 cm/min。
（2）按空气表观线速度相等进行放大
则 30 L 发酵罐的空气表观线速度应等于 5 L
发酵罐的空气表观线速度，μs=8.49 cm/min。
计算可得其通气量 Q=μs
（π 4
D2）=3.8
L/min，
通气比＝0.21 VVM
（3）按空气表观线速度 1.5 倍进行放大
在进行通气量优化时发现， 在相同的搅拌转
第4期
张 雪 铭 ，等 ：α-L-鼠 李 糖 苷 酶 发 酵 过 程 放 大 研 究
速条件下，通气量的增加对 α-L-1,2-鼠李糖苷酶
2.2 搅拌转速放大准则
由实验室小试得知， 黑曲霉细胞受搅拌剪切
的影响较明显，适宜的搅拌转速可以显著提高 α-
L-1,2-鼠李糖苷 酶 和 α-L-1,6-鼠 李 糖 苷 酶 的 产
量，而溶氧（通过不同通气量进行比较）对两种 α-
L-鼠李糖苷酶的产量影响不大，在固定转速下只
要不低于最低限度即可，即溶氧并非 α-L-鼠李糖
放大准则的研究既是发酵工厂设计过程中工 艺流程选择与论证的需要，也是发酵罐设计的重要 参考指标[7, 8]。 在发酵工艺实际的放大过程中，放大 准则的选择通常根据生物反应的具体情况决定， 采用不同的放大准则， 对机械搅拌反应器最终的 放大结果会有很大差异。 由于这种方法通常依赖 于经验， 放大时只有在细胞的代谢控制和传递过 程控制的机制没有改变的情况下才有效。 因此本 研究首先假设在 5 L 发酵罐到 30 L 发酵罐的放大 过程中， 菌体的代谢控制和传递过程控制的机制 是不变的，在现有的设备下，仅需要对通气速率和 搅拌转速两个条件进行放大[9]。 将 5 L 发酵罐中优 化得到的最佳 α-L-鼠李糖苷酶发酵工艺，按照不 同准则放大至 30 L 规模， 比较不同放大方法之间 的优劣，为规模化生产工艺流程的确立提供指导。
苷酶产量的主要限制因素。 因此在搅拌转速放大
时着重考虑搅拌剪切应力这一关键因素， 因此主
要采用搅拌桨叶尖线速度相等和单位体积发酵液
搅拌功率相等两个准则进行搅拌转速的放大。
（1）按搅拌桨叶尖线速度 相等进行放大
由 实 验 室 小 试 得 知 ，5 L 发 酵 罐 的 最 佳 搅 拌
转速控制策略为 0～36 h， 搅拌转速 n=600 r/min；
Amplification of the fermentation process for α-L-rhamnosidase — ——from 5 L to 30 L fermenter
ZHANG Xue-ming1, MA Jun2, WEI Chun3, YING Xiang-xian3, WANG Zhao3 （1.Zhejiang titan design & eneineering Co.,Ltd., Hangzhou 310012，China; 2.Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co.,Ltd., Taizhou 318000, China; 3.College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）
和 α-L-1,6-鼠李糖苷酶的产量并 没 有 明 显 的 提
高， 因此在不影响 α-L-鼠李糖苷酶产量的前提
下，只需要选择最低的通气量即可。如果按照通气
比（VVM）相等进行通气量的放大，则放大后 30 L
发酵罐的空 气 表 观 线 速 度 是 5 L 发 酵 罐 的 2.34
倍，这个值过大，不仅导致发酵过程中形成大量的
则计算可得其空气表观线速度
μs=（Q/
π 4
D2）
=8.49 cm/min
Q—通 气 量 （L/min）；μs—空 气 表 观 线 速 度 （cm/min）；D—搅 拌 桨 叶 直 径 （cm）；V—通 气 量
（L/min）
（1）按通气比（VVM）相等进行放大
30 L 发酵罐装料系数为 0.6， 其通气比应等
1 材料与方法
1.1 实验菌株 黑曲霉 Aspergillus niger WZ001[10]，保 存 于 浙
江工业大学生物与环境工程学院。 1.2 培养基
斜面培养基：察氏培养基。 摇瓶种子培养基（%）：麸皮 1，豆饼粉 4，MgSO·4 7H2O 0.5， 无水 CaCl2 0.1，（NH4）H2PO4 0.1，121 ℃灭菌 30 min。 发 酵 培 养 基 （% ）： 麸 皮 1， 豆 饼 粉 3，MgSO4· 7H2O 0.5，无水 CaCl2 0.1，（NH4）H2PO4 0.1，消泡剂 0.05，121 ℃灭菌 30 min。 1.3 培养条件
将 1.9 mL 浓 度 为 0.2%柚 皮 苷 标 准 液 与 2.0 mL pH4.5 的 醋 酸 盐 缓 冲 液 混 匀 ，45 ℃ 预 热 5 min，加入 0.1 mLα-L-鼠李糖苷酶粗酶液反应 10 min，沸水浴灭活。 用 HPLC 检测柚皮苷的剩余量 （ 液 相 色 谱 柱 Thermo ODS-2 HYPERSIL，5 μm， 250×4.6 mm， 检 测 条 件 为 甲 醇 : 水 =55:45， 流 速 1 mL/min，检测波长 283 nm，进样量 10 μL）。
Abstract：To produce α-L- rhamnosidase (α-L-1, 2 - rhamnosidase and α-L-1, 6 - rhamnosidase) Aspergillus niger WZ001 was used to investigate the amplification technology on aeration rate and agitation speed from 5 L to 30 L fermenter. Aeration rate was amplified by three kinds of standards and agitation speed was amplified by two kinds of standards. By the experiments verification, we obtained the best amplification criteria: aeration rate was amplified with 1.5 times the apparent linear speed and agitation speed was amplified with blade tip speed. Under the optimized conditions of amplification technology, the yields of α-L-1, 2-rhamnosidase and α-L-1, 6-rhamnosidase were 2515 U/mL and 3612 U/mL in 30 L fermentor, respectively, a level equal to that in 5 L fermenter.