微生物降解石油产物的生物安全性

微生物降解石油产物的生物安全性曹静欣;黄武婕;李长福;孙鹏;王金玲;王瑞俭【摘要】A strain, JH250-8, with high crude oil degradation rate was screened from petroleum-contaminated soil. To investigate the biosafety of petroleum degradation products of the strain,the effects of crude oil and oil degradation products on the growth states of Alfalfa and the luminous efficiency of photorhabdus were determined. Then their biotoxicities were used to evaluate the biosafety of oil degraded products. Results showed:1 ) The germination rate and chlorophyll content of Alfalfa were increased in the presence of oil degradation products of strainJH250-8,while the height and fresh weight were decreased;2 ) The biotoxicity of oil degradation products to photorhabdus was about quarter of crude oil;3 ) Microbial degradation products of petroleum possess lower biotoxicity,and the decrease of plant biomass might be associated with the soil compaction.%从石油污染土壤中筛选出1株高效降解石油的菌株JH250-8.为分析该菌株降解石油产物的生物安全性,考察了石油及其降解产物对紫花苜蓿生长态势及明亮发光杆菌发光效率的影响,从植物和微生物两个方面探讨石油降解产物的生物毒性,进而评价该菌株降解石油产物的生物安全性.结果表明：1)菌株JH250-8的石油降解产物可促进紫花苜蓿发芽,提高叶绿素含量,降低紫花苜蓿生物量；2)石油的微生物降解产物对明亮发光杆菌的发光抑制率约为原油的1/4,具有较低的生物毒性；3)微生物石油降解产物具有较好的生物安全性,其降低植物生物量的作用可能与土壤板结有关.【期刊名称】《北华大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(018)001【总页数】6页(P110-115)【关键词】微生物;石油降解产物;紫花苜蓿;发光杆菌;生物安全性【作者】曹静欣;黄武婕;李长福;孙鹏;王金玲;王瑞俭【作者单位】北华大学林学院林业与生态环境实验室，吉林吉林 132013; 吉林森工股份有限公司，吉林长春 130012;北华大学林学院林业与生态环境实验室，吉林吉林 132013;北华大学林学院林业与生态环境实验室，吉林吉林 132013;北华大学林学院林业与生态环境实验室，吉林吉林 132013;北华大学林学院林业与生态环境实验室，吉林吉林 132013;北华大学林学院林业与生态环境实验室，吉林吉林 132013【正文语种】中文【中图分类】X53随着人类的进步及社会的发展，石油污染所带来的危害日益严重.石油污染会导致土壤碳氮比的变化，改变土壤硬度、透气性、渗水性等，进而影响微生物群落结构及植物根系的呼吸及养分吸收[1-3].在受污染土壤的治理中，微生物修复技术因具有费用低、易于操作、效果好、对环境影响小等特点而受到广泛关注[4-6].当前，石油污染的微生物修复技术在微生物筛选方面的研究较多，也有关于其降解过程及相关基因的研究[7-10]，但能实际应用于石油污染治理实践的案例还很少.一方面是受微生物适应性及降解能力所限，另一方面要考虑微生物及其降解产物的安全性[11].目前，石油污染的安全性分析还停留在石油组分的生物毒性检测阶段，国内外关于石油微生物降解产物的生物安全性研究尚为空白.在研究方法上，目前应用较多的是通过考察植物生长态势来揭示石油对植物生长的影响[3，12-15]，该方法需要较长的分析时间，因此，对于石油的生物毒性检测需要探索快速、可靠的检测方法.明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)是目前发现最适于活体生物毒性检测的微生物[16-17]，具有快速、简便、灵敏度高等优点，已经被广泛用于水体、重金属及各种毒性物质的检测中[18-21].课题组已经从石油污染土壤中筛选出可以高效降解石油的菌株JH250-8[22]，其在应用上的安全性还有待进一步考察.本文将分别考察该菌株的石油降解产物对植物紫花苜蓿及微生物发光杆菌的生物毒性，通过对比分析，确定石油经微生物降解前后的生物毒性变化，可为石油降解微生物的实践应用提供理论依据，同时也可为石油降解产物的生物安全性评价提供参考.1.1 实验材料材料：石油降解菌株JH250-8为北华大学林学院林业与生态环境实验室筛选保存；紫花苜蓿种子购自江苏宿迁中种草业公司；明亮发光杆菌由Modern Water (美国)公司提供；原油来自内蒙古满洲里市扎莱诺尔区.试剂：MicroTox Acute Reaget(Modern Water 美国)；蛋白胨、酵母粉(OXOID 公司)、琼脂粉、牛肉膏等为生化试剂，甲醇、乙醇、二甲亚砜、二氯甲烷、丙三醇、石油醚等均为分析纯试剂.原油培养基：NH4NO3 2.0 g、K2HPO4 1.5 g、KH2PO4 3.0 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、CaCl2 0.01 g、Na2EDTA·2H2O 0.01g ，用H2O溶解并定容至1 000 mL，加入石油0.5～6.0 g/L，高压灭菌后备用.1.2 仪器超低温冰箱DW-86L388(中国青岛)、高速冷冻离心机D-37520(Thermo Fisher Scientific)、植物光照培养箱GPX-250A(中国精达)、紫外分光光度计UV2450(日本岛津)、生物毒性检测仪MicroTox Model 500M(Modern Water Technology).2.1 石油降解产物制备2.1.1 高效石油降解菌的活化与培养取菌株JH250-8菌种，在LB固体培养基上划线，于30 ℃生化培养箱内培养约12 h，至平板上长出明显单菌落；挑取分离良好的单菌落，接种到5 mL的LB液体培养基中，30 ℃，180 r/min恒温震荡培养8～10 h，至OD600约1.0；将活化的菌液接种至100 mL的LB液体培养基中，30 ℃，180 r/min扩大培养9 h，至OD600约1.0.2.1.2 石油降解将扩大培养出的菌液按照1/50的比例，接种于250 mL的原油培养基(2%)中，30 ℃，180 r/min震荡培养约72 h，至培养基出现大量黑色悬浮物，液体表面无明显漂浮油珠.2.1.3 石油降解产物的制备在降解后的培养基中加入约1/4体积的二氯甲烷，共萃取两次，合并萃取液.减压浓缩并挥干二氯甲烷，得到石油降解产物.2.2 石油降解产物对紫花苜蓿生长的影响2.2.1 土壤采集与处理种植用的土壤采自吉林市龙潭山表层腐殖土，土样风干后过80目筛(未灭菌).将2.1中制备的石油降解产物按石油降解产物质量分数5，10，20，40，60 g/kg拌入土壤中，拌匀，以石油质量分数0，5，10，20，40，60 g/kg 的土壤为对照，每组做3个平行重复.2.2.2 播种取大小均匀、健康、饱满的紫花苜蓿种子，0.05%高锰酸钾溶液浸泡1 h，弃溶液，蒸馏水冲洗3次.每盆中均匀撒播紫花苜蓿种子30粒，浅土播种(不超过0.5 cm).光照培养箱中培养，光照程序：8：00—18：00，温度25 ℃，光强2；18：00—8：00，温度为18 ℃，光强为0.每2 d浇水1次.2.2.3 紫花苜蓿出苗率测定播种7 d后，统计石油和代谢产物组的紫花苜蓿出苗数量，计算各组紫花苜蓿的出苗率.2.2.4 紫花苜蓿生物量测定播种25 d后，将紫花苜蓿苗轻轻从土壤中剥离，洗净并吸干表面水分后测量各株的植株高度及鲜重.2.2.5 紫花苜蓿叶绿素含量测定取测定生物量后的紫花苜蓿样本，每组取叶片200 mg，剪碎混匀.加2～3 mL95%乙醇研碎，再加乙醇10 mL，继续研磨至组织变白，静置3～5 min.过滤后转入25 mL容量瓶中，95%乙醇定容.以95%乙醇为空白，分别测定各样本在663 nm 和645 nm下的吸光值.叶绿素含量测定公式[23]：叶绿素含量= CT·V/1 000 W(鲜重，mg/g)，其中：CT=Ca+Cb，叶绿素a浓度Ca = 13.95·D663-6.88·D645，叶绿素b浓度Cb= 24.96·D645-7.32·D663，D665和D649分别为665 nm和649 nm下的吸光度值；W为紫花苜蓿叶片鲜重(mg)；V为乙醇提取液体积(25 mL).2.2.6 数据处理及分析统计石油和代谢产物的每个浓度组内紫花苜蓿苗的株高、鲜重、叶绿素含量，应用Excel数据处理工具分析石油及其降解产物浓度与生长态势的相关性及石油降解前后对紫花苜蓿生长影响的差异性，探讨石油降解前后对紫花苜蓿的生物毒性.2.3 石油降解产物对明亮发光杆菌的毒性2.3.1 石油降解样品处理取2.1中制备的石油降解产物，加入10倍(W/V)二氯甲烷溶解后，用30%的甲醇-水溶液稀释至终浓度为0.15 mg/mL，以同浓度石油作阳性对照组.2.3.2 仪器调试与设置急性毒性测试中需将MicroTox Model 500M生物毒性分析仪模式钮设置于“Acute”模式.实验方式选择“SOLO 81.9%Screening Test”，测试时间设置为5，10，15 min 3个测试点.2.3.3 石油降解产物的急性毒性按照仪器操作说明中“SOLO 81.9%Screening Test”步骤，分别对空白(蒸馏水，随仪器提供.实验过程中需加入溶解样品试剂)、石油及石油降解产物组的生物毒性进行测定.取明亮发光杆菌冻干粉，活化后加入待测物，混合后温育，分别于5，10，15 min时测定发光强度，以空白组发光强度为100%计算各样品的发光抑制率，作为生物毒性数据，分析石油降解前后对发光杆菌的生物毒性.3.1 微生物降解石油产物对紫花苜蓿发芽率的影响紫花苜蓿在石油及微生物降解石油产物存在条件下的发芽率结果见图1.由图1可以看出：低浓度石油及其降解产物的发芽率与空白组(浓度为0)相比有所降低，但随着浓度升高，紫花苜蓿发芽率逐渐增加，尤其是降解产物组在质量分数为20g/kg时达到最高发芽率，之后趋于平稳，而石油组随着浓度的增大发芽率增加，至60 g/kg时接近降解产物组水平，这一结果不同于时腾飞等[12]得到的结果.尽管石油对多数植物的种子萌发是不利的[24-25]，但也有植物发芽率不降反升的例子[13]，我们分析可能是各研究组选用的原油不同所致.方差分析结果表明，石油降解前后的P=0.15>0.05，故微生物降解石油产物对紫花苜蓿发芽率的影响并不显著.3.2 微生物降解石油产物对紫花苜蓿生物量的影响石油及其微生物降解产物对紫花苜蓿株高的影响见图2，对紫花苜蓿鲜重的影响见图3.原油组及降解产物组株高与浓度均呈明显负相关(相关系数分别为-0.80，-0.83)，原油与降解产物对紫花苜蓿株高影响无明显差异(P=0.68>0.05).由图2，3可知：原油及降解产物的浓度与紫花苜蓿鲜重均呈负相关(相关系数分别为-0.62，-0.69)，原油组与降解产物组间差异并不显著(P=0.16>0.05).本文中原油对紫花苜蓿生物量的影响与李方敏等[26]的报道相近，而石油降解产物组的结果与原油相近，说明微生物石油降解产物对紫花苜蓿的生物量有严重影响.我们分析可能的原因是土壤中加入了石油降解产物后，更易于板结变硬，透气、透水性差，使植物容易烂根导致生长受到影响.研究结果提示，在微生物降解石油的实践中应注意常翻土，以保持土壤透气性，防止植物烂根发生.3.3 微生物降解石油产物对紫花苜蓿叶绿素含量的影响测定生物量后的紫花苜蓿植株应用分光光度法测定叶绿素含量，结果见图4.由图4可知：在石油及其降解产物存在条件下紫花苜蓿叶绿素含量呈增加趋势(相关系数分别为0.75，0.86)，降解产物组较原油组促进效果更好(P=0.05).土壤中的石油可以增加紫花苜蓿等植物叶绿素含量[14，27]，也有导致植物叶绿素含量降低的报道[28-31]，可能与原油来源及植物特性有关.微生物降解石油产物对紫花苜蓿叶绿素含量的影响更为显著，对其他植物的作用还有待进一步研究.另外，为了控制土壤中石油含量，文中所用石油污染土壤是将石油混入无污染土壤制成，其土壤成分、微生物种群结构及石油组分等均可能与实际石油污染土壤有一定差异.因此，不同石油污染土壤经该菌株降解后的生物毒性也可能有所不同.3.4 微生物降解石油产物对明亮发光杆菌的毒性本文首次将明亮发光杆菌用于石油及其降解产物毒性检测.以蒸馏水组为空白对照，以原油组为阳性对照，应用生物毒性检测仪测定各组发光强度.空白组发光强度按100%计，计算石油及其降解产物组中明亮发光杆菌的相对发光强度及相对抑光率.实验结果表明：明亮发光杆菌在石油存在条件下其相对发光强度降至50%以下，而降解产物组发光强度降至约85%，降解组相对发光强度明显高于原油组(P=0.000 2).随着作用时间的延长，原油组及降解组相对发光强度下降(与时间相关系数分别为-0.85，-1.00)(图5)；以空白组抑光率为0，计算原油组及降解组的相对抑光率(结果见图6)，得到的结论与发光强度相似，原油能强烈抑制明亮发光杆菌，而降解产物组的抑制作用远低于原油组，说明石油降解后对发光杆菌的毒性明显降低，毒性作用与温育时间正相关；以石油毒性为100%，计算石油降解产物的相对毒性，结果如图7所示.结果表明，5～15 min内，石油降解产物的平均毒性约为原油的27%，即降解后石油毒性约降低至原来的1/4.石油降解菌株JH250-8的石油降解产物可促进紫花苜蓿发芽，提高叶绿素含量，降低紫花苜蓿生物量，该作用可能与降解产物使土壤板结有关.石油的微生物降解产物对明亮发光杆菌的毒性明显小于原油，提示其对微生物毒性较低.综上所述，JH250-8菌株降解石油产物对植物生长有一定抑制作用，对微生物毒性远低于降解前.将植物、微生物毒性分析相结合，能更客观地体现微生物石油降解产物的生物安全性.【相关文献】[1] 曹辉，郭晶，马魁堂，等.石油污染土壤治理研究进展[J].现代农业科技，2011(23)：309-310.[2] 李永霞，郑西来，马艳飞.石油污染物在土壤中的环境行为研究进展[J].安全与环境工程，2011，18(4)：43-47.[3] 李先梅，肖易，吴芸紫，等.华北油田石油污染土壤的修复植物筛选[J].环境科学与技术，2015，18(6)：14-19.[4] 汪洋，史典义，聂春雨，等.石油污染土壤的微生物修复技术[J].生物技术，2009(2)：94-96.[5] 蔺昕，李培军，台培东，等.石油污染土壤植物-微生物修复研究进展[J].生态学杂志，2006，25(1)：93-100.[6] 曾宪军，刘登魁.微生物修复受石油污染土壤的研究进展[J].湖南农业科学，2006(2)：36-39.[7] 吴业辉.海洋石油降解菌的分离鉴定及其降解酶基因的研究[D].厦门：厦门大学，2007.[8] Van Beilen J B，Marin M M，Smits T H，et al.Characterization of two alkanehydroxylase genes from the marine hydrocarbonoclastic bacterium Alcanivoraxborkumensis[J].Environ Microbiol，2004，6(3)：264-273.[9] Whyte L G，Smits T H，Labbe D，et al.Gene cloning and characterization of multiple alkane hydroxylase systems in Rhodococcus strains Q15 and NRRL 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