原代角质形成细胞的培养方法
B6—Co与B6小鼠眼睑角质形成细胞的原代无血清培养及比较研究
B6—Co与B6小鼠眼睑角质形成细胞的原代无血清培养及比较研究摘要：为进一步研究B6-Co小鼠眼睑发育缺陷机制，首次培养了小鼠眼睑角质形成细胞，并对B6-Co和B6小鼠眼睑角质形成细胞的迁移能力进行划痕实验分析，FITC-phalloidin染色比较B6-Co和B6小鼠肌动蛋白细胞骨架。
结果表明，B6-Co小鼠眼睑角质形成细胞迁移的数目和距离明显少于B6小鼠，细胞骨架异常，B6-Co小鼠眼睑闭合不全（EOB）是由小鼠眼睑角质形成细胞迁移缺陷造成的。
关键词：小鼠；眼睑闭合不全（EOB）；角质形成细胞；肌动蛋白细胞骨架；无血清培养pB6-Co小鼠（C57BL/6-Corneal opacity mouse，B6-Co）是邵义祥等[3]通过ENU诱变技术获得的一种具有角膜混浊表型的突变系小鼠，该系小鼠出生时患有眼睑闭合不全（eyelid open at birth，EOB），EOB的发生率为43.1%，后逐步发展为角膜混浊。
前期组织学研究初步证实B6-Co小鼠在眼睑发育的14～16 d 时，上下眼睑的角质形成细胞迁移障碍。
进一步研究B6-Co小鼠眼睑发育缺陷机制以为人类眼睑发育缺陷、角膜病的早期诊断和矫正治疗提供重要的细胞模型和试验研究手段及阐明眼睑发育生物学机制。
该研究通过对小鼠眼睑角质形成细胞的原代无血清培养，进而探索B6-Co小鼠眼睑角质形成细胞的迁移情况和细胞骨架形态。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试验动物B6-Co（C57BL/6-Corneal opacity mouse，B6-Co）小鼠和B6（C57BL/6，B6）小鼠由南通大学实验动物中心提供。
小鼠饲养在清洁级屏障动物房内，室内温度为（23±2）℃，湿度控制为（55±5）%，自由采食和饮水，室内照明采用12 h∶12 h明暗交替，定期更换笼具、垫料。
晚上9点将B6-Co （雄性）小鼠与B6（雌性）小鼠以1∶2的比例合笼交配，次日上午8点检栓并将雌雄小鼠分笼饲养，检测到栓的雌鼠记为孕0.5 d，并将其单独饲养。
人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定
人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定何黎顾华昆明医学院第一附属医院皮肤性病科云南[摘要]目的：探索实验条件下人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定。
方法：利用细胞工程方法进行组织分离及细胞培养：通过免疫组化方法，利用角蛋白单克隆抗体对培养的角质形成细胞进行鉴定，并利用表皮干细胞的相对特异标识分子——CK19对其进行检测分析。
结果：表皮自真皮较完整分离，电镜及免疫组化证实培养细胞为角质形成细胞，免疫组化结果显示：CK反应阳性，部分细胞CK19阳性，表明有表皮干细胞存在。
结论：体外分离、培养角质形成细胞成功，且分离得到的角质形成细胞中有表皮干细胞存在。
[关键词]：角质形成细胞表皮干细胞细胞培养角蛋白——19对于烧伤、急性创伤、某些疾病导致的皮肤缺损，尤其是大面积烧伤一直以自体皮移植作为首选方案，而自体皮肤不足是临床遇到的主要问题。
随着细胞培养技术和组织工程的出现，使许多脏器或组织体外重建成为可能。
人工皮肤的研制就是一个典型例子。
在这一技术中，种子细胞——角质形成细胞的体外培养，以及体外分离到的角质形成细胞中是否有在体外能大量增殖的表皮干细胞决定了能否成功构建人工皮肤。
为此本课题采用组织分离方法及细胞培养方法进行角质形成细胞体外分离及培养；通过免疫组化方法，利用人广谱单克隆抗体对培养细胞进行鉴定；并利用CK19对体外培养细胞中是否有表皮干细胞进行检测。
材料和方法一、材料1、取材选择6-26岁健康男性，行包皮环切术切除的包皮。
2、主要培养基及试剂(1)磷酸盐缓冲溶液（PBS和D-Hank’s液）：（2）培养基：K-SFM（Gibco公司），编号：37010，内含2.5ug表皮细胞生长因子（EGF）和25mg小牛垂体(BPE)：（3）分离酶：dispase（4）胰蛋白酶；（5）抗人广谱角蛋白单克隆抗体；（6）CK19单克隆抗体；（7）SP 超敏免疫组化试剂盒。
二、方法1、取材将包皮环切术切除的健康包皮组织放入50ml离心管中（内装10mlDMEM培养基，含青、链酶素及硫酸庆大酶素）。
角质形成细胞原代培养
角质形成细胞原代培养1、用含1倍双抗的KSFM 培养基取儿童包皮（一般标本可保留1天）2、取出组织，放置于含有5倍双抗的PBS液中1h。
3、再将组织取出，用组织镊将组织拉伸展平，用无双抗的PBS冲洗三次。
然后用组织镊轻轻提起皮下组织（颜色为白色的组织），用组织剪剪除皮下组织（注意尽量去除皮下组织，操作过程中要不断用PBS冲洗组织，保持标本湿润）。
然后将剩余组织（颜色为灰色组织，含少许未清除干净的皮下组织）剪成宽一厘米的长条，长度不限。
然后置于用hanks液配制的0.2%的中性酶中浸泡18-20h（注意时间不要过长，否则会影响细胞贴壁）。
4、18-20h后取出组织置于培养皿上，两手各持一把组织镊轻轻将上皮与皮下组织分离（即将灰色组织轻轻撕脱于白色组织，保留灰色组织）。
将分离后的上皮组织用眼科剪剪成1mm*1mm的碎片（注意尽量剪碎）。
置于15ml的离心管中，加入2ml含EDTA的胰酶后置于温箱孵育10分钟（每隔2-3分钟用力震荡离心管，使组织充分消化）。
再用含10%FBS的DMEM 培养基终止胰酶。
用滤器将离心管中液体过滤到新的15ml离心管中，离心1000rpm，5min，去除上清，加5mlPBS清洗沉淀后再离心5min，去除上清，加入4ml含EGF,BPG 的KSFM。
置于温箱孵育24小时后再用加了EGF，BPG的KSFM培养，3-4天换液。
(注意第一次换液后不要频繁镜下观察细胞，最好换液后三天再观察，有利于细胞贴壁及生长)。
一般第一代细胞生长10天即可传第二代。
角质形成细胞的传代去除原培养基，用PBS清洗两遍后，加入0.25%胰酶2ml，温箱孵育10min，用含血清的DMEM培养基终止胰酶消化。
1000rpm，5min 离心，去除上清，用3ml含EGF及BPG的KSFM培养基悬浮细胞，各吸1ml种入培养瓶，补足4ml培养基，温箱孵育。
3-4天换液，一般7天可传第三代。
继续培养，待镜下观察细胞生长状态良好，培养瓶覆盖率达70%---80%即可种板进行相关实验。
原代细胞培养之--培养技术原代细胞的培养方法原代细胞的培养也叫
原代细胞培养之--培养技术原代细胞的培养方法原代细胞的培养也叫初代培养是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步，是一项基本技术。
原代细胞因刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，也最接近和反映体内生长特性，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。
原代细胞往往有多种细胞组成，比较混杂，即使从形态上为同一类型（上皮样或成纤维样），但细胞间仍有很大差异。
如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差异也照样存在，原代细胞生物特性尚不稳定，如需做较为严格的对比性实验研究，还需进行短期传代培养。
1、组织块培养法组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故原先被称为组织培养。
其方法：为将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长，方法简便，利于培养，部分种类的组织细胞在小块贴壁24小时后细胞就从组织块四周游出，然后逐渐延伸，长成肉眼可以观察到的生长晕，5~7天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去，由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片，可在显微镜下观察形态和用于实验研究。
其培养方法如下：(1)按照前述方法取材，将组织剪成或切成1mm3大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。
(2)将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距0.2 cm~0.5cm，一般在25mL培养瓶(底面积为17.5cm2)可接种20～30小块为宜,小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。
(3)培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。
开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。
原代角质形成细胞的培养方法
角质形成细胞的原代培养方法作者：acne 译来源：丁香园时间：2007-3-3实验仪器大全实验试剂大全细胞培养（Cell Culture）专题：/special/experiment/cellculture.htm人角质形成细胞培养方法A. 从新生儿包皮分离出表皮角质形成细胞1. 在包皮环切术中，包皮放置于含有庆大霉素（Cat.No.15710）（浓度为5ug/ml）的Dk-SFMZ中。
包皮可保存于2～8°C直到需要使用时。
（注意：人类包皮可以保存于此种物质中2～8°C约5天而不会明显失去细胞活性。
）2. 包皮放置于含有庆大霉素（浓度为20ug/ml）的DPBS（不含Ca2+ or Mg2+）（Cat.No.14190）冲洗液中约1小时。
包皮剪成2～4块并转移到酪蛋白溶解的25.0单位/ml的dispase（Cat.No.17105）DPBS溶液中（添加5ug/ml的庆大霉素），在2～8°C条件下孵育18小时。
3. dispase孵育后，人角质形成细胞的表皮层从真皮层分离下来，转移到加有5～10ml0.05%胰蛋白酶-0.53m M EDTA（Cat.No.25300）的60mm有盖培养皿中。
在36°C±2°C条件下孵育大约15分钟，在这个过程中，每2～3分钟使用2ml的移液管吹打以帮助细胞解离。
4. 孵育以后，胰蛋白酶活性使用10ml大豆胰蛋白酶抑制剂（Cat.No.17075）终止，大豆胰酶抑制剂终浓度为10mg/ml使用DPBS（不含Ca2+ or Mg2+）配置，并在使用前无菌过滤。
细胞悬液转移到15ml无菌离心管，在室温下40g离心5分钟。
细胞重新制成悬液并按上述方法再次离心。
5. 角质形成细胞使用5ml完全培养基轻柔的吹打成悬液，并使用血细胞计数器计算角质形成细胞浓度。
原代细胞大约3×106放入75cm2组织培养瓶中，并加入15ml完全培养基。
原代细胞的培养与鉴定方法
1、大鼠骨髓来源肥大细胞原代培养并鉴定：脱颈法处死SD大鼠（体重约200g），75%酒精浸泡消毒3min。
转入超净工作台内操作，剪开后肢皮肤，去除腿部肌肉，暴露出股骨，尽可能将股骨外部肌肉剥离干净，剪下股骨。
剪去股骨两端的股骨头，使用5ml注射器吸取RPMI 1640基础培养基后将骨髓吹打出来，吹打过程中尽可能将骨髓冲洗干净。
使用巴氏吸管将骨髓吹打成单细胞悬液，1000rmp/min离心5min收集细胞如发现收集的细胞中有大量红细胞时需使用红细胞裂解液处理。
使用肥大细胞专用培养基重悬细胞，接种至T25瓶内培养。
培养过程中每2-3天换液一次，当发现有细胞变圆脱落时，收集脱落细胞至新的T25瓶内诱导培养，培养四周时肥大细胞诱导成熟，取成熟的肥大细胞进行甲苯胺蓝染色鉴定；取脱落细胞培养一周、二周、三周、四周的细胞培养上清进行组胺含量检测。
2、小鼠骨髓来源肥大细胞原代培养与鉴定：小鼠经脱颈椎处死，75%酒精消毒后，取完整股骨，用1mL注射器吸取无菌PBS从股骨一端刺入，将骨髓细胞洗出，直到骨髓腔变白。
离心收集细胞，加入3mL红细胞裂解液，室温裂解3min之后，用PBS漂洗2次。
采用现配的原代细胞培养工作液（含青、链霉素各1000U/mL，10% FBS，IL-3 10 ng/mL，SCF 10ng/mL的RPMI-1640培养基培养液）将细胞重悬，按照106个/mL接种于六孔板中，每孔加3mL培养液，置于37℃，5% CO2的培养箱中培养，每7d 将悬浮细胞按照106个/mL转移到新的培养板中，继续培养，4-6周细胞分化成熟。
四周后收集悬浮细胞，部分细胞用于流式检测纯度，部分用含10% FBS的RPMI-1640培养基重新接板。
纯度检测：向诱导分化细胞中按1：200加入肥大细胞表面标志物APC-CD117 ，FITC- FcεRIα，4℃孵育60min ，无菌PBS 漂洗3次，流式检测肥大细胞纯度。
（SCF：Stem cell factor，干细胞因子；又称肥大细胞生长因子MGF）3、大鼠腹腔肥大细胞的分离与培养：选用体重220-250g的SD大鼠。
皮肤组织块培养获取原代细胞的实验观察
皮肤组织块培养获取原代细胞的实验观察目的：从皮肤组织块培养获取原代细胞。
方法：将皮肤组织块修剪成2mmX 2mm大小，放置到培养皿中，真皮层向下，观察细胞爬出的情况。
结果：组织块培养第3天，有角质形成细胞从组织块爬出，第7天左右组织块周围出现黑素细胞，随着培养时间的延长，组织块周围出现大量成纤维细胞。
结论：在组织块培养过程中，早期可以收集较纯的角质形成细胞，含血清的DMEM培养20d后，可以得到大量成纤维细胞。
标签：组织块培养；原代细胞；前体细胞皮肤原代细胞的获得与培养对于基础和临床研究有着重要的意义。
然而，通过中性蛋白酶和胰酶消化将表皮细胞游离，然后进行细胞的贴壁培养，继而经差别胰酶消化将细胞纯化，得到的角质形成细胞容易受到成纤维细胞的污染。
在本实验中，通过皮肤组织块的培养方法，通过不同细胞从组织块爬出的时间不同，探索获得原代细胞的方法。
1 材料和方法1.1 材料1.1.1 包皮：包皮环切术中的包皮组织（提供者为18岁健康男性）1.1.2 试剂：中性蛋白酶（sigma），0.05%及0.25%的胰酶/0.53mmol/LEDTA （吉诺牛物公司），人黑素细胞培养基（Medium 254）及黑素细胞牛长添加成分（human melanocyte growth supplement，HMGS）（包含5μg/ml胰岛素，50μg/ml 维生素C，6mmol/LL一谷氨酰胺，0. 20mmol/L氯化钙等），人表皮细胞无血清培养基，角质形成细胞牛长添加成分（humankeratinocytegrowthsupplement，HKGS）（0. 18μg/ml氢化可的松、0.20ng/ml EGF、5μg/ml转铁蛋白、5μg/ml胰岛素和8μg、ml霍乱毒素）（美国Invitrogen公司），胎牛血清（四季青）（浙江天航牛物科技有限公司），兔抗人Vimentin单克隆抗体（福州迈新牛物科技有限公司），GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒（上海基因科技有限公司）。
皮肤角质形成细胞的原代培养
角质形成细胞原代培养的准备工作补充培养基的配制：（1）将0.5ml浓度为0.06M的CaCl2加入到500ml基础培养基中，则培养基中CaCl2浓度为0.06mM；（2）将5mlHKGS（人的角质形成细胞生长添加剂）加入到基础培养基中。
（3）向其中加入50ul 双抗（100x），使培养基中双抗比例为1%。
胶原涂层培养瓶：（1）在超净台无菌操作下，向培养面积为25cm2的细胞培养瓶中先加入1.7ml稀释液，再向其中加入17ul胶原（培养面积为75cm2的培养瓶先加5ml稀释液，再加50ul胶原）；（2）来回剧烈摇晃使胶原蛋白均匀分布于培养瓶表面，拧紧瓶盖在室温下孵育30min；（3）从培养瓶中吸取出多余的胶原或稀释液；涂层后的培养瓶可立即使用，或者短时间内放置于2°C-8°C备用。
消化液：0.025%胰酶+0.01%EDTA可用(0.25%胰酶+0.1%EDTA)稀释十倍得到其中的百分比表示质量体积比，即0.25%胰酶表示0.25g胰酶溶于100mlPBS溶液；0.1%EDTA表示0.1gEDTA溶于100mlPBS溶液。
终止消化液：含10%血清的DMEM或含10%血清的PBS溶液冻存比例：80%含细胞的培养基+10%血清+ 10%含DMSO的冻存液皮肤角质形成细胞的原代培养复苏（1）将装有皮肤角质形成细胞的冻存管从液氮中取出，迅速置于37°C温水中来回摇动（将冻存管下半部分浸入温水中），使其在2min内完全融化。
（2）用1ml移液枪将冻存管内已融化液体全部转移至15ml离心管中，再向冻存管中加入1ml已配置好的补充培养基，用移液枪反复冲洗后也转移至离心管内。
（3）进行1500r，5min离心;弃上清，加入补充培养基后，再次离心，反复两次；离心后可观察到离心管底部的细胞团。
（4）向离心管中加入1ml补充培养基，用移液枪反复吹打使细胞重悬，分散均匀；从离心管中吸取20ul细胞悬液用20ul台盼蓝稀释，用细胞计数器测定1ml培养基中的活细胞数；用配置好的补充培养基稀释离心管中细胞数为1.25×104/ml，向培养面积为25 cm2的已被胶原涂层细胞培养瓶里加入5ml细胞悬液。
角质形成细胞
• 角质形成细胞异常分化，导致皮肤屏障功能受损 • 角质形成细胞产生炎症因子，引起炎症反应
角质形成细胞与皮肤肿瘤
皮肤鳞状细胞癌
• 角质形成细胞异常增殖，形成肿瘤 • 角质形成细胞失去分化能力，导致皮肤屏障功能受损
基底细胞癌
• 角质形成细胞异常增殖，形成肿瘤 • 角质形成细胞失去分化能力，导致皮肤屏障功能受损
角质形成细胞与皮肤老化关系 的研究
• 皮肤老化 • 角质形成细胞增殖能力受损，影响皮肤再生 • 角质形成细胞分化异常，导致皮肤屏障功能受损 • 研究角质形成细胞与皮肤老化的关系，为抗衰老提供理论依据
角质形成细胞在皮肤再生与修复中的作用
皮肤再生
• 角质形成细胞具有自我更新能力，维持皮肤健康 • 研究角质形成细胞在皮肤再生中的作用，为皮肤损伤修复提供理论依据
05
角质形成细胞的研究进展与应用
角质形成细胞与皮肤屏障功能的研究
皮肤屏障功能
• 角质形成细胞形成皮肤屏障，防止水分丢失和外界物质 侵入 • 研究角质形成细胞与皮肤屏障功能的关系，为皮肤护理 提供理论依据
皮肤保湿
• 角质形成细胞具有保湿作用，维持皮肤水分平衡 • 研究角质形成细胞与皮肤保湿的关系，为皮肤护理提供 理论依据
皮肤修复
• 角质形成细胞参与皮肤免疫，调节炎症反应 • 研究角质形成细胞在皮肤修复中的作用，为皮肤损伤修复提供理论依据
06
角质形成细胞研究的未来展望
角质形成细胞与究角质形成细胞的功能和调控机制 • 为精准医学提供理论依据，实现个体化治疗
疾病模型
• 利用角质形成细胞疾病模型，研究皮肤疾病的发病机制和治疗方法 • 为精准医学提供理论依据，实现个体化治疗
• 利用动物模型，研究角质形成细胞的生物学特性 • 适用于疾病模型和药物筛选
原代角质形成细胞的分离培养方法
原代角质形成细胞的分离培养方法原代细胞在相关细胞实验使用过程中越来越多，人们不再单单趋于使用细胞系进行实验研究，因为细胞系常常由于体外长期培养，而容易丢失原有的生物学特性，对药物处理的反应差距越来越大。
原代细胞刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，也最接近和反应体内生长特性，原代细胞的活力和生长状态都比较好，细胞的纯度和基因保留可达到90%以上，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等试验研究，使用原代细胞进行实验，可以获得更准确的研究和数据。
为了更好的服务于广大科研工作者，赛百慷技术人员特提供了角质形成细胞分离的常用方法，技术因人而异仅供参考：角质形成细胞是一种不断分化的复层鳞状上皮细胞，其分化的最终阶是形成角蛋白。
根据角质形成细胞的发展阶段和特点，从内向外可将其分为五层。
基底细胞层又称生发层，棘细胞层，颗粒层，透明层，角质层。
角质形成细胞的分化成熟表现为从基底层到向角质层的逐渐移行。
在单一移行过程中，角质形成;细胞的形状和功能也逐渐发生着变化，从单层柱状上皮的基底层到扁平的细胞核消失的角质层。
新生的基底细胞进入棘细胞层，然后上移到颗粒层的最上层。
细胞组织来源于实验动物的正常皮肤组织，细胞生长状态为贴壁培养。
需要的实验试剂：1.培养基1：iCell原代角质细胞培养体系4.基础培养基：DMEM/F125.缓冲液：无菌不含Ca2+和Mg2+的1×PBS+1×P/S，pH=7.46.消化液1：1.2U/ml的dispase Ⅱ7.消化液2：0.25%胰蛋白酶+0.02mM EDTA8.消化液3：0.1%Ⅰ型胶原酶9.75%医用酒精10.胎牛血清（FBS）实验器械：1.培养皿2.T-25细胞培养瓶3.100目不锈钢网筛4.200目不锈钢网筛5.眼科剪6.眼科镊7.离心管（15ml、50ml）实验步骤：1.新鲜的包皮组织，装盛于含有无菌生理盐水或1×PBS的无菌容器中，于保温盒中，冰上放置离体6h内运输到实验室进行后续分离。
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角质形成细胞的原代培养方法
作者：acne 译来源：丁香园时间：2007-3-3
实验仪器大全实验试剂大全
细胞培养（Cell Culture）专题：
/special/experiment/cellculture.htm
人角质形成细胞培养方法
A. 从新生儿包皮分离出表皮角质形成细胞
1. 在包皮环切术中，包皮放置于含有庆大霉素（Cat.No.15710）（浓度为5ug/ml）的
Dk-SFMZ中。
包皮可保存于2～8°C直到需要使用时。
（注意：人类包皮可以保存于此种物质中2～8°C约5天而不会明显失去细胞活性。
）
2. 包皮放置于含有庆大霉素（浓度为20ug/ml）的DPBS（不含Ca2+ or Mg2+）
（Cat.No.14190）冲洗液中约1小时。
包皮剪成2～4块并转移到酪蛋白溶解的25.0单位/ml的dispase（Cat.No.17105）DPBS溶液中（添加5ug/ml的庆大霉素），在2～8°C条件下孵育18小时。
3. dispase孵育后，人角质形成细胞的表皮层从真皮层分离下来，转移到加有5～
10ml0.05%胰蛋白酶-0.53m M EDTA（Cat.No.25300）的60mm有盖培养皿中。
在36°C±2°C条件下孵育大约15分钟，在这个过程中，每2～3分钟使用2ml的移液管吹打以帮助细胞解离。
4. 孵育以后，胰蛋白酶活性使用10ml大豆胰蛋白酶抑制剂（Cat.No.17075）终止，大豆胰酶抑制剂终浓度为10mg/ml使用DPBS（不含Ca2+ or Mg2+）配置，并在使用前无菌过滤。
细胞悬液转移到15ml无菌离心管，在室温下40g离心5分钟。
细胞重新制成悬液并按上述方法再次离心。
5. 角质形成细胞使用5ml完全培养基轻柔的吹打成悬液，并使用血细胞计数器计算角质形成细胞浓度。
原代细胞大约3×106放入75cm2组织培养瓶中，并加入15ml完全培养基。
细胞培养：松弛的瓶盖，36°C ± 2°C，5% CO2的潮湿空气中。
6. 角质形成细胞培养液约每2～3天更换一次。
7. 由于原代角质形成细胞在供者之间生长特性的差异性，原代培养可能需要6～10天才能达到60%～75%的融合。
B. 人表皮角质形成细胞的传代
1. 达到60%～75%的融合后，移去培养基，单层细胞使用10ml 1：5000乙二胺四乙酸（Versene）冲洗。
1～2ml0.05%胰蛋白酶-0.53m M EDTA加入培养瓶中在36°C ± 2°C孵育5-10分钟。
当细胞开始变圆时，移除胰蛋白酶，在36°C ± 2°C再次孵育。
2. 当大约90%细胞分离时，使用10ml大豆胰蛋白酶抑制剂终止胰蛋白酶活性。
细胞悬液转移到15ml无菌离心管，在室温下40g离心5分钟。
细胞重新制成悬液并按上述方法再次离心。
3. 角质形成细胞使用3～5ml完全培养基轻柔的吹打成悬液，细胞大约1～3×106放入
75cm2组织培养瓶中，并加入15ml完全培养基。
4. 细胞培养：36°C ± 2°C，5% CO2的空气中。
角质形成细胞培养液约每2～3天更换一次，当达到60%～75%融合后，即可进行传代。