皮肤角质形成细胞的原代培养
角质形成细胞原代培养的准备工作
补充培养基的配制：
（1） 将0.5ml浓度为0.06M的CaCl2加入到500ml基础培养基中，则培养基中CaCl2浓度为0.06mM；
（2） 将5mlHKGS（人的角质形成细胞生长添加剂）加入到基础培养基中。
（3） 向其中加入50ul 双抗（100x），使培养基中双抗比例为1%。
胶原涂层培养瓶：
（1） 在超净台无菌操作下，向培养面积为25cm2的细胞培养瓶中先加入1.7ml稀释液，再向其中加入17ul胶原（培养面积为75cm2的培养瓶先加5ml稀释液，再加50ul胶原）；
（2） 来回剧烈摇晃使胶原蛋白均匀分布于培养瓶表面，拧紧瓶盖在室温下孵育30min；
（3） 从培养瓶中吸取出多余的胶原或稀释液；涂层后的培养瓶可立即使用，或者短时间内放置于2°C-8°C备用。
消化液：0.025%胰酶+0.01%EDTA
可用(0.25%胰酶+0.1%EDTA)稀释十倍得到
其中的百分比表示质量体积比，即0.25%胰酶表示0.25g胰酶溶于100mlPBS溶液；0.1%EDTA表示0.1gEDTA溶于100mlPBS溶液。
终止消化液：含10%血清的DMEM或含10%血清的PBS溶液
冻存比例：80%含细胞的培养基+10%血清+ 10%含DMSO的冻存液
皮肤角质形成细胞的原代培养
复苏
（1） 将装有皮肤角质形成细胞的冻存管从液氮中取出，迅速置于37°C温水中来回摇动（将冻存管下半部分浸入温水中），使其在2min内完全融化。
（2） 用1ml移液枪将冻存管内已融化液体全部转移至15ml离心管中，再向冻存管中加入1ml已配置好的补充培养基，用移液枪反复冲洗后也转移至离心管内。
（3） 进行1500r，5min离心;弃上清，加入补充培养基后，再次离心，反复两次；离心后可观察到离心管底部的细胞团。
（4） 向离心管中加入1ml补充培养基，用移液枪反复吹打使细胞重悬，分散均匀；从离心管中吸取20ul细胞悬液用20ul台盼蓝稀释，用细胞计数器测定1ml培养基中的活细胞数；用配置好的补充培养基稀释离心管中细胞数为1.25×104/ml，向培养面积为25 cm2 的已被胶原涂层细胞培养瓶里加入5ml细胞悬液。
（5） 轻轻摇动细胞培养瓶使细胞均匀分散开；放置于37°C,5%CO2的细胞培养箱里培养，24h勿动，待细胞贴壁后可换液。
换液
刚复苏的细胞可在24h-36h后换液；随之在48h后换液；之后每隔一天换一次液，直至细胞覆盖培养瓶表面50%；一旦细胞覆盖培养瓶表面达到50%，则保持每天换液直至细胞覆盖培养瓶表面达到80%。
传代
（1） 当细胞覆盖培养瓶表面达80%时，弃除培养瓶中的培养基。
（2） 向培养瓶中加入1ml消化液（0.025%胰酶+0.01%EDTA），用1ml移液枪吹打洗一遍之后吸出弃除，再向培养瓶中加入1ml消化液（0.025%胰酶+0.01%EDTA），摇匀使培养瓶表面被覆盖。室温下孵育并在显微镜下观察，直至观察到细胞变圆，大概4-5min，轻轻摇晃培养瓶把贴壁的细胞全部消化下来。
（3） 向培养瓶中加入1ml胰酶抑制剂（含10%血清的DMEM或PBS），然后把被消化下来的细胞转移到15ml离心管中。
（4） 再向培养瓶中加1ml胰酶抑制剂（含10%血清的DMEM或PBS），用移液器进行冲洗，将含有细胞的溶液也转移至15ml离心管中。
（5） 进行1500r，5min离心，可观察到离心管底部的细胞团，弃上清后用PBS洗两遍，离心，弃除上清。
（6） 加入1ml培养基后重悬细胞，用1ml的移液器反复吹打使细胞浓度均匀。
（7） 从离心管中吸取20ul细胞悬液用20ul台盼蓝稀释，用细胞计数仪测定1ml培养基中的细胞数；计算好之后用补充培养基稀释细胞悬液，以细胞数为1.25×104/ml个进行传代。
（8） 轻轻摇动细胞培养瓶使细胞均匀分散开；放置于37°C,5%CO2的细胞培养箱里进行培养。 冻存
（1） 当细胞覆盖培养瓶表面达80%时，弃除培养瓶中的培养基。
（2） 向培养瓶中加入1ml消化液（0.025%胰酶+0.01%EDTA），用1ml移液枪吹打洗一遍之后吸出弃除，再向培养瓶中加入1ml消化液（0.025%胰酶+0.01%EDTA），摇匀使培养瓶表面被覆盖。室温下孵育并在显微镜下观察，直至观察到细胞变圆，大概4-5min，轻轻摇晃培养瓶把贴壁的细胞全部消化下来。
（3） 向培养瓶中加入1ml胰酶抑制剂（含10%血清的DMEM或PBS），然后把被消化下来的细胞转移到15ml离心管中。
（4） 再向培养瓶中加1ml胰酶抑制剂（含10%血清的DMEM或PBS），用移液器进行冲洗，将含有细胞的溶液也转移至15ml离心管中。
（5） 进行1500r，5min离心，可观察到离心管底部的细胞团，弃上清后用PBS洗两遍，离心，弃除上清。
（6） 加入1ml培养基后重悬细胞，用1ml的移液器反复吹打使细胞浓度均匀。
（7） 从离心管中吸取20ul细胞悬液用20ul台盼蓝稀释，用细胞计数仪测定，并计算出离心管中的全部细胞数；
（8） 重悬后弃除适量细胞悬液，使离心管中留有800ul细胞悬液；再向其中加入100ul血清和100ul含10%DMSO的冻存液后重悬并全部用1ml移液枪转移到冻存管中，做好标记。
（9） 将冻存管先悬于液氮表面过夜后放置于液氮中进行保存 。
原代细胞培养过程
原代细胞培养过程
细胞是生命的基本单位，是构成生物体的基本组成部分。细胞的研究对于生命科学的发展具有重要的意义。原代细胞是从组织或器官中分离出来的未经过传代的细胞，具有较高的生物学活性和生物学特性，是细胞学、生物学、医学等领域的重要研究对象。原代细胞培养是将原代细胞在体外培养的过程，是细胞学研究的重要手段之一。
原代细胞培养的目的
原代细胞培养的主要目的是为了研究细胞的生物学特性、生长和分化规律、细胞信号传导、细胞凋亡、细胞周期等方面的问题。同时，原代细胞培养还可以用于药物筛选、毒性测试、细胞治疗等方面的研究。
原代细胞培养的步骤
原代细胞培养的步骤主要包括细胞分离、细胞培养、细胞传代等。
1. 细胞分离
细胞分离是将组织或器官中的细胞分离出来的过程。常用的细胞分离方法有机械分离、酶消化、胶原酶消化等。其中，酶消化是最常用的方法之一。酶消化可以使细胞间的胶原纤维、基质等物质被消化，从而使细胞分离出来。酶消化的时间和酶的浓度需要根据不同的组织和细胞类型进行调整。
2. 细胞培养
细胞培养是将分离出来的细胞在体外培养的过程。细胞培养需要提供适宜的培养基、培养条件和培养器具。培养基是细胞培养的基础，包括营养物质、生长因子、激素等。培养条件包括温度、湿度、氧气浓度、CO2浓度等。培养器具包括培养皿、培养瓶、细胞培养箱等。
3. 细胞传代
细胞传代是将原代细胞在体外培养的过程中，将细胞分离并继续培养的过程。细胞传代的次数越多，细胞的生物学特性和生物学活性就越低。因此，在进行原代细胞培养时，需要根据实验的需要和细胞的特性来确定细胞传代的次数。
原代细胞培养的注意事项
1. 细胞分离时需要注意细胞的完整性和活性，避免对细胞造成损伤。
2. 细胞培养时需要注意培养基的配制和培养条件的控制，避免对细胞造成不良影响。
3. 细胞传代时需要注意细胞的生长状态和细胞的传代次数，避免对细胞造成不可逆的影响。
4. 细胞培养过程中需要注意细胞的无菌性和培养器具的消毒，避免细胞被细菌、真菌等微生物污染。
原代细胞培养与分离
原代细胞的培养与建系
凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。细胞的纯化或细胞克隆技术是细胞培养工作的基础。
第一节原代细胞的取材
人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。
一、取材的基本要求
.1．取材要注意新鲜和保鲜
.2．应严格无菌
.3．防止机械损伤
.4．去除无用组织和避免干燥
.5．应注意组织类型、分化程度、年龄等
.6．作好记录
二、各类组织的取材技术
皮肤和粘膜的取材
内脏和实体瘤的取材
血液细胞的取材
骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材
动物组织取材
人胚体组织取材
鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材
皮肤和粘膜的取材
.主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4平方厘米。
内脏和实体瘤的取材
.内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。
血液细胞的取材
.血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。
骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材
.严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。
动物组织取材
.1、鼠胚组织取材
.首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。
氢化可的松在细胞共培养体系中对黑素合成的影响
氢化可的松在细胞共培养体系中对黑素合成的影响
目的 研究氢化可的松对人表皮共培养体系（黑素细胞与角质形成细胞）酪氨酸酶活性及黑素生成的影响。 方法 培养人表皮黑素细胞和人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体系，利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)还原法测定细胞活力，测定酪氨酸酶活性，475nm 比色法测定黑素含量。 结果 10-7mol/L、10-6μmol/L和10-5mol/L氢化可的松对于黑素细胞及共培养细胞酪氨酸酶活性及黑素生成均有较强的剂量相关性增强作用， 10-6μmol/L和10-5mol/L氢化可的松与对照组相比有显著差异（p＜0.01）。结论 氢化可的松对于共培养体系酪氨酸酶活性及黑素生成有较强的剂量相关性增强作用。
标签： 氢化可的松 黑素细胞 角质形成细胞 共培养
【Abstract】Objective To study the effects of hydrocrtison on the tyrosinase
activity and melanogenesis in co-culture model of human melanocytes and
keratinocytes. Methods The model of co-culture of human melanocytes and
keratinocytes was cultured and MTT was used to measure the proliferation of
melanocytes and the co-cultures.The tyrosinase activity and melanin content were
measured. Results The melanin synthesis and tyrosinase activity were clearly
enhanced by hydrocrtison in a dose-dependent manner at concentrations of
维A酸对角质形成细胞增殖影响的实验研究
・９７４・ 山西医药杂志２００８年１１月第３７卷第１１期Ｓｈａｎｘｉ Ｍｅｄ Ｊ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００８，ｖ＿ｏＩ．３７，Ｎｏ．１１
维Ａ酸对角质形成细胞增殖
影响的实验研究
山西医科大学第一医院（０３ｏ００１） 任晓丽 白 莉
西安交通大学第二医院 潘敏
【摘要】 目的探讨全反式维Ａ酸对体外培养角质形成细胞增殖的影响。方法 传代培养角质形成细
胞，不同浓度维Ａ酸作用后，四甲基偶氮唑蓝（ＭｒＴ）法观察维Ａ酸对细胞增殖的影响，流式细胞仪进行细胞周期
分析。结果 １ ｔａｎｏｌ／Ｌ维Ａ酸作用后细胞增殖率高于对照组，且Ｓ期细胞数百分比增高。结论维Ａ酸对角质
形成细胞的促进增殖作用可能与Ｓ期细胞数百分比增高有关。
【关键词】细胞增殖；角质形成细胞；全反式维Ａ酸
维Ａ酸是由一组天然及合成的维生素Ａ衍生
物所组成，很久以前即被用于治疗多种皮肤疾病，
诸如痤疮、银屑病、光损伤、日光角化病等。随着
２１世纪分子靶向治疗的诞生及日渐成熟，使得传
统的细胞毒性药物的毒性显著降低，并大大增强了
靶向性，从而使维Ａ酸在皮肤科领域有着广泛的
用途及进一步开发应用的前景Ｈｌ２ Ｊ。我们对维Ａ
酸家族中具有重要活性的全反式维Ａ酸进行了实
验研究，将其作用于体外培养角质形成细胞，观察
全反式维Ａ酸的体外作用。
ｌ材料与方法
１．１材料 正常人类表皮角质形成细胞株皮肤标本取自２０岁男
性包皮。角质形成细胞无血清培养基（ＫＣ—ｓＦＭ）、达氏修
正依氏培养基（Ｄ№Ｍ）购自美国Ｇｉｂｅｏ公司，ＡＴＲＡ、碘化
丙啶（ＰＩ）、四甲基偶氮唑蓝（ＭＴＴ）均为美国Ｓｉｇｍａ公司产
品，细胞周期检测试剂盒购白晶美公司。
１．２方法
１．２．１细胞培养：正常人类表皮角质形成细胞原代培养于
ＫＣ—ＳＦＭ，添加有表皮生长因子及牛垂体浸出液及青链霉
素。培养条件为３７℃，５％ｃｏ２及１００％湿度。
１．２．２药物对细胞的增殖抑制研究：角质形成细胞传代于
原代细胞培养步骤
原代培养(primary culture)，准备工作： A玻璃用品清洁，灭局步骤：
1， 洗涤剂正常洗刷干净 2， 放入托盘中，200度烤1-2h（烘干）
3， 泡酸（过夜），吸管捆好，做好记录
4， 捞酸，冲洗干净（注意安全）
5， 放入托盘中，200度烤1-2h（烘干）
6， 包瓶，吸管用棉花塞好，报纸包好，烧杯和配液的瓶子，瓶口内层用硫酸纸，外层用牛皮纸，包好，用线系好 7， 放入托盘中，200度烤2h（灭菌）
8， 收集放好
B塑料，瓶盖，胶塞清洁处理步骤
1， 用洗涤剂正常刷洗干净 2， 晾干，放入酸中，过夜（胶塞除外）
3， 次日捞出，冲洗干净，过三水（蒸馏水，三蒸水，去离子水）
4， 放入饭盒中，高压锅，烘干箱，烘干
C器械盒（3把剪刀，2把镊子，2个烧杯，2个滤网，2个培养皿）
1， 洗涤剂冲洗干净 2， 过三水
3， 放入饭盒中压，烘干
乳鼠心肌原代培养过程： A准备工作：
1，剪封口膜（3-4个长的；鼠的只数x2+2的短封口膜） 2，器械：平镊，弯镊，剪刀（3把），筛网
3，离心管，吸管，平皿1对，50ml烧杯1个，冰袋
4，DMEM，DMEM+10%FBS 胰酶（不含EDTA—除去细胞互相粘着所依赖的Ca2+，再
经机械轻度振荡，使之成为单细胞。） B步骤 （一）准备 1，将所需的离心管放在试管架上(PS：大概一只心脏一只离心管；多准备3个--2个消化细胞
用，一个放混匀用的吸管用) 2，点燃酒精灯，依次将吸管打开，加上胶头，并标明吸何种液体，以免操作中混淆（PS：
2个吸管--胰酶和混匀用；一个移液管--移取培养液用） 3，打开试剂，将其盖，放在远离操作的空间尽量往里
4，打开器械，按顺序依次摆放（2把剪刀；一把弯镊）
5，用酒精擦试冰袋，打开平皿，并将平皿过火，将平皿放在冰袋上，在每个平皿里加入
羊毛固醇合成酶抑制剂RO对KCs细胞增殖的影响
-176 -
安徽医科大学学报 Ada Unnersitatii Medicinalii An,aut 2222 Feb
；56(2)
网络出版时间
：2022 - 12 -25 10
：51 网络出版地址：httpe://ktt. cnti. tet/kcme/detS/34. 1265. R. 22221222. 1126.002. html
羊毛固醇合成酶抑制剂RO对KCs细胞增殖的影响
刘莉,顾亚男，周宏,李名聪，罗欣,张胜权
摘要目的研究羊毛固醇合成酶抑制剂
(RO)单独或联合
胆固醇
(CH)使用对皮肤角质形成细胞
(KCs)细胞增殖及细
胞周期的影响。方法
RO不同剂量作用
KCs —定时间，采
用
MTS比色法检测
KC/细胞增殖的变化;使用一定浓度的
RO单独或联合
CH作用
KC/不同时间，使用
MTS比色法和
流式细胞仪检测记录
KC/细胞增殖和细胞周期的变化;单
独使用相同浓度
RO或联合
CH经过不同时间刺激
KC/后
通过蛋白质免疫印迹法对细胞周期蛋白
Cyc/nBl、
Cyc/nE
表达水平进行分析。结果
RO抑制
KC/细胞增殖,并呈浓
度和时间依赖性;联合使用
CH降低
RO对
KC/的增殖抑制
作用;
RO可时间依赖性增加
KCs细胞周期在
G2期比例，联
合使用
CH缓慢增加
KCs周期在
G2期比例;
RO可时间依赖
性降低细胞周期调控蛋白
Cyc/nBl、
CyclmE的表达，联合使
用
CH部分拮抗
RO下调
Cyc/nE,并具有时间效应，而
Cy-
c/nBl的表达没有受到明显的影响。结论
RO可能通过影
响
Cyc/nBl、
Cyc/nE的表达使
KC)细胞周期
G1期阻滞进而
抑制
KCs增殖。
关键词
RO
；CH
；KCs
；细胞增殖;细胞周期蛋白
中图分类号
R3
文献标志码
A 文章编号
1000-1492(ZU )02 -0176 -04
doi
： 10.19405// cnki. iss/1200 - 1492. 042).02. 002
甲羟戊酸途径是各种生命活动中关键的代谢途
人表皮角质形成细胞的体外改良培养
人表皮角质形成细胞的体外改良培养
张娓;冯若;赵飞
【期刊名称】《郑州大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2005(040)001
【摘 要】目的:探讨人表皮角质形成细胞的体外改良培养方法.方法:取皮肤标本,先用2.5 g/L胰蛋白酶4℃浸泡22 h(冷消化法),以便于表皮真皮分离;分离后刮除真皮面(真皮刮除法)以获取基底细胞;收集表皮及基底细胞并混合,制成细胞悬液进行培养.培养至第5 d,采用人工纯化法去除成纤维细胞.其他操作同人表皮细胞常规培养法.培养结束后,以台盼蓝染色法检测细胞存活率,观察细胞生长状态,并与传统培养方法相比较.实验重复3次.结果:改良组3次培养细胞存活率分别为87%,91%和95%,均高于对照组(82%,82%和85%)(P＜0.05).改良组生长速度亦较快.结论:采用人工纯化法、冷消化法和真皮刮除法等改良方法可提高体外培养的人表皮角质细胞存活率及生长速度.
【总页数】3页(P113-115)
【作 者】张娓;冯若;赵飞
【作者单位】郑州大学基础医学院组织学与胚胎学教研室,郑州,450052;郑州大学基础医学院组织学与胚胎学教研室,郑州,450052;郑州大学第一附属医院皮肤科,郑州,450052
【正文语种】中 文
【中图分类】R329 【相关文献】
1.即刻共培养法建立人表皮黑素细胞与角质形成细胞体外共培养模型的实验研究
[J], 张园园;马慧军;贾赤宇
2.人角质形成细胞的体外改良培养及生物学特征 [J], 史毓杰;曾抗;杨健;杨文林
3.人表皮黑素细胞与角质形成细胞体外共培养模型的构建 [J], 江蕾薇;陆洪光
4.人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体外模型中黑素小体转运的观察 [J], 解士海;陈志强;马鹏程;卜今;周武庆;崔盘根;高建明;李玲珺;范卫新
5.MTX对正常人表皮角质形成细胞体外培养增殖的作用及影响 [J], 张锡宝;彭振辉;曹振平
复方甘草酸苷对体外培养的角质形成细胞的作用
复方甘草酸苷对体外培养的角质形成细胞的作用
张汝芝;朱文元;马佳;金慧玲;韩洪方
【期刊名称】《中国皮肤性病学杂志》
【年(卷),期】2006(20)5
【摘 要】目的观察复方甘草酸苷（CG）对角质形成细胞表达CXCR2及分泌TGF-β1的影响.方法不同浓度CG处理人角质形成细胞株HaCat,MTT法检测CG对HaCat的增殖抑制作用,流式细胞仪分析CG处理后的HaCat细胞的CXCR2表达.培养正常人表皮角质形成细胞,观察CG处理后,培养液中TGF-β1含量的变化.结果50～200μl/ml的CG抑制HaCat细胞的增殖,干预24 h即可见到明显的抑制作用,CXCR2的表达明显低于正常对照组.正常原代角质形成细胞的培养上清中TGF-β1分泌增加.结论 50～200μl/ml CG促进素角质形成细胞表达CXCR2和TGF-β1分泌,抑制角质形成细胞的增殖.
【总页数】3页(P267-269)
【关键词】复方甘草酸苷;角质形成细胞;CXCR2;TGF-β1
【作 者】张汝芝;朱文元;马佳;金慧玲;韩洪方
【作者单位】蚌埠医学院附属医院皮肤科;南京医科大学第一附属医院皮肤科;蚌埠医学院生物化学教研室
【正文语种】中 文
【中图分类】R329.2
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5.MTX对正常人表皮角质形成细胞体外培养增殖的作用及影响 [J], 张锡宝;彭振辉;曹振平
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TLR2在红色毛癣菌感染中对角质形成细胞分泌γ-IFN和IL-8的影响
中国真菌学杂志２０１２年４月第７卷第２期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｍｙｃｏｌ，Ａｐｒｉｌ ２０１２，Ｖｏｌ ７，Ｎｏ．２ ・８５・
・论著・
ＴＬＲ２在红色毛癣菌感染中对角质形成细胞分泌
￣／－ＩＦＮ和ＩＬ一８的影响
涂盛安 张勇 陈辉 陈兴平
（１．九江学院附属医院皮肤科，九江３３２０００；２．华中科技大学同济医学院附属同济医院皮肤科，武汉
４３００３０）
【摘要】 目的观察红色毛癣菌刺激人角质形成细胞后 一ＩＦＮ及ＩＬ一８浓度的变化，以及ＴＬＲ２对 ．ＩＦＮ和ＩＬ－８分泌的影 响。方法用红色毛癣菌悬液分别刺激ＴＬＲ２抗体处理前后的角质形成细胞，采用ＥＬＩＳＡ方法检测不同时间点细胞上清液 中 一ＩＦＮ及ＩＬ一８的浓度，并设置阴性对照；比较ＴＬＲ２抗体处理前后 一ＩＦＮ及ＩＬ一８浓度的变化。结果 红色毛癣菌刺激角 质形成细胞后， 一ＩＦＮ及ＩＬ一８浓度明显升高（Ｐ＜０．０５），４ ｈ即开始，至１６ ｈ达高峰；用ＴＬＲ２抗体中和ＴＬＲ２后，上清液中 １Ｌ－８的浓度在２ ｈ、４ ｈ、８ ｈ、１６ ｈ各时间点较中和前低，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）； 一ＩＦＮ的浓度２ ｈ、４ ｈ、８ ｈ时间点较 中和前低，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），而在１６ ｈ时间点，上清液中 一ＩＦＮ的浓度与中和前比较略低，但差异没有统计 学意义（Ｐ＞０．０５）。结论红色毛癣菌刺激角质形成细胞后，可促进角质形成细胞分泌－，／一ＩＦＮ和ＩＬ一８；ＴＬＲ２在角质形成 细胞分泌３＇－ＩＦＮ和ＩＬ一８的过程中发挥重要的调节作用。 【关键词】角质形成细胞；红色毛癣菌；ＴＬＲ２； 一ＩＦＮ；ＩＬ一８ 【中图分类号】Ｒ ３７９．２ 【文献标识码】 Ａ 【文章编号】 １６７３—３８２７（２０１２）０７－００８５－０４
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＴＬＲ２ ｏｎ ＩＬ－８ ａｎｄ －ＩＦＮ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎ Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
人表皮黑素细胞的原代培养方法
人表皮黑素细胞的原代培养方法
人表皮黑素细胞是一种位于表皮层的细胞，负责生产黑色素，并影响皮肤的颜色。对于研究人类皮肤生理与病理的机制，以及开发新型美容化妆品，人表皮黑素细胞的原代培养非常重要。本文将介绍人表皮黑素细胞的原代培养方法，具体内容如下：
一、实验器材和试剂的准备
在进行人表皮黑素细胞原代培养前，需要准备一些实验器材和试剂，包括：
1.1 ml和5 ml的离心管；
2.无菌的培养皿和台式离心机；
3.口罩、手套、护目镜、移液器等安全防护用品；
4.DMEM/F-12培养基、1%青霉素/链霉素混合液、10%胎牛血清、1%乙酰化胰蛋白酶（trypsin）液。
二、人表皮黑素细胞的收集与分离
1.从健康志愿者皮肤中取一小块组织，并用1%的青霉素/链霉素混合液溶解；
2.用剪刀把组织剪成小段，并用口贴和镊子将其放入含10%胎牛血清和1%乙酰化胰蛋白酶液的培养皿中，在37℃的恒温下孵化大约2小时，使细胞进行消化；
3.在消化完成后，离心5 min，将5 ml血清补充的DMEM/F-12培养基加入离心管中。液体呈沉淀状，将其放入台式离心机里，用2000 rpm的速度旋转5 min，将上清液抛去；
4.再次加入培养基，将其盖满淀粉样细胞沉淀，稍加搅拌，将液体小心地移入其它离心管中。
三、人表皮黑素细胞的培养与传代
1.将分离后的细胞移入无菌的培养皿中，加入10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素混合液的DMEM/F-12培养基，放入37℃恒温培养箱内，进行孵化； 2.观察细胞的生长情况，当细胞数量逐渐增多，且已贴壁生长4－5天后，进行第一次传代；
3.移除培养皿中的培养基，用去菌液或PBS洗涤一遍细胞，并加入0.05%的trypsin，放在37℃下孵化2-3分钟，使细胞充分分离；
4.加入等量的终止胰酶的胎牛血清，离心5分钟；
5.移除上清液，并加入培养基，旋转5分钟，将上清液抛去；
6.在第三－五代时，再次均分，放入无菌的培养皿中，加入10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素混合液的DMEM/F-12培养基进行培养。